2. 中国农业大学动物医学院, 北京 100193;
3. 北京昌平区中西医结合医院, 北京 102208;
4. 洛阳市畜禽分子病原与免疫学重点实验室, 洛阳 471003
, CHEN Yaoxing2, CHEN Funing3, WANG Zixu2, CAO Jing2, DONG Yulan2, LIU Yang1, WANG Xingde1, WANG Yang1,4
2. College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193, China;
3. Changping Hospital of Integrated Chinese and Western Medicine, Beijing 102208, China;
4. Key Laboratory of Molecular Pathogen and Immunology of Animal of Luoyang, Luoyang 471003, China
环境雌激素是一大类干扰多种雄性动物机体，尤其是生殖器官氧化和抗氧化平衡的外源物质[1-2]，因其数量巨大和影响严重而日益受到广泛关注。研究证实环境雌激素通过抑制抗氧化酶活性，降低血浆睾酮水平，造成生殖细胞凋亡剧增，抑制增殖，降低精子质量，损害雄性生殖系统[1, 3]。其中，炔雌醚是一种经典的脂溶性、长效合成雌激素，现广泛用于女性口服避孕药、啮齿动物不育剂、乳腺癌和前列腺癌的治疗[4-7]。炔雌醚主要通过医疗、卫生污水及粪便等途径进入环境，已经成为最重要的环境雌激素之一[8]。由于炔雌醚在环境中的广泛性和持久性，人们越来越关注对这类化合物的毒理作用。炔雌醚升高动物机体活性氧(reactive oxygen species, ROS)含量，抑制抗氧化酶活性，诱导氧化应激[3, 9]。Geng等[10]发现炔雌醚增加鲫鱼的丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量并诱导氧化应激。因此，过多的自由基和氧化应激造成的细胞损伤是炔雌醚的生殖毒性机制之一。研究证实炔雌醚能够干扰啮齿类动物促性腺激素释放激素(GnRH)、促卵泡激素(FSH)、促黄体素激素(LH)和睾酮(T)的分泌[3, 11]。疏肝益阳胶囊由蒺藜、柴胡、蜂房、地龙、水蛭、九香虫、紫梢花、蛇床子、远志、肉苁蓉、笺丝子、五味子、巴救天、蜈蚣及石菖蒲的提取物组成，具有疏肝解郁，活血补肾，防治阳痿等功效。研究发现疏肝益阳胶囊能够提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性、减少MDA含量，从而增强阴茎海绵体组织的抗氧化功能[12]。王琦等[13]发现疏肝益阳胶囊增加了勃起功能障碍患者的睾丸、前列腺和精囊的质量，并升高血清睾酮水平；同时，性欲、射精功能和抗疲劳能力均有所改善。王济等[14]证实疏肝益阳胶囊显著改善动脉性勃起功能障碍(arteriogenic erectile dysfunction, AED)，并增加睾丸和副性腺的质量。前期研究发现疏肝益阳胶囊显著提高大鼠睾丸组织抗氧化酶活性；但是，疏肝益阳胶囊能否缓解炔雌醚造成的生殖毒理作用仍有待于研究，旨在揭示疏肝益阳胶囊在改善外源性雌激素引起的雄性动物生殖功能损伤的作用及机制，为提高雄性动物的繁殖性能提高理论依据和实践基础。
1 材料与方法 1.1 实验动物处理20只8周龄雄性SD(sprague dawley, SD)大鼠(260±20 g)购自河南省实验动物中心(郑州，河南，中国)。饲喂在聚碳酸酯笼里，每笼5只，用木屑做垫料。动物房温度(25±1)℃，相对湿度40%~55%，光照制度为光照12 h、黑暗12 h。自由饮水和采食标准鼠粮。适应性饲养一周后，动物被随机分为4组，每组5只。对照组：0.1 mL生理盐水+0.1 mL橄榄油；疏肝益阳胶囊组：100 mg·kg-1疏肝益阳胶囊；炔雌醚组：0.1 mg·kg-1炔雌醚；炔雌醚+疏肝益阳胶囊组：0.1 mg·kg-1炔雌醚+100 mg·kg-1疏肝益阳胶囊。炔雌醚溶于橄榄油；疏肝益阳胶囊溶于生理盐水; 采用灌胃方式处理，每天1次，连续2周(根据预试验确定剂量和试验周期)。所有动物程序和实验方案均按照中国农业大学动物护理和使用委员会批准的动物实验指南进行。
