蓝舌病(bluetongue, BT)是由蓝舌病病毒(bluetongue virus, BTV)感染引起的一种严重侵害反刍动物的烈性传染病，世界动物卫生组织(OIE)将BT列为法定报告的动物疫病，据估计全球每年仅因BT而导致的经济损失高达30亿美元[1]。BT主要流行于热带、亚热带及温带地区，病毒通过雌性库蠓(Culicoides)对牛、羊、骆驼等反刍动物的吸血性叮咬而传播。2006年欧洲暴发了历史上最为严重的BT疫情，给欧洲各国牛、羊养殖业带来严重的经济损失[2-3]。近年来随着全球气候变暖和极端天气的影响，库蠓呈现由热带亚热带地区向两极的温带、寒带以及高海拔地区扩散的趋势，给牛、羊养殖的生产安全带来严重的威胁[4-5]。
BTV的外层衣壳由Segment 2(Sge-2)与Segment 6(Seg-6)编码的VP2蛋白与VP5蛋白共同构成[6]。VP2是诱导BTV特异性中和抗体产生的主要蛋白，决定着病毒的血清型[7-8]，为病毒变异度最高的蛋白，其氨基酸序列在不同血清型毒株间的差异为22.7%~72.9%[9]。VP5蛋白的变异度仅次于VP2，可通过影响VP2蛋白的构象，影响BTV血清型特异性抗体的产生[10-11]。目前已在世界范围发现了27种BTV血清型(BTV-1~BTV-27)[12-14]。BTV血清型众多，不同血清型毒株之间缺乏有效的交叉免疫保护，给BT的防控带来了严峻的挑战[15]。1996—1998年云南省畜牧兽医科学院在我国开展BTV的流行病学调查研究，从云南省设定的哨兵动物(sentinel animals)和全国采集的牛、羊血液样本中分离到七种血清型的BTV(BTV-1、-2、-3、-4、-12、-15、-16)[16]。虽然通过血清学调查证实BTV-9型在我国南方地区的流行，但在我国始终没有BTV-9型病毒的分离报道。
2012—2017年在国家公益性行业(农业)专项的资助下，云南省畜牧兽医科学院在我国的云南、广西、广东、湖北、江苏、山西、新疆、内蒙古等8个省建立了牛羊虫媒病毒监控点并设定了哨兵动物，开展我国BTV的流行病学调查研究。2013年笔者课题组在设立于云南省芒市的哨兵牛中首次分离出BTV-9型病毒。本文对我国分离BTV-9型毒株的分离鉴定、Seg-2与Seg-6的进化特征以及病毒在牛上的感染特性进行了报道，拟为深入开展中国BTV-9型病毒的遗传特性、致病性、诊断试剂与疫苗的研究提供基础资料。
1 材料与方法 1.1 试剂磁珠法病毒RNA抽提试剂盒MagMAX-96 Viral RNA Isolation Kit、MEM培养基、DMEM培养基、胎牛血清，购自Thermo公司；总RNA提取试剂RNAiso-Plus、核糖核酸酶S1、逆转录酶PrimeScript II Reverse Transcriptase、GXL超保真DNA聚合酶、胶回收试剂盒，购自大连宝生物公司；RNA纯化试剂盒MicroElute RNA Clean Up购自OMEGA公司；T4 RNA连接酶购自NEB公司；PLB平末端克隆试剂盒、E. coli DH5α感受态细胞购自北京天根公司。
1.2 细胞、毒株、鸡胚、阳性血清BHK-21细胞、C6/36细胞(Aedes albopictus)与Vero细胞为本实验室保存。BTV-1至BTV-24型国际标准参考毒株，源自OIE参考实验室(Onderstepoort Veterinary Institute, South Africa)，由本实验室保存；9~10日龄白壳鸡胚购自云南省小哨鸡场；BTV-1至BTV-24型毒株标准阳性血清，由本实验室以纯化后的BTV-1至BTV-24国际标准参考毒免疫家兔制备。
1.3 引物设计与合成根据GenBank中公布的日本、印度与澳大利亚BTV-9型毒株的Seg-2与Seg-6序列，使用Oligo 7.0软件设计两对引物分别用于扩增BTV-9型毒株Seg-2与Seg-6的ORF区。BTV-9型 Seg-2的上、下游扩增引物分别为BTV-9-Seg-2-F(ATGGAYGAATTCG-GAATACCCATT)与BTV-9-Seg-2-R(CTATACATT - CAGAAGTTTAGT)；BTV-9型Seg-6的上、下游扩增引物分别为BTV-9-Seg-6-F(ATGGGCAAAATCATCAAGTCACT)与BTV-9-Seg-6-R(TCATGC-GTTTCGTAAGAAGAG)，引物由上海捷瑞公司合成。
1.4 血液样本的采集在位于中缅边界的云南省芒市郊区(E98°31′，N24°23′)设立牛羊虫媒病毒监控点，采用放养的方式设置BTV血清学阴性的10头牛与5只羊作为哨兵动物。每年3-12月定期从哨兵动物上采集肝素钠抗凝血、EDTA抗凝血与常规血等三种血液样品于4 ℃冰盒保存，并立即送至实验室进行牛羊虫媒病毒的检测与病毒分离工作。
