猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的主要以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸系统症状为特征的传染病^[1]，其显著而严重的免疫抑制^[2]和持续感染^[3]给该病的防控造成了极大的困难，猪场一旦感染该病，很难彻底消除，潜在危害极大，给养猪业造成重大损失^[4]。病毒血症后，猪的扁桃体和淋巴结会持续携带病毒^[5]，病毒在猪体内的复制期可长达250 d，造成猪体“终生”带毒^[6]。PRRSV具有严格的细胞嗜性，倾向于侵袭分化良好的单核细胞和巨噬细胞系，比如肺泡巨噬细胞^[7-8]。体外条件下，PRRSV也可在非洲绿猴肾细胞系MA-104及其衍生细胞系，Marc-145、Vero和CL-2621中增殖。

目前尚无针对PRRS的特效治疗药物，主要通过疫苗接种进行预防。目前常用弱毒疫苗和灭活疫苗来预防此病^[9]，一般认为弱毒疫苗效果较佳^[10]，刺激猪体产生的抗体水平比灭活疫苗高且抗体持续时间长^[11-12]，但不能避免病毒的持续感染，并存在散毒和毒力返强等风险^[13]。目前临床上主要以注射方式进行免疫接种，该免疫方式诱导产生的中和抗体水平低，而且其诱导产生的非中和抗体可以促进PRRSV在PAM内的增殖，产生抗体依赖性增强作用^[14-16]，在一定程度上使PRRSV的致病机制更为复杂。对于以滴鼻方式进行免疫接种后，诱导产生的抗体是否具有较强的中和作用和免疫保护力，还不是十分清楚。为了进一步了解PRRSV弱毒疫苗经滴鼻和注射两种途径接种仔猪的病毒血症、抗PRRSV抗体以及抗PRRSV中和抗体的差异性，从而为临床防疫工作提出合理建议，本试验选取9头20日龄健康仔猪，随机分为3组，即滴鼻组、注射组和对照组。在感染后不同时间自前腔静脉采血，并于第43天采血后摘取猪的脾，颌下、腹股沟和肠系膜淋巴结，无菌收集猪肺泡巨噬细胞，采用本实验室建立的实时荧光定量PCR方法^[17]检测PRRSV的拷贝数，PRRSV间接ELISA检测方法^[18]检测抗PRRSV抗体效价，基于PAM的中和抗体检测方法^[19]检测抗PRRSV中和抗体效价。

1 材料与方法 1.1 细胞株与毒株

Marc-145细胞、PRRSV VR2332毒株均为本实验室保存。

1.2 主要试剂

dNTPs、Oligo d(T)、Ribonuclease Inhibitor、Reverse Transcriptase M-MLV、SYBR Premix Ex Taq均购自TaKaRa公司；Trizol购自北京康为生物科技有限公司；HRP标记的兔抗猪IgG购自北京博奥森生物技术有限公司；双组分TMB显色液购自北京索莱宝生物科技有限公司。

1.3 试验动物

9头20日龄健康大白仔猪购于郑州郊区某猪场，通过检测PRRS、猪瘟(CSF)、2型猪圆环病毒(PCV2)病和猪伪狂犬病(PR)抗原与抗体检测均为阴性。

1.4 病毒增殖

选择生长状态良好的Marc-145细胞，待其长至80%左右的单层后，将适量的PRRSV VR2332株接种于细胞上，37 ℃吸附作用1 h后，加入含2%胎牛血清的DMEM培养液，于5% CO₂、37 ℃条件下培养至细胞病变达到80%时收获病毒，反复冻融3次，离心收获上清即为病毒液。

1.5 PRRSV TCID₅₀的测定

取生长状态良好的Marc-145细胞铺于24孔细胞培养板，待细胞长至80%左右的单层后，将PRRSV液用DMEM培养液做10^-1~10^-6的10倍倍比稀释，接种于细胞，每一个稀释度做4个平行细胞孔，于37 ℃吸附1 h后加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，于37 ℃、5% CO₂条件下培养48 h。根据段二珍^[17]建立的荧光定量PCR方法，检测各孔中PRRSV的拷贝数，计算病毒的TCID₅₀。

1.6 试验设计

将9头20日龄仔猪随机分为滴鼻组、注射组和对照组，每组3头，各组之间隔离饲养。将PRRSV VR2332弱毒株分别滴鼻和肌内注射接种仔猪(5×10⁵ TCID₅₀ ·头^-1)，对照组接种健康Marc-145细胞培养物。分别于感染后第0、3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43天前腔静脉采血，第43天采完血后，摘取猪的脾、颌下淋巴结、腹股沟淋巴结和肠系膜淋巴结并无菌收集猪肺泡巨噬细胞，采用荧光定量PCR方法检测PRRSV拷贝数。采用ELISA方法检测血清中抗PRRSV抗体效价，根据本实验室建立的基于PAM的中和抗体检测方法^[19]检测血清中抗PRRSV中和抗体效价。