1.2 样品处理及部分指标检测试验结束24 h后，采用乙醚麻醉处死动物(20 mg·kg-1)，心脏穿刺取血，3 000 r·min-1离心15 min，分离血浆；冻存于-80 ℃，备用于睾酮含量检测。立即分离睾丸、附睾、精囊腺和前列腺并称重。取一侧生殖器官固定于4%多聚甲醛，制作5 μm厚的切片，备用于苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining, HE染色)、免疫组织化学染色和转移酶介导的三磷酸脱氧鸟苷-生物素刻痕末端标记(transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick end labeling, Tunel)检测。生精小管面积、生精小管直径、生精上皮高度采用Scion Image软件4.03测量100个生精小管进行统计。生精细胞比例通过统计1 000个生精细胞中的精原细胞(spermatogonial cell, sg)、精母细胞(spermatocyte, sc)和精子细胞(spermatid, st)的个数，计算三者所占的比例。取一侧睾丸，于冰生理盐水中匀浆后，4 ℃ 3 500 r·min-1离心10 min。取上清液，用于检测抗氧化酶活性和脂质过氧化物含量。将每只鼠的附睾尾置于37 ℃的生理盐水，放入1.5 mL离心管，用眼科剪剪碎，使精子(sperm, sp)游离出来。用细胞计数板进行精子计数(106·mL-1)。精子抹片用Giemsa染色后，在光镜下观察每只大鼠200个精子的形态，统计精子数，计算精子畸形率。
1.3 抗氧化酶活性活性检测SOD、GSH-Px、T-AOC和MDA活性检测采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒(购自中国安迪生物技术有限公司)，灵敏度分别为0.1 μmol·L-1、0.1 U·mL-1、0.1 nmol·mL-1和1 U·L-1。批内变异CVw＜15%，批间变异CVb＜15%。
1.4 睾酮检测血浆睾酮含量检测采用酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(购自中国安迪生物技术有限公司)。睾酮最小检出限为1.0 pg·mL-1。标准曲线相关系数为R2=0.991 4。批内变异CVw＜15%，批间变异CVb＜15%。
1.5 PCNA与Tunel分析脱蜡的组织切片置于柠檬酸盐缓冲液中(pH 7)，在微波炉中孵育10 min修复抗原后，用增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)小鼠抗人单克隆抗体在37 ℃下孵育2 min，用荧光二抗在25 ℃避光孵育50 min。用0.01 mol·L-1 PBS洗3次后，在25 ℃与4', 6-二脒基-2-苯基吲哚(4', 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)反应10 min。PCNA表达在细胞核，显示为红色。Tunel染色步骤参照(罗氏应用科学)试剂盒说明书。脱蜡的组织切片在30 ℃用蛋白酶K(20 μg·mL-1)孵育10 min，然后用0.01 mol·L-1 PBS洗3次。之后组织切片在25 ℃用Tunel反应复合物孵育10 min，然后用0.01 mol·L-1 PBS洗3次。切片用转化剂-POD(converter-POD)在37 ℃孵育30 min。Tunel表达在细胞核，显示为绿色。每组统计5只大鼠的睾丸切片PCNA与Tunel阳性细胞数，每只鼠统计1 000个生精细胞中的阳性细胞数。
1.6 数据统计数据均以“x±s”表示，采用SPSS18软件包进行单因素方差分析(One Way ANOVA)，P＜0.01为差异极显著。
2 结果 2.1 体重与生殖器官质量各组动物在炔雌醚和/或疏肝益阳胶囊处理后体重无明显变化(P＞0.05，表 1)。与对照组相比，炔雌醚组睾丸、附睾、精囊腺和前列腺的质量、睾丸的长轴和短轴极显著下降(P＜0.01); 表 1，图 1 C、G、K。炔雌醚+疏肝益阳胶囊组极显著缓解了炔雌醚对生殖器官质量的影响(P＜0.01，表 1，图 1 D、H、L)。
|
表 1 炔雌醚与疏肝益阳胶囊对体重、生殖器官质量与睾丸大小的影响(x±s) Table 1 Effects of QES and SGYY on body weight, absolute reproductive organ weight and size of testis in rats (x±s) |
|
图 1 炔雌醚与疏肝益阳胶囊对成年大鼠睾丸、附睾、精囊腺与前列腺的影响(标尺=1 cm) Figure 1 Morphological changes in the testis, epididymis, seminal vesicle and prostate of adult male rats treated with QES and SGYY (Scale bar=1 cm) |
与对照组相比，炔雌醚组和炔雌醚+疏肝益阳胶囊组的精子数量均极显著下降(P＜0.01)；精子畸形率极显著升高(P＜0.01)，畸形精子包括断尾、无尾、尾部弯折、无头及头部溶解等(图 2，表 2)。与炔雌醚组相比，炔雌醚+疏肝益阳胶囊组极显著增加了大鼠精子数量，并降低了精子畸形率(P＜0.01)。与对照组相比，疏肝益阳胶囊组精子质量有所提高，但无明显差异。