1.5 血液样本中BTV核酸的检测与病毒分离取1 mL EDTA抗凝血离心收集红细胞(RBCs)，以PBS洗涤1次，加入200 μL灭菌水重悬裂解RBCs。取50 μL RBCs裂解液以MagMax Express核酸自动提取仪提取核酸，以本实验室建立的BTV高通量Real-Time qRT-PCR方法进行BTV核酸检测。对核酸检测为BTV阳性的血液，采用鸡胚静脉接种的方式[17]进行病毒分离。收获2~7 d发生死亡鸡胚的肝与脾，加入1 mL含双抗的MEM培养基研磨，取200 μL离心上清液接种C6/36细胞，培养6 d，随后在BHK-21细胞上盲传3~5代，逐日观察接种细胞的细胞病变(CPE)情况。
1.6 中和试验在96孔板上使用Vero细胞按照本实验室制定的蓝舌病诊断技术国家标准(GB/T 18636-2017)方法[18]进行病毒血清型的微量中和试验鉴定。方法简述如下：将BTV-1至BTV-24标准阳性血清与BTV标准阴性血清进行1:20倍稀释，取50 μL稀释的血清与100个TCID50待鉴定病毒液等体积混合，接种细胞并逐日观察CPE，进行病毒血清型的初步判定。若待检病毒只被某一标准阳性血清中和，使用该血清型的标准参考毒株作为对照，采用“固定病毒-稀释血清”的方法计算血清的中和指数。
1.7 Seg-2与Seg-6基因节段ORF区的扩增与克隆测序将病毒接种BHK-21细胞，待细胞出现完全CPE后，离心收集细胞，以RNA提取试剂RNAiso-Plus提取细胞总RNA，按照笔者课题组前期报道的FLAC(Full Length Application of cDNA)技术[19]合成BTV全基因组的cDNA。以合成的BTV全基因组cDNA为模板，使用BTV-9型毒株的Seg-2与Seg-6 ORF区扩增引物，以GXL Taq高保真DNA聚合酶进行PCR扩增。将符合预期大小的PCR产物克隆入PLB平末端克隆载体，将连接产物转换E. coli DH5α感受态细胞，筛选阳性菌落，进行测序。
1.8 序列分析与系统发生树构建使用DNASTAR软件(Ver 6.0)对测序结果进行拼接。使用MEGA 6.0软件[20]进行序列的比对分析，并进行系统发生树的构建。建树方法为邻近法(Neighbor-joining, NJ)，选择遗传距离模式(P-distance)，自举检验(bootstrap)取值1 000。
1.9 病毒在细胞上增殖特性的分析取100 μL适当稀释的病毒液接种24孔板上长为单层的BHK-21细胞，37 ℃感作2 h后弃去病毒液，加入1 mL DMEM营养琼脂(含2%的胎牛血清与1%的琼脂糖)覆盖细胞。在感染后的第5天，在细胞培养孔中加入0.5%的结晶紫染液染色，观察蚀斑形态并进行噬斑计数。将稀释的病毒液以0.01的感染复数(MOI)接种BHK-21细胞。在病毒接种后的12~96 h，间隔12 h收获细胞培养上清，测定细胞上清中病毒的TCID50。
1.10 牛血液中BTV核酸与抗体的监测对分离出BTV的哨兵牛(B5号牛)，取不同时间点的血液与血清样品进行BTV核酸与抗体监测，分析病毒在牛上的感染特征：(1)提取不同时间点采集血液的核酸，采用qRT-PCR方法分析血液中病毒含量变化情况；(2)采用“固定病毒-稀释血清”的方法进行中和试验，对感染动物血清中的中和抗体水平进行监测。
2 结果 2.1 BTV的分离2013年8月13日，设立于芒市监控点B5号哨兵牛上采集的血液样本以BTV群特异性qRT-PCR检测，结果为阳性(Ct值为29.53)，表明动物感染了BTV。将BTV核酸阳性血液接种鸡胚，鸡胚在接种后的第5天出现死亡。鸡胚研磨样品接种C6/36细胞未引起细胞病变(CPE)，在BHK-21细胞盲传接种的第5代，接种细胞出现明显的CPE，表现为细胞变圆、皱缩、崩解(图 1)。提取病变细胞的核酸进行BTV群特异性qRT-PCR检测，Ct值为16.32，表明从哨兵牛的血液中分离出BTV，将分离的毒株命名为V013/YN/2013。
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A.对照细胞；B.感染细胞 A.Control cells; B.Infected cells 图 1 BTV-9型毒株(V013/YN/2013)感染BHK-21细胞引起的CPE Figure 1 CPE of BHK-21 cells caused by the infection of BTV-9 (V013/YN/2013) |
以1:20的BTV-1至BTV-24毒株标准阳性血清对分离的V013/YN/2013毒株进行血清中和试验，结果显示BTV-5型与BTV-9型标准阳性血清均可中和病毒。进一步将BTV-5与BTV-9型标准阳性血清进行连续倍比稀释，测定稀释血清对100个TCID50的V013/YN/2013、BTV-5型与BTV-9型参考毒的中和指数。结果显示，BTV-5与BTV-9标准阳性血清对BTV-5与BTV-9型参考毒的中和抗体指数均可达到1:320，表明中和试验成立。BTV-5型与BTV-9型阳性血清对V013/YN/2013的中和指数分别为1:32与1:64，初步表明分离的病毒可能为BTV-9型毒株。
