2. 重庆三峡职业学院, 万州 404155
2. Chongqing Three Gorges Vocational College, Wanzhou 404155, China
腺苷三磷酸结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporters，ABC转运蛋白)是一类跨膜蛋白，可作为“载体”通过构象改变形成跨膜通道而将物质转运进出细胞。ABC转运蛋白参与信号转导、分子转运、抗原加工、免疫[1]、基因的转录和翻译[2]及DNA的修复[3-4]等生物学过程。在寄生虫中，ABC转运蛋白除了在耐药性方面有重要作用外，还在胚胎发育、虫卵的产生、雌性配子体的生殖等生物学过程中发挥着重要作用[5]。
RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术又称转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)，是外源性或内源性的双链RNA介导同源靶基因的mRNA特异性降解，从而导致靶基因表达沉默的现象。近年来，RNAi以其高特异性、高效性和遗传性等显著优势已成为研究基因功能的主要方法，在功能基因组学和基因表达调控机制研究等领域得到了广泛的应用[6-10]。
本试验通过体外合成犬弓首蛔虫(Toxocara canis, T. canis)腺苷三磷酸结合盒G5基因(Tc-abcg-5)的特异性siRNA，利用RNAi技术对T. canis的成虫和虫卵进行干扰，探讨abcg-5基因对T. canis生长和发育的影响。
1 材料与方法 1.1 材料T.canis采自西南大学荣昌校区动物医院患病犬，雌虫用37 ℃灭菌生理盐水洗涤两次，并在37 ℃恒温培养箱中用预热的PBS溶液培养2 h，使其排出肠道内容物后用于后续试验。解剖雌虫的子宫，收集虫卵，4 ℃保存。
实验动物为2~3周龄昆明小鼠，购自泸州医学院实验动物中心。
PrimeScriptTM反转录试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ荧光染料购自TaKaRa公司；Trizol试剂购自Invitrogen公司。
1.2 方法 1.2.1 引物的设计与合成对Tc-abcg-5基因进行RNA干扰的靶位筛选，设计3对siRNA和1对Negative control siRNA(NC)，并另外合成1对5-羧基荧光素(FAM)标记的Negative control siRNA(序列同Negative control siRNA)(表 1)，siRNA由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成。根据Tc-abcg-5基因全长序列(GenBank No. KX497029)，采用Primer Premier (Version 5.0)软件设计荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)的特异性引物，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，序列如表 1所示。
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表 1 Tc-abcg-5基因实时荧光定量PCR扩增及RNA干扰引物 Table 1 Primers for quantitative real time PCR amplification and RNA interference of Tc-abcg-5 |
5-羧基荧光素标记的Negative control siRNA用PBS缓冲液稀释后，分别利用电穿孔法(电穿孔条件为800 V，200 Ω)和浸泡法将其导入到T. canis的虫卵中，终浓度为500 nmol·L-1，于30 ℃条件下进行体外培养。培养20 h后在荧光显微镜下观察T. canis虫卵中的荧光信号，比较两种方法对RNA干扰效果的影响。
1.2.3 siRNA的筛选应用浸泡法将siRNA导入到T. canis的雌虫体内。设置siRNA-432、siRNA-744、siRNA-1020处理组、NC阴性对照组和PBS空白对照组。各试验组siRNA的终浓度为500 nmol·L-1，于37 ℃、添加5% CO2的条件下进行体外培养。分别于浸泡培养24和48 h后，随机挑取试验组和对照组虫体进行总RNA的提取。采用Trizol试剂提取T. canis成虫的总RNA。采用核酸蛋白检测仪检测总RNA的浓度和纯度。以提取的T. canis总RNA为模板，按反转录试剂盒说明合成cDNA。
以提取的各试验组和对照组虫体的cDNA为模板，以18S rRNA为内参基因，用SYBR荧光染料进行qRT-PCR反应，检测Tc-abcg-5基因转录水平的变化。在荧光定量PCR管中加入8.5 μL的ddH2O，12.5 μL SYBR Ⅱ，1 μL Forward Primer，1 μL Reverse Primer和2 μL cDNA。混匀后在荧光定量PCR仪中，94 ℃预变性30 s，94 ℃变性5 s，55 ℃退火30 s，循环40次，每个循环收集数据。每个基因做三次重复，对所得数据进行统计学分析，采用2-ΔΔCt法对Tc-abcg-5的转录水平进行分析，数据以“x±s”形式表示。各试验组间的差异采用t检验进行分析(P＜0.05)，筛选出沉默效率最高的siRNA进行下一步的研究。