|
A、B.正常形态的精子呈直形，包括头、颈和尾三部分；C.畸形精子，包括1(断尾)、2(无尾)、3(尾部弯折)、4(无头)、5(头部溶解)；D.畸形精子包括1(无尾)、2(尾部弯折)。标尺= 50 μm A, B. The normal shape of sperm is straight, including three parts: head, neck and tail; C. The abnormal spermatozoa included 1 (fragmentary tail), 2 (tailless), 3 (tail bending), 4 (headless) and 5 (head dissolving); D. The abnormal spermatozoa include 1 (tailless) and 2 (tail bending). Scale bar =50 μm 图 2 炔雌醚与疏肝益阳胶囊对成年大鼠精子畸形率的影响 Figure 2 Sperm deformity rate in adult rats treated with QES and SGYY |
|
|
表 2 炔雌醚与疏肝益阳胶囊对精液质量、生精细胞数量、增殖与凋亡的影响(x±s) Table 2 Semen quality, number of spermatogenic cell, proliferation, apoptosis of QES and SGYY treated rats(x±s) |
对照组(图 3A)和疏肝益阳胶囊组(图 3E)大鼠睾丸组织结构良好，生精小管呈圆形，充满发育正常的各级生精细胞。炔雌醚组睾丸生精小管的面积、直径和生精上皮高度极显著下降(P＜0.01, 表 3)；生精细胞形态皱缩、数量下降、间质组织(interstitial tissue, it)减少(图 3I)；另外，精原细胞、精母细胞和精子细胞的比例也受到影响。疏肝益阳胶囊一定程度恢复了炔雌醚对睾丸组织结构造成的损伤(图 3M，表 3)。
|
sg.精原细胞；sc.精母细胞；st.精子细胞；sp.精子；it.间质；vs.空泡；re.皱褶；标尺= 100 μm sg. Spermatogonial cell; sc. Spermatocyte; st. Spermatid; sp. Sperm; it. Mesenchyme; vs. Vacuoles; re. Shrinkage; Scale bar = 100 μm 图 3 炔雌醚与疏肝益阳胶囊对成年大鼠睾丸、附睾、精囊腺与前列腺组织的影响 Figure 3 Histological changes in the testis and seminiferous tubulars (STs) of testis, cauda epididymidis, seminal vesicle and prostate in adult rat treated with QES and SGYY |
|
|
表 3 炔雌醚与疏肝益阳胶囊对生精小管指标与生精细胞比例的影响(x±s) Table 3 Effects of QES and SGYY on seminiferous tubular indices and percentage of germ cells in rat (x±s) |
对照组(图 3B)和疏肝益阳胶囊组(图 3F)大鼠附睾组织连接紧密，附睾管上皮部分细胞结构正常，充实而均匀；管腔内分布有大量精子。而炔雌醚组附睾管显著萎缩，部分上皮细胞皱缩(shrinkage, re)，呈空泡(vacuoles, vs)状，管腔内精子数量较少，附睾管间质明显减少(图 3J)。对照组(图 3C、D)和疏肝益阳胶囊组(图 3G、H)大鼠精囊腺和前列腺的组织结构正常，充满内分泌物。炔雌醚造成精囊腺和前列腺腺管显著萎缩，腺泡上皮部分细胞出现空泡、细胞核皱缩现象，染色加深，上皮形成大量皱褶(reductus, rs)，间质减少，内分泌物缺失(图 3K、L)。疏肝益阳胶囊一定程度恢复了炔雌醚对附睾、精囊腺和前列腺组织结构造成的损伤(图 3N、P，表 3)。
2.4 抗氧化酶活性与对照组相比，炔雌醚组大鼠睾丸组织SOD、GSH-Px和T-AOC活性极显著下降，MDA含量极显著升高(P＜0.01)。疏肝益阳胶囊一定程度恢复了炔雌醚对大鼠睾丸组织抗氧化指标造成的影响。疏肝益阳胶囊组抗氧化功能与对照组相比，有一定程度的改善，但无统计学差异(表 4)。
|
|
表 4 炔雌醚与疏肝益阳胶囊对氧化、抗氧化指标与睾酮含量的影响(x±s) Table 4 Effects of QES and SGYY on oxidant, antioxidant indices and plasma testosterone content (x±s) |