2 结果 2.1 PRRSV TCID₅₀测定

本实验室保存的PRRSV在Marc-145细胞上增殖时不产生明显的细胞病变，以段二珍^[17]建立的PRRSV实时定量PCR方法检测各孔中PRRSV的mRNA拷贝数，根据Karber法^[20]的计算公式lg TCID₅₀=L-d(s-0.5)计算病毒的TCID₅₀(L=最高浓度的稀释比例对数；d=稀释对数之间的差；s=阳性孔比例之和)，得出病毒的TCID₅₀=10^-5.25·mL^-1。荧光定量PCR结果如表 1所示。

2.2 两种途径感染引起病毒血症变化规律的差异比较

接种前仔猪血清中的核酸检测结果均为阴性，滴鼻组于感染后第3天在2头猪血清中检测到PRRSV，第7天3头猪均检测到PRRSV，3头猪的病毒血症均持续到第27天，第31天检测不到PRRSV；注射组于感染后第3天在3头猪血清中均检测到了PRRSV，表明已出现病毒血症，且有1头持续到第31天，有2头持续到第35天。对照组始终未出现病毒血症。不同时间段血清中病毒阴、阳性检测结果如表 2所示。

滴鼻组于感染后第7天，注射组于第3天，病毒拷贝数均达到10³拷贝·μL^-1。在感染后第19天时病毒拷贝数最高，滴鼻组达到10⁴拷贝·μL^-1，注射组达到10⁵拷贝·μL^-1，之后逐渐降低。滴鼻组、注射组分别于感染第27、35天后病毒血症消失。表明注射组血清里的病毒持续时间久并且病毒含量高。病毒含量及增殖规律如图 1所示。

2.3 两种途径感染后免疫器官和PAM中病毒检测结果比较

感染后第43天，摘取猪的脾，颌下、腹股沟和肠系膜淋巴结并无菌收集PAM，经荧光定量PCR方法检测，在颌下、腹股沟及肠系膜淋巴结和PAM中均检测到PRRSV，但脾中未检出。滴鼻组中颌下和肠系膜淋巴结PRRSV拷贝数约为10³拷贝·μL^-1，腹股沟淋巴结约为10⁴拷贝·μL^-1；注射组的PRRSV拷贝数稍高于滴鼻组，颌下和肠系膜淋巴结PRRSV拷贝数约为10⁴拷贝·μL^-1，腹股沟淋巴结约为10⁵拷贝·μL^-1。PAM中PRRSV拷贝数均可达到10⁷拷贝·μL^-1左右，表明弱毒株感染后虽然病毒血症消失，但病毒在猪体内持续存在。

2.4 两种途径感染后血清中抗PRRSV抗体检测结果比较

抗体测定结果的判定采用S/N值法，检测样品OD值大于阴性对照OD值的2.1倍，即判定为阳性。两个试验组猪感染PRRSV后抗体水平一直处于逐渐上升趋势，第27天检测到血清中抗PRRSV抗体转为阳性，一直持续到试验结束。滴鼻组在抗体水平达到阳性后一直保持基本不变，注射组在感染第35天后抗体处于较高水平。对照组抗体一直保持阴性。抗体水平变化如表 3和图 2所示。结果显示，PRRSV弱毒株注射接种相比滴鼻接种刺激猪体血清抗体产生时间早且抗体效价高。

2.5 两种途径感染后血清中抗PRRSV中和抗体检测结果比较

根据抗PRRSV抗体检测结果选取感染后第3、11、19、27、35、43天的血清用荧光定量PCR方法在PAM上检测中和抗体的变化，根据本实验室建立的基于PAM的抗PRRSV中和抗体检测方法^[19]判定中和效价。判断标准：被检血清与阴性血清相比，阻断病毒率大于70%的最大样品稀释度为该样品的中和抗体效价。结果显示滴鼻组的抗PRRSV中和抗体效价在感染后第3、11、19、27和35天均小于1:2，因此只选择了第35天的结果(图 3A)给予展示，而第43天的中和效价为1:2(图 3B)。图中PRRSV、PRRSV+NPS、PRRSV+Ab分别表示PAM上只接种病毒、病毒和阴性血清、病毒和待检血清。横坐标表示血清的稀释倍数，纵坐标表示病毒拷贝数的对数值，柱形图上的数字表示两组间后者与前者病毒拷贝数的比值。当PRRSV+ Ab组与PRRSV+NPS组的比值小于0.3×时，表示阻断病毒率大于70%，此时最大样品稀释度为该样品的中和抗体效价。结果表明PRRSV弱毒株接种猪后，血清中产生的中和抗体水平低下。注射组选取同样的时间点检测抗PRRSV中和抗体效价，结果显示第3、11和19天的中和效价小于1:2，因此仅选择第19天的结果(图 4A)给予展示，第27、35、43天的中和效价分为1:4(图 4B)、1:8(图 4C)、1:4(图 4D)。对照组的中和抗体效价检测结果均小于1:2。结果表明，PRRSV弱毒株注射接种于猪后，血清中产生中和抗体处于逐渐上升趋势，感染后第43天时又降低了一个倍数，但还是存在着一定量的中和抗体。两试验组的中和抗体效价检测结果如表 4所示。两组试验结果相比较，在相同时间段注射组血清中的中和抗体效价一直比滴鼻组高，并且注射组的抗体效价最高可达到1:8，这在猪体内可以对病毒起到一定的中和作用而保护动物机体。

