马立克病(Marek's disease，MD)是严重危害养禽业的一种淋巴组织增生性肿瘤性疾病，其病原为血清Ⅰ型马立克病毒(Marek's disease virus，MDV)。MD在世界范围内广泛存在，对家禽业造成巨大的经济损失。热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)，又称为应激蛋白(stress protein)，是一类当细胞受到冷热[1]、病原体[2]、运输[3-5]等应激原的刺激时，转录、表达水平发生急剧变化的蛋白质的总称，广泛存在于各生物体内。根据相对分子质量大小，HSPs可分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、HSP27等多个家族，每个家族又有多个成员组成。近年来研究发现，当发生肿瘤时，多种HSPs的表达量也发生显著变化，且干扰多种化学药物治疗肿瘤的效果，与肿瘤的发展、转移及转归密切相关[6-8]。HSP90的表达量在多种实体肿瘤组织内急剧升高[9-10]，HSP90的下游客户蛋白(client protein)包含了细胞凋亡信号通路中AKT、STAT3、MAPK等多种蛋白，对肿瘤细胞的凋亡发挥重要作用。通过HSP90抑制剂或RNA干扰技术，抑制HSP90表达，能够有效提高肿瘤细胞的凋亡，提升化学药物治疗效果，HSP90抑制剂辅助治疗肿瘤的效果已经在多种肿瘤临床治疗中得到证实[11-12]。
本研究把以上思路运用于MD导致肿瘤的研究中，通过人工感染MDV建立MD肿瘤模型，检测肿瘤发生发展过程中HSPs组织细胞内定位、HSPs转录表达水平动态变化及肝的病理组织学损伤，探讨其相关性，为进一步研究各HSPs在肿瘤发生、发展中的生物学作用及肿瘤新型治疗药物的研发提供新思路、新方法，同时对人类肿瘤疾病的研究也具有重要的借鉴意义。
1 材料与方法 1.1 实验动物140只1日龄SPF雏鸡，由青岛易邦生物制品有限公司提供。随机分为空白对照组(30只)、疫苗免疫对照组(30只)和感染组(80只)，隔离饲养，自由采食和饮水。
1.2 毒株和试剂毒株(MDV-RB1B)，由山东农业大学崔治中教授惠赠；单克隆抗体(HSP27、HSP60、HSP70、HSP90)、HRP标记羊抗鼠IgG，均购自加拿大Stressgen生物技术公司；鸡HSP90检测试剂盒、鸡HSP70检测试剂盒，均购自河南CUSABIO生物制品公司。鸡马立克病火鸡疱疹病毒活疫苗(FC-126株)，购自乾元浩生物股份有限公司。
1.3 病毒感染及样品采集1日龄，将感染组、疫苗免疫对照组、空白对照组鸡分别颈部皮下注射MDV毒液(约1 200 PFU)、MD疫苗、生理盐水。每日观察记录鸡群临床症状和死亡情况。于7、14、21、28、35、42、86日龄分批剖杀，每批剖杀感染组鸡10只，其余两组各3只。记录各组试验鸡病理剖检变化并每只鸡采集肝组织样品3份。一份利用中性福尔马林固定，用于组织学及免疫组织化学方法检测；另两份经液氮速冻5 h后，保存于-80 ℃冰柜，用于荧光定量RT-PCR及ELISA方法检测(根据病理组织学观察，感染组每批剖杀选取3只检测)。
1.4 病理组织学检测常规制作石蜡切片，HE染色，光镜下观察并拍照。
1.5 免疫组织化学检测参照文献方法进行免疫组化检测[13]，稍作修改。HSP90、HSP70、HSP60和HSP27的单克隆抗体使用浓度分别为1: 80、1: 75、1: 50和1: 45稀释，利用PBS代替一抗作为阴性对照。在阴性对照染色正常的情况下，组织切片内出现棕红色颗粒为阳性信号。
1.6 荧光定量RT-PCR检测根据文献资料，合成HSP90[14]、HSP70[15]及GAPDH[15]的特异引物，各引物信息见表 1。根据参考文献[13-15]，检测试验鸡肝内HSP90、HSP70 mRNA转录水平的动态变化。
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表 1 引物序列及产物长度 Table 1 The primers sequences and PCR product length |
按照鸡HSP90检测试剂盒、鸡HSP70检测试剂盒说明书进行操作检测。
1.8 统计分析利用SPSS 22软件对数据进行单因素ANOVA检验分析。
2 结果 2.1 试验模型建立感染组，在14日龄后陆续发病，鸡群采食量低于空白对照组和疫苗免疫对照组，鸡表现出精神沉郁、鸡冠发白、羽毛凌乱、扎堆、消瘦等症状，于16、22、37、53、80日龄各死亡1只；14日龄时，剖检可见肝组织肿大，个别鸡肝表面出现灰白色结节，21日龄后肝表面灰白色结节明显，肝脆性增加，手捻可感颗粒状。感染组鸡，于7、14、21、28、35、42、86日龄剖检时，分别有0、4、8、7、8、9、9只鸡肝表现明显的肿大和肿瘤结节，21日龄后，肿瘤发生率高于70%；整个试验周期内，空白对照组、疫苗免疫对照组未见异常临床症状及剖检病理变化，鸡未死亡。根据临床症状及剖检病理变化，可初步判断已成功建立鸡马立克病肿瘤模型，取肝组织，进行下一步检测。