与对照组相比，炔雌醚组大鼠血浆睾酮含量下降了51.29%(表 4)。与炔雌醚组相比，疏肝益阳胶囊+炔雌醚组血浆睾酮含量极显著升高(P＜0.01)。疏肝益阳胶囊组与对照组相比，大鼠血浆睾酮含量呈升高趋势，差异不显著(表 4)。
2.6 睾丸生精细胞PCNA与Tunel表达与对照组相比，炔雌醚组大鼠睾丸PCNA阳性生精细胞数量下降了43.06%(表 2和图 4C)。与炔雌醚组相比，疏肝益阳胶囊+炔雌醚组大鼠睾丸PCNA阳性生精细胞数量极显著增加(P＜0.01)，促进了生精细胞增殖(表 2和图 4D)。炔雌醚造成了大鼠睾丸生精细胞Tunel表达量极显著升高(P＜0.01，表 2和图 4G)；疏肝益阳胶囊减轻了炔雌醚诱导的生精细胞凋亡(表 2和图 4H)。与对照组相比，疏肝益阳胶囊组大鼠睾丸生精细胞PCNA与Tunel表达没有显著的差异。
|
图 4 炔雌醚与疏肝益阳胶囊对成年大鼠生精细胞PCNA与Tunel表达的影响(标尺= 100 μm) Figure 4 Expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and Tunel in germ cells in adult rats treated with QES and SGYY (Scale bar=100 μm) |
连续2周炔雌醚处理造成成年大鼠睾丸氧化应激、生殖器官质量下降、组织结构紊乱，生精小管的面积、直径和生精上皮高度显著下降，生精细胞数量减少，睾酮激素分泌减少及精子质量下降，这与之前的研究结果——炔雌醚阻碍精子发生、睾丸发育和降低精子质量一致[6, 9]。PCNA阳性生精细胞数量减少和Tunel阳性生精细胞数量增加说明增殖细胞减少和凋亡细胞增加，证实了精子数量的减少。睾酮是一种由睾丸间质细胞合成和分泌的、调节雄性动物精子发生的重要激素[15]。炔雌醚造成的睾酮含量下降及其导致生精细胞数量下降、生殖器官质量降低可能归因于睾酮的合成不足。Ahmed等[16]研究发现睾酮含量下降导致睾丸生精细胞Caspase-3表达升高，并造成细胞凋亡增加。因此，本研究认为炔雌醚通过抑制睾酮分泌、诱导凋亡造成生殖器官萎缩，并破坏精子质量。过度的活性氧蓄积会造成氧化应激，而雄性动物生殖系统对氧化应激非常敏感。研究证实氧化应激干扰精子发生、降低精子质量和生育能力[17-18]。本研究发现炔雌醚导致大鼠睾丸组织SOD、GSH-Px和T-AOC活性显著下降，MDA含量显著升高。氧化应激可能是由抗氧化酶活性降低、自由基增加导致抗氧化系统平衡受到破坏造成的。因此，氧化应激可能是炔雌醚造成大鼠生殖损伤的原因之一。
疏肝益阳胶囊是一种中药组方，对勃起功能障碍症具有良好的治疗效果[13-14]。SGYY通过改善性交频率、性生活满意度和血清睾酮改善睾酮降低引起的勃起功能障碍[19]。本研究结果证实疏肝益阳胶囊处理2周在一定程度上改善了炔雌醚对成年雄性大鼠造成的生殖损伤；显著增加了生殖器官的质量，生精小管的面积、直径、生精上皮的高度、生精细胞的数量及PCNA表达细胞数量，并显著降低Tunel表达细胞数量。另外，疏肝益阳胶囊显著提高了大鼠的精子质量，增加精子数量，并降低精子畸形率。疏肝益阳胶囊升高缓解了炔雌醚造成的氧化应激，升高SOD、GSH-Px和T-AOC活性，减少了MDA含量。而且，疏肝益阳胶囊增加了炔雌醚组血浆睾酮含量和PCNA阳性生精细胞数量，并减少Tunel阳性生精细胞数量。张会波等[20]研究发现疏肝益阳胶囊治疗糖尿病男性性功能障碍时，有效升高睾酮含量，降低雌二醇含量，并改善性功能。谭文举等[21]证实疏肝益阳胶囊缩短精液液化时间、升高精浆前列腺特异性抗原、酸性磷酸酶含量，从而改善精子活动率、前向运动精子比率及妊娠率。因此，本研究证实疏肝益阳胶囊可能通过改善抗氧化功能和激素分泌，促进生精细胞增殖，并减少细胞凋亡等途径改善精子发生和精子质量，发挥生殖功能保护作用。
4 结论疏肝益阳胶囊有效升高抗氧化酶活性、促进睾酮分泌、促进生精细胞增殖、抑制细胞凋亡、改善生殖器官发育，并提高精子质量，对炔雌醚造成的大鼠生殖功能损伤具有一定的调节作用，其深层次作用仍有待于进一步深入研究。
| [1] | KNEZ J. Endocrine-disrupting chemicals and male reproductive health[J]. Reprod BioMed Online, 2013, 26(5): 440–448. DOI: 10.1016/j.rbmo.2013.02.005 |