2.3 V013/YN/2013毒株 Seg-2与Seg-6 ORF区的扩增为进一步确认V013/YN/2013毒株的血清型及其Seg-2与Seg-6基因节段的序列特征，笔者根据报道的BTV-9型毒株Seg-2与Seg-6序列设计引物，对分离毒株的Seg-2与Seg-6 ORF区进行RT-PCR扩增与克隆测序。结果显示设计的引物可分别扩增出与预期大小相符(约2.9与1.6 kb)的片段(图略)。
2.4 V013/YN/2013毒株Seg-2序列特征分析对V013/YN/2013毒株Seg-2阳性克隆菌的测序结果显示，Seg-2的ORF区长度为2 982 bp，可编码含有993个氨基酸残基VP2蛋白，与BTV-9型参考毒株(RSArrrr/09)的核酸与氨基酸序列相似度为69.47%/74.34%，与日本和澳大利BTV-9型毒株的相似度较高，在91.87%/95.60%(AB686223, BTV9, Japan)至89.99%/95.18%(JQ086302, BTV9, Australia)之间。构建的系统发生树显示，世界范围分离的BTV-9型毒株均属E基因型(Nucleotype E)，在系统发生树上形成两个独立进化簇：中国分离的V013/YN/2013毒株与分离自亚洲(日本与印度)、欧洲(意大利、希腊、保加利亚、塞尔维亚、科索沃、波黑、土耳其)、澳大利亚的BTV-9型毒株在系统发生树上聚为一簇，属Eastern型(图 2)。BTV-9型参考毒株(BTV9 RSArrrr/09)与分离自非洲(南非与利比亚)的BTV-9型毒株在系统发生树上聚为单独的一簇(Western型)，与Eastern型BTV-9毒株的Seg-2/ VP2核酸与氨基酸序列相似度较低，分别为68.03%~68.92%与73.22%~75.07%。
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系统发生树中的BTV-1型至BTV-24型国际参考毒株序列以“BTV1 RSArrrr/01”至“BTV24 RSArrrr/24”表示，其他国家分离的BTV-9型毒株序列以“GenBank序列号BTV血清型分离国家”表示，图中圆点表示本研究中分离的V013/YN/2013毒株，下图同 The sequence of BTV-1 to BTV-24 international reference strains in phylogenetic tree are expressed as "BTV1 RSArrrr/01" to "BTV24 RSArrrr/24". The sequence of BTV-9 strains isolated from other countries are expressed as "GenBank sequence number BTV serotype isolation country". The dots in the figure represent the V013/YN/2013 strain isolated in this study. The same as below 图 2 邻近法构建的BTV-9型毒株(V013/YN/2013) Seg-2系统发生树 Figure 2 Phylogenetic analyses of Seg-2 of BTV-9 (V013/YN/2013) with Neighbor-joining method |
克隆的V013/YN/2013毒株Seg-6 ORF区长度为1 581 bp，编码含有526个氨基酸残基的VP5蛋白。中国V013/YN/2013毒株的Seg-6与分离自亚洲、欧洲、澳大利亚的BTV-9型毒株在系统发生树上聚为一簇，属B基因型(Nucleotype B)，与日本毒株(AB686237, BTV9, Japan)具有最近的亲缘关系(图 3)，Seg-6/VP5序列相似度为98.86%/97.5%。值得注意的是，分离自南非、利比亚的毒株以及BTV-9型参考毒株的Seg-6在系统发生树上未与其他BTV-9型毒株聚为一簇，而与BTV-1型、BTV-2型以及BTV-23型参考毒株显示了更近的亲缘关系，聚为C基因型(Nucleotype C)。
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图 3 邻近法构建的BTV-9型毒株(V013/YN/2013) Seg-6系统发生树 Figure 3 Phylogenetic analyses of Seg-6 of BTV-9 (V013/YN/2013) with Neighbor-joining method |