1.2.4 RNA干扰对虫卵发育的影响应用浸泡法将siRNA导入到T. canis的虫卵内。试验设置siRNA-744处理组、NC阴性对照组和PBS空白对照组。各试验组siRNA的终浓度为500 nmol·L-1，于30 ℃条件下体外培养。每隔24 h进行一次虫卵计数，每次做三个重复。用SPSS 20.0统计分析软件进行数据处理和统计分析。虫卵的发育情况用单因素方差分析进行统计(P＜0.05)。
1.2.5 RNA干扰对T. canis虫卵感染力的影响应用浸泡法将siRNA导入到T. canis的感染性虫卵内。设置siRNA-744处理组、NC阴性对照组和PBS空白对照组。各试验组siRNA用PBS缓冲液稀释，使终浓度为500 nmol·L-1，于30 ℃条件下体外培养20 h。
2~3周龄的昆明小鼠随机分为3组，每组10只，分笼饲养。每组小鼠均经口灌服0.3 mL(约含3 000个T. canis感染性虫卵)相应试剂处理20 h后的PBS溶液。感染后第7天，每组随机处死3只小鼠，取脑、肝、肺组织，肉眼观察各组织病变后固定于中性福尔马林溶液中，制作石蜡切片，经HE染色后，镜检观察各组织的病变。
2 结果 2.1 RNA干扰途径的筛选通过电穿孔法和浸泡法将荧光标记的Negative control siRNA导入到T. canis虫卵内，用荧光显微镜观察，发现电穿孔法和浸泡法处理的T. canis虫卵内都有明显的绿色荧光信号(图 1)。但浸泡法处理的T. canis的虫卵内荧光信号更强且视野内虫卵碎片较少，表明浸泡法更有利于将siRNA导入到T. canis虫卵内。
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A.浸泡法(100×)；B.浸泡法(400×)；C.电穿孔法(100×)；D.电穿孔法(400×) A. Immersion (100×); B. Immersion (400×); C. Electroporation (100×); D. Electroporation (400×) 图 1 RNA干扰方法的筛选 Figure 1 Methods screening of RNAi |
以NC阴性对照组Tc-abcg-5基因的转录水平为对照，分析siRNA-432、siRNA-744、siRNA-1020处理组和PBS空白对照组中Tc-abcg-5基因的转录水平，结果显示siRNA-744组在处理24、48 h后Tc-abcg-5的相对表达量极显著降低(P＜0.01)(图 2)，而siRNA-432和siRNA-1020组在处理24、48 h后Tc-abcg-5的相对表达量无显著性变化。结果表明siRNA-744的沉默效率较高，选取siRNA-744用于下一步的研究。
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**. P＜0.01 图 2 siRNA处理后T. canis abcg-5基因转录水平的变化 Figure 2 The change of gene transcription level of T. canis abcg-5 after siRNA treatment |
通过浸泡法将siRNA-744和Negative control siRNA导入到T. canis虫卵内，每隔24 h进行一次虫卵计数，总共计数7 d。结果经单因素方差分析，显示siRNA-744处理组中未发育的虫卵比例极显著高于PBS组和NC组(P＜0.01)(图 3)，siRNA-744处理组发育中的虫卵比例显著低于PBS组和NC组(P＜0.05)(图 4)，而三个组中发育完全的虫卵比例无显著差别。结果表明RNA干扰使虫卵的发育受阻。
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**. P＜0.01 图 3 经浸泡法处理后未发育的T. canis虫卵的平均发育比例 Figure 3 Average proportions of undeveloped T. canis eggs after treatment by immersion method |
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*. P＜0.05 图 4 经浸泡法处理后不同发育阶段的T. canis虫卵的平均发育比例 Figure 4 Average proportions of T. canis eggs of different developmental stages after treatment by immersion method |
通过浸泡法将siRNA-744和Negative control siRNA导入到T. canis感染性虫卵内，经口灌服小鼠感染后第7天，观察小鼠的脑、肝、肺组织的病变情况。结果显示，小鼠感染T. canis第7天，各试验组小鼠的肺出现不同程度的萎缩和出血性病变，其中NC组和PBS组小鼠肺的萎缩程度大于siRNA-744处理组(图 5)。小鼠感染T. canis第7天在各试验组小鼠的肺切片中观察到了T. canis幼虫(图 6)，还观察到小鼠肺切片中存在广泛的出血区，但是siRNA-744处理组小鼠肺的出血程度小于NC组和PBS组(图 7)。结果表明，RNA干扰使T. canis虫卵的感染力下降，从而降低了肺的病变程度。