| [2] | LEWIN A, ARBUCKLE T E, FISHER M, et al. Univariate predictors of maternal concentrations of environmental chemicals:the MIREC study[J]. Int J Hyg Environ Health, 2017, 220(2): 77–85. DOI: 10.1016/j.ijheh.2017.01.001 |
| [3] | LI J, WANG H W, ZHANG J L, et al. Abnormal secretion of reproductive hormones and antioxidant status involved in quinestrol-induced reproductive toxicity in adult male rat[J]. Tissue Cell, 2014, 46(1): 27–32. |
| [4] | SINGH J N, JEHAN Q, SETTY B S, et al. Effect of some steroids on spermatogenesis & fertility of rats[J]. Indian J Exp Biol, 1971, 9(2): 132–137. |
| [5] | DIPASQUALE G, WELA P, NEMITH P. Comparison of the prolonged estrogenic and anti-fertility properties of quinestrol and four analogues[J]. Steroids Lipids Res, 1974, 5(1): 57–64. |
| [6] | ZHAO M R, LIU M, LI D, et al. Anti-fertility effect of levonorgestrel and quinestrol in Brandt's voles (Lasiopodomys brandtii)[J]. Integr Zool, 2007, 2(4): 260–268. DOI: 10.1111/j.1749-4877.2007.00059.x |
| [7] | LV X H, GUO Y, SHI D. Effects of quinestrol on reproductive hormone expression, secretion, and receptor levels in female Mongolian gerbils (Meriones unguiculatus)[J]. Theriogenology, 2012, 77(6): 1223–1231. DOI: 10.1016/j.theriogenology.2011.10.030 |
| [8] | WU M H, LI J L, HE X X, et al. Radiation removal of synthetic estrogens in aqueous solution:influence of reduction or oxidation system and toxicity test[J]. Nucl Sci Tech, 2016, 27(1): 22. |
| [9] | SHEN W, SHI D Z, WANG D, et al. Inhibitive effects of quinestrol on male testes in Mongolian gerbils (Meriones unguiculatus)[J]. Res Vet Sci, 2012, 93(2): 907–913. DOI: 10.1016/j.rvsc.2011.10.010 |
| [10] | GENG Q Q, LI P L, ZHANG W B, et al. The bioaccumulation and biotransformation of synthetic estrogen quinestrol in crucian carp[J]. Aquat Toxicol, 2014, 155: 84–90. DOI: 10.1016/j.aquatox.2014.06.011 |
| [11] | CHEN Y, SU Q Q, LIU Q S. Effects of quinestrol on the vocal behavior of mice during courtship interactions[J]. Physiol Behav, 2017, 173: 216–222. DOI: 10.1016/j.physbeh.2017.02.017 |
| [12] |
陆海旺, 林思伟, 王杰, 等. 劲男春颗粒对老龄大鼠阴茎海绵体组织氧化应激损伤的保护作用[J]. 中医药导报, 2016, 22(14): 24–26.