2.2 肝组织病理学变化在整个试验周期内，空白对照组和疫苗免疫对照组鸡肝组织均未见明显的病理学变化(图 1A、B)。14日龄时，感染组鸡肝组织内可见局灶性肿瘤细胞结节(→)，肿瘤细胞结节周边的肝细胞发生变性、坏死，肝细胞索排列紊乱(↓)(图 1C)；28日龄后，感染组鸡肝组织内可见大量的多形态淋巴肿瘤细胞浸润性、弥散性生长，肝组织正常结构被破坏，局部肝组织被肿瘤组织取代(→)，肿瘤组织周边肝细胞变性坏死明显(↓)(图 1D)。
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A.空白对照组肝组织(HE)；B.疫苗免疫对照组肝组织(HE)；C.感染组14日龄肝组织肿瘤细胞局灶性生长(→)，周边的肝细胞发生变性、坏死，肝细胞索排列紊乱(↓)(HE)；D.感染组28日龄后，肝组织肿瘤细胞弥散性生长(→)，肿瘤组织周边肝细胞变性坏死明显(↓)(HE)；E. HSP27在肿瘤组织周边肝细胞细胞质中强表达(→)(IHC)；F. HSP70在肿瘤组织周边肝细胞的细胞质内强表达(→)，肿瘤细胞内未见明显表达(IHC)；G. HSP90在肿瘤细胞的细胞质中强表达(→)，肝细胞内弱表达(IHC)；H. HSP60在肿瘤细胞的细胞质中强表达(→)，肝细胞内弱表达(IHC)；I.阴性对照(IHC) A. Liver of blank control group (HE); B. Liver of vaccinated control group (HE); C. Focal tumor focus (→) in liver tissue of infected group when 14-day-old, peripheral hepatocytes degenerated and necrotized, and hepatic cord arranged disorderly (↓) (HE); D. Diffuse tumor focus (→) in liver tissue of infected group after 28-day-old, the degeneration and necrosis of hepatocytes around the tumor tissue were obvious (↓) (HE); E. HSP27 expressed preferentially in the cytoplasm of hepatocyte (→) around tumor tissue (IHC); F. HSP70 expressed preferentially in the cytoplasm of hepatocyte(→) around tumor tissue (IHC); G. HSP90 expressed preferentially in the cytoplasm of tumor cell (→) (IHC); H. HSP60 expressed preferentially in the cytoplasm (→) of tumor cell (IHC); I. Negative control of liver (IHC) 图 1 肝病理组织学及免疫组织化学检测 Figure 1 Liver tissues detected by histopathology and immunohistochemistry assay |
HSP27和HSP70在组织细胞内定位基本一致，在临近肿瘤组织的肝细胞细胞质中强表达(→)，而在肿瘤细胞及远离肿瘤组织的肝细胞中表达不明显(图 1E、F)；HSP90和HSP60在组织细胞内定位基本一致，在肿瘤组织及散在的肿瘤细胞细胞质内强表达(→)，而在肿瘤组织周边的肝细胞内弱表达(图 1G、H)；阴性对照未见阳性信号(图 1I)。
2.4 HSPs mRNA转录水平根据文献方法进行操作[13-15]。HSP90标准曲线方程为Y=-3.312X+48.469，一致系数为0.992；HSP70标准曲线方程为Y=-3.417X+39.554，一致系数为0.981；GAPDH标准曲线方程为Y=-3.336X+52.371，一致系数为0.987。3条标准曲线的斜率及一致系数都接近理想值，荧光曲线能够准确地反映反应管中目的产物的扩增，可用于HSPs mRNA转录水平的检测。
与空白对照组和疫苗免疫对照组相比，感染组鸡各日龄HSP70 mRNA转录水平皆极显著升高(P＜0.01)，且表现出前期升高，后期有所恢复的趋势，于21日龄时，HSP70 mRNA转录水平达到最高值；7日龄时，疫苗免疫对照组HSP70 mRNA转录水平极显著高于空白对照组(P＜0.01)，其余日龄两组差异不显著(表 2)。感染组鸡只HSP90 mRNA的转录水平持续升高，与空白对照组和疫苗免疫对照组相比，皆差异极显著(P＜0.01)；7日龄时，疫苗免疫对照组HSP90 mRNA转录水平显著高于空白对照组(P＜0.05)，其余日龄两组差异不显著(表 2)。