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A. NC组；B. PBS组；C. siRNA-744组 A. NC group; B. PBS group; C. siRNA-744 group 图 5 感染3 000个T. canis感染性虫卵小鼠的肺、肝和脑组织病变 Figure 5 Lesions in the lung, liver and brain of mice infected with 3 000 T. canis embryonated eggs |
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A. NC组；B. PBS组；C. siRNA-744组 A. NC group; B. PBS group; C. siRNA-744 group 图 6 感染T. canis小鼠肺中的幼虫(400×, HE) Figure 6 T. canis larva in the lung of infected mice (400×, HE) |
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图 7 感染T. canis小鼠肺、肝和脑组织病理切片(HE) Figure 7 Pathological sections of lung, liver and brain taken from T. canis-infected mice (HE) |
各试验组小鼠的肝均出现少量的白色针尖状病灶(图 5)。在siRNA-744处理组小鼠的肝切片中观察到肝细胞颗粒变性；在NC组和PBS组小鼠的肝切片中观察到肝细胞水泡变性，少数肝细胞坏死(图 7)。结果表明，RNA干扰使T. canis虫卵的感染力下降，从而降低了肝的病变程度。
小鼠感染T. canis第7天后各试验组小鼠的脑皮质表面无肉眼可见明显病变(图 5)。小鼠的脑组织切片分层清晰，无肉眼可见明显病变(图 7)。
3 讨论RNA干扰技术在寄生虫基因功能研究领域得到了广泛应用，在原虫[11-12]、吸虫[13-14]和线虫[15-17]中都有RNA干扰技术应用的报道。RNAi的传送途径主要有5种方法，分别是浸泡法、表达dsRNA的工程菌饲喂法、显微注射法、电穿孔法和离子轰击法等[18-21]。目前在研究寄生性线虫RNAi的效果时多采用浸泡法，即将线虫放于含有dsRNA或者siRNA的培养液中培养。电穿孔法是另一种有效的dsRNA或者siRNA运送方法，目前已用于多种毛圆科线虫dsRNA的递送。Zawadzki等[15]在研究中发现，RNA干扰能在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中成功应用是因为C. elegans属于营自由生活类线虫，能在体外培养条件下独立生存。而T. canis是一种寄生线虫，其并不能在培养液中生活很长时间，所以并不是所有的培养方法都能在T. canis中实现有效的RNAi。本研究比较了浸泡法和电穿孔法这两种RNAi的传送途径，发现浸泡法更有利于将siRNA递送到T. canis虫卵内，且浸泡法能有效避免电脉冲作用导致的细胞损伤或破裂。
ABC转运蛋白在寄生虫虫卵的发育过程中发挥着重要作用。前期在组织定位研究中发现TcABCG5蛋白主要分布于T. canis雌虫的卵巢、子宫和雄虫的储精囊等生殖组织[22]，表明TcABCG5蛋白可能参与T. canis的生长、发育或繁殖等相关过程。此次RNA干扰的结果也表明在对Tc-abcg-5基因进行敲低后，T. canis未发育的虫卵和发育中的虫卵比例发生显著性变化，表明RNA干扰阻碍了T. canis虫卵的发育。Greenberg[23]和Kasinathan等[24]在研究血吸虫ABC转运蛋白的功能时也发现，RNAi会导致血吸虫虫卵的体外产量明显减少。Greenberg[23]利用共聚焦显微镜对ABC转运蛋白抑制剂处理的血吸虫的生殖系统进行分析时也发现，缺陷主要定位于雌虫，表现为未成熟卵母细胞的丧失和成熟卵母细胞的“堆积”，表明对ABC转运蛋白进行RNA干扰会使虫卵的发育受阻。Kasinathan等[24]研究发现，用ABC转运蛋白抑制剂处理的血吸虫虫卵通常在形态学上呈现异常，但可以分离到成熟的虫卵并且可以正常孵化，这表明ABC转运蛋白抑制剂直接影响虫卵的发育，而不是直接影响成熟的虫卵。在本研究中，RNAi的结果与Kasinathan等[24]的研究结果类似，Tc-abcg-5基因被敲低后会阻碍T. canis虫卵的发育，而对成熟的虫卵无显著影响。Kasinathan等[24]研究发现在受血吸虫感染的小鼠体内，经P-糖蛋白(Pgp)和多药耐药相关蛋白1(MRP1)的抑制剂处理后，能显著降低小鼠肝的虫卵负荷和病变程度[24]。在本试验中，对T. canis的感染性虫卵进行RNA干扰后，小鼠肺和肝的病变程度也显著降低，原因可能是RNAi影响T. canis虫卵的发育，也影响了T. canis虫卵的感染力。因此，Tc-abcg-5基因可能通过影响虫卵的发育从而参与T. canis的生长、发育过程。
4 结论RNA干扰降低了Tc-abcg-5基因的表达量，使T. canis虫卵的发育受阻及虫卵的感染力下降，从而降低肺、肝的病变程度，表明TcABCG5蛋白可能通过影响虫卵的发育从而参与T. canis的生长、发育过程。
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