LU H W, LIN S W, WANG J, et al. Protective effects of Jinnanchun granules on oxidative stress in cavernous tissue of aged rats[J]. Guiding Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy, 2016, 22(14): 24–26. (in Chinese) |
| [13] |
王琦, 倪平, 吴卫平, 等. 疏肝益阳胶囊治疗勃起功能障碍的作用机理研究[J]. 中国中药杂志, 2005, 30(1): 58–63.
WANG Q, NI P, WU W P, et al. Study of Shugan Yiyang capsule on erectile dysfunction[J]. China Journal of Chinese Materia Medica, 2005, 30(1): 58–63. DOI: 10.3321/j.issn:1001-5302.2005.01.018 (in Chinese) |
| [14] |
王济, 白明华, 刘保兴, 等. 疏肝益阳胶囊对动脉性勃起功能障碍大鼠性功能及性腺质量的作用[J]. 安徽中医学院学报, 2013, 32(2): 54–57.
WANG J, BAI M H, LIU B X, et al. Effect of Shugan Yiyang capsules on sexual function and sex gland weight in rats with arteriogenic erectile dysfunction[J]. Journal of Anhui Traditional Chinese Medical College, 2013, 32(2): 54–57. DOI: 10.3969/j.issn.1000-2219.2013.02.017 (in Chinese) |
| [15] | ZHANG Y H, SONG M Y, RUI X L, et al. Supplemental dietary phytosterin protects against 4-nitrophenol-induced oxidative stress and apoptosis in rat testes[J]. Toxicol Rep, 2015, 2: 664–676. DOI: 10.1016/j.toxrep.2015.04.007 |
| [16] | AHMED E, NAGAOKA K, FAYEZ M, et al. Suppressive effects of long-term exposure to P-nitrophenol on gonadal development, hormonal profile with disruption of tissue integrity, and activation of caspase-3 in male Japanese quail (Coturnix japonica)[J]. Environ Sci Pollut Res, 2015, 22(14): 10930–10942. DOI: 10.1007/s11356-015-4245-9 |
| [17] | ABDELBAKI S A, SABRY J H, AL-ADL A M, et al. The impact of coexisting sperm DNA fragmentation and seminal oxidative stress on the outcome of varicocelectomy in infertile patients:a prospective controlled study[J]. Arab J Urol, 2017, 15(2): 131–139. DOI: 10.1016/j.aju.2017.03.002 |
| [18] | KOPALLI S R, CHA K M, JEONG M S, et al. Pectinase-treated Panax ginseng ameliorates hydrogen peroxide-induced oxidative stress in GC-2 sperm cells and modulates testicular gene expression in aged rats[J]. J Ginseng Res, 2016, 40(2): 185–195. DOI: 10.1016/j.jgr.2015.08.005 |
| [19] |
莫秋柏, 乔飞. 疏肝益阳胶囊治疗低睾酮血症所致ED的临床效果观察[J]. 临床合理用药杂志, 2016, 9(7): 88–89.
MO Q B, QIAO F. Clinical observation of Shugan Yiyang capsule in the treatment of ED caused by low testosterone[J]. Chinese Journal of Clinical Rational Drug Use, 2016, 9(7): 88–89. (in Chinese) |
| [20] |
张会波, 尤建军, 杜宏宏, 等. 疏肝益阳胶囊联合万艾可对糖尿病男性性功能障碍患者血清睾酮、雌二醇水平及性功能的影响[J]. 现代生物医学进展, 2017, 17(28): 5512–5515.
ZHANG H B, YOU J J, DU H H, et al. Effect of Shugan Yiyang capsule combined with viagra on serum testosterone and estradiol levels and sexual function of male diabetic patients with sexual dysfunction[J]. Progress in Modern Biomedicine, 2017, 17(28): 5512–5515. (in Chinese) |
| [21] |
谭文举, 韩雯雯, 闫良. 疏肝益阳胶囊治疗精液液化异常的临床观察[J]. 中成药, 2018, 40(5): 1227–1230.
TAN W J, HAN W W, YAN L. Clinical observation on treatment of abnormal semen liquefaction by Shugan Yiyang capsule[J]. Chinese Traditional Patent Medicine, 2018, 40(5): 1227–1230. DOI: 10.3969/j.issn.1001-1528.2018.05.051 (in Chinese) |