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表 2 感染组鸡肝中HSPs mRNA转录水平的动态变化(x±s) Table 2 Dynamic changes of HSPs mRNA transcriptional level in liver of MDV infected group (x±s) |
感染组HSP70的表达量表现出前期升高，后期有所恢复的趋势，21日龄达到最高水平；与空白对照组相比，感染组HSP70的表达量14和21日龄时极显著升高(P＜0.01)，28和35日龄时显著升高(P＜0.05)，其余日龄差异不显著。与疫苗免疫对照组相比，感染组HSP70的表达量21日龄时极显著升高(P＜0.01)，14和35日龄显著升高(P＜0.05)，其余日龄差异不显著；整个试验周期内，疫苗免疫对照组与空白对照组相比，差异不显著(表 3)。感染组HSP90的表达量持续升高，86日龄时达到最高水平；各日龄感染组HSP90的表达水平极显著高于空白对照组(P＜0.01)，14日龄后极显著高于疫苗免疫对照组(P＜0.01)；7日龄时，疫苗免疫对照组HSP90的表达量显著高于空白对照组(P＜0.05)，其余日龄差异不显著(表 3)。
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表 3 感染组鸡肝中HSPs表达量的动态变化(x±s) Table 3 Dynamic changes of HSPs expression quantity in liver of MDV infected group (x±s) |
感染组鸡14日龄后开始出现精神沉郁、采食量下降、消瘦等临床症状及零星死亡；剖检可见肝组织肿大，肝表面出现灰白色结节；组织学观察可见肿瘤细胞局灶性生长，随着日龄增加，肿瘤细胞浸润性、弥散性生长，肝组织结构破坏。21日龄后，感染组鸡肿瘤发生率高于70%。疫苗免疫对照组及空白对照组鸡临床症状、病理剖检及组织学观察皆未见异常。证明本试验已成功建立鸡马立克病内脏肿瘤模型。
免疫组织化学结果显示，在MDV引发肿瘤的发生发展过程中，不同HSPs之间组织细胞内定位存在明显差异，暗示着不同HSPs对MD肿瘤细胞具有不同的生物学作用。HSP27是分泌性蛋白，可分泌到细胞外通过TLR5激活NB-κB通路发挥生物学作用，提高或降低HSP27的表达，能够有效降低或提高肿瘤细胞的化学药物治疗耐药性[16]；Meq基因是MDV的主要致癌基因，HSP70与MDV的Meq蛋白相互作用已在MDCC-MSB1中得到证实[17]，提示HSP70在MDV导致细胞转化过程中有着重要作用。本研究结果显示，HSP27和HSP70主要在临近肿瘤组织的肝细胞细胞质内强表达，在肿瘤细胞及远离肿瘤组织的肝细胞内弱表达，是因为肿瘤细胞生长刺激周边肝细胞，诱导表达水平升高，还是周边肝细胞HSP27和HSP70的高表达为肿瘤细胞浸润生长提供条件，目前尚不清楚。因此，HSP27和HSP70对肿瘤细胞的增殖、凋亡的作用及信号转导机制需进一步研究。HSP60和HSP90主要在肿瘤细胞的细胞质内强表达，与MD引发肿瘤病例的心肌组织中HSP90[7]和肾组织中HSP60[8]的组织细胞定位基本一致。HSP90在多种肿瘤发生发展中表达量升高，HSP90能够干扰细胞色素C对Caspase-9的激活及与抗凋亡蛋白AKT1结合，导致AKT1失活，进而阻止细胞凋亡[18]。通过HSP90抑制剂，降低肿瘤细胞内HSP90的表达，能够提高肿瘤细胞对电离辐射的敏感性[19-20]。免疫组织化学结果显示，HSP60组织细胞内定位与HSP90基本一致，是否与HSP90具有同样的生物学作用，是否能作为新的抗肿瘤靶点，还需进一步研究。
目前关于HSP90对肿瘤细胞的生物学作用研究相对明确[9-10]，因此，本文选择了组织细胞定位存在明显差异的HSP90和HSP70进行了转录、表达水平的定量研究。HSP70 mRNA的转录水平虽然一直极显著高于空白对照组，但21日龄后表现出转录水平逐步恢复的趋势，HSP70的蛋白表达量在42日龄后与空白对照组无显著性差异；HSP90的转录、表达水平持续升高，一直极显著高于空白对照组。HSP90与HSP70的组织细胞内定位及转录表达水平变化趋势皆存在明显差异，其分子机制需进一步深入研究。
7日龄时，疫苗免疫对照组的HSP70转录水平极显著高于空白对照组，HSP90的转录、表达水平也显著高于空白对照组，其余日龄差异不显著，说明疫苗免疫应激及MDV疫苗毒的体内增殖对机体细胞具有一定的应激作用，导致早期HSPs的转录表达水平有所升高，但后期HSP70和HSP90转录、表达水平的升高主要由肿瘤细胞的增殖导致。
4 结论在MDV引发鸡肿瘤发生、发展过程中，肿瘤细胞生长可以导致肝组织损伤和HSPs转录、表达水平的变化。不同HSPs在组织细胞内定位截然不同，HSP60和HSP90主要在肿瘤细胞内强表达，而HSP27和HSP70主要在肿瘤组织周边的肝细胞的细胞质内强表达；HSPs表达量变化趋势存在差异，HSP70表达量阶段性升高，而HSP90表达量持续升高，说明不同HSPs在MD肿瘤发生、发展过程中的生物学作用存在差异。
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