3 讨论

从病毒血症的持续时间及PRRSV的增殖规律分析，结果表明滴鼻组的仔猪在感染后的第3天就可以在血清中检测出病毒，出现病毒血症，在第15- 19天病毒血症达到高峰，以后呈下降趋势，感染第27天后仔猪的病毒血症消失；注射组在感染后第3天的血清中也检测到了病毒出现病毒血症，且病毒拷贝数一直呈逐渐上升趋势，在第15-23天病毒血症达到高峰，以后也呈现下降趋势，基本在感染第35天后病毒血症消失。注射组的病毒拷贝数较滴鼻组的高10~100倍，且时间长一周左右。由此可以得出注射组病毒进入血液后增殖得比较快，滴鼻组可能是由于黏膜免疫可以清除一些病毒，之后进入血液的病毒含量相对比较少，增殖得比较慢些。且随着抗PRRSV抗体水平的不断升高，病毒血症逐渐减弱。

据报道，PRRSV临床感染后大多在第7天时抗体开始转阳，第14天抗体全部为阳性，本试验PRRSV VR2332弱毒株感染机体后产生抗PRRSV抗体较慢，第27天抗体才呈阳性。本试验后续研究结果表明，增加病毒感染剂量，滴鼻组抗体出现的时间提前到第7天，注射组抗体出现的时间提前到第19天，这说明感染剂量对抗体出现的时间有所影响。但是注射组较滴鼻组抗体转阳的时间仍较晚，可能是由于注射接种后，病毒主要感染巨噬细胞，抑制抗原提呈，诱导免疫抑制。此外，猪繁殖与呼吸综合征在临床多为呼吸道感染PRRSV强毒所致，本试验所用VR2332株为致弱毒株，感染力较低，这些都可能导致抗体出现时间较晚。

在PRRSV的免疫学研究中，尽管中和抗体是否对机体起到保护作用仍存在着很大争议，但已有报道表明，特异性中和抗体可以清除病毒血症，对动物机体起到保护作用^[21]。本试验采用基于PAM的中和试验，检测PRRSV VR2332弱毒株接种后的中和抗体效价。滴鼻组选取感染后第3、11、19、27、35、43天的血清进行中和试验检测中和抗体效价，试验结果显示在第35天之前中和效价都小于1:2，第43天中和效价为1:2，表明滴鼻组出现中和抗体水平很低。注射组选取相同时间点检测抗PRRSV中和抗体效价，结果显示，感染后第3、11、19天的中和效价小于1:2，第27、35、43天的中和效价分为1:4、1:8、1:4。表明PRRSV弱毒疫苗注射接种于猪后，血清中产生中和抗体处于逐渐上升趋势，到第43天时又降低了一个倍数，虽然出现中和抗体的水平很低，但还是存在着一定量的中和抗体。

本研究发现试验仔猪的病毒血症在接种后一周内均可出现，并于第35天左右都会消失，这也是许多试验结果已证明和报道过的^[22]。由于滴鼻组血清中病毒的拷贝数基本在10³~10⁴拷贝·μL^-1之间，含量较低，产生的中和抗体水平很低。然而注射组血液中病毒的拷贝数最高可以达到10⁵拷贝·μL^-1，中和抗体效价最高达到1:8，与滴鼻组相比，水平比较高的中和抗体可能会中和血液中的部分病毒。但不同接种方式的检测结果表明，注射接种比滴鼻接种产生的病毒血症更严重且持续时间更长，测得中和抗体水平也较高，原因可能是中和抗体的产生和血液中病毒的含量有关。在试验结束时，采集试验猪的免疫器官及肺并无菌收集PAM，采用荧光定量PCR方法检测PRRSV拷贝数可达到10⁷拷贝·μL^-1，说明尽管病毒血症消失了，但病毒依然在体内存在，也证实了PRRSV的持续感染特性，这也是PRRSV更难防控和消灭的主要原因。本试验结果表明VR2332弱毒株注射接种比滴鼻接种能刺激猪体产生更高水平的中和抗体，但同时可能会延长病毒血症的时间，此结果可为临床防疫工作提供理论依据和指导。

本试验结果表明，滴鼻接种比注射接种诱导机体产生的中和抗体水平低，可能是由于滴鼻接种时，病毒进入血液前会先通过黏膜免疫系统，导致进入血液中的病毒含量较少且出现时间较晚。同时，滴鼻接种诱导产生IgG抗体的同时，还诱导机体发生黏膜免疫应答产生SIgA抗体。而本试验主要检测血清中IgG抗体的中和水平，对SIgA抗体的中和作用未进行研究，所以不能否定滴鼻接种的效果，需对SIgA抗体的中和作用做进一步研究。

4 结论

VR2332弱毒株经注射免疫比滴鼻免疫能诱发猪产生更高水平的抗PRRSV抗体和抗PRRSV中和抗体，也会诱发更高水平、更长时间的病毒血症，并且抗体水平与病毒的拷贝数呈正相关。