V013/YN/2013毒株在BHK-21细胞上形成的噬斑明显大于BTV-9型南非参考毒株(图 4)。病毒增殖曲线结果显示，在接毒后的12~48 h，细胞上清中V013/YN/2013与BTV-9型南非参考毒株的病毒含量相差不大，病毒含量呈现缓慢上升的趋势，接种后60~96 h，V013/YN/2013接种细胞上清中病毒含量增幅明显高于BTV-9型参考毒株(图 5)，表明V013/YN/2013毒株在BHK-21细胞上具有更强的增殖能力。
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图 4 V013/YN/2013毒株与BTV-9型参考毒株在BHK-21细胞上的噬斑特征比较 Figure 4 Comparison characteristic of plaques produced in BHK-21 cells by V013/YN/2013 strain and BTV-9 reference strain |
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图 5 V013/YN/2013毒株与BTV-9型参考毒株在BHK-21细胞上的增殖曲线比较 Figure 5 Comparison of the proliferation curve between V013/YN/2013 strain and BTV-9 reference strain on BHK-21 cells |
自然感染V013/YN/2013毒株的B5号牛在监控期内未出现临床症状。为明确中国BTV-9型毒株对动物的感染特性，笔者对B5号牛7-10月间隔一周采集的血液与血清样本进行BTV核酸与抗体的动态监测(11月与12月无库蠓活动，因此每月20号采血一次)。病毒核酸监测结果显示，B5号牛在7月30日已经感染了BTV-9型病毒，在感染后的第2周(8月13日)血液中的病毒含量达到高峰；从感染后的第4周(8月27日)开始，血液中的病毒含量呈现下降趋势，但一直到12月份最后一次采血，仍能在血液中检测到BTV(图 6)。对B5号牛中和抗体监测结果显示：在V013/YN/2013感染后的第3周(8月20日)感染动物已经开始产生中和抗体(1:32)，感染后的第4周，中和抗体水平进一步升高(1:64)，从感染后的9月至10月21日，血液中的中和抗体水平维持在1:256；10月28日、11月与12月中和抗体水平有所下降，但仍稳定维持在1:128。
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图 6 BTV-9型病毒感染B5号牛后血液中病毒含量的qRT-PCR动态监测结果 Figure 6 Dynamic monitoring of viral load in the blood of cattle B5 infected with BTV-9 strain through qRT-PCR |
BTV-9型呈世界范围分布：亚洲的日本[21]、印度[22]、印度尼西亚[23]；大洋洲的澳大利亚[24]；欧洲[25]的意大利、希腊、保加利亚、塞尔维亚、科索沃、波黑、土耳其；非洲的南非与利比亚；加勒比海域的马提尼克岛(法国海外省)均有BTV-9型病毒的分离报道(http://www.reoviridae.org/dsRNA_virus_proteins/btv-collection.htm)。1980年，BTV-9型(Eastern型)毒株首次从土耳其侵入希腊，引起绵羊暴发BT；随后BTV-9型毒株逐步扩散至地中海区域各国(意大利、保加利亚、塞尔维亚、科索沃)，并分别于1999年与2001年再次在希腊绵羊上引起暴发，给希腊的养羊业带来了严重的损失[26]。虽然早在1996年，我们通过血清学调查证实BTV-9型在我国牛上的流行，但在我国始终没有病毒的分离报道，阻碍了对流行于中国的BTV-9型病毒的研究。
对不同地域分离的同一血清型BTV毒株的Seg-2/VP2的序列分析表明，Seg-2/VP2的变异在一定程度上体现着病毒的地域特征，并可据此将同一血清型毒株分为Eastern型与Western型[27]。中国BTV-9型V013/YN/2013毒株与日本、印度、欧洲与澳大利亚毒株在系统发生树上聚为一簇，同属Eastern型，核酸/氨基酸序列相似度大于89%/95%，表明流行于中国、欧洲与澳大利亚的BTV-9型毒株有着共同的起源。中国、日本、澳大利亚BTV-9型毒株在系统发生树上体现了更近的亲缘关系，表明它们之间有着最近共有祖先，随着时间推移病毒在各自的生态环境中形成了相对独立的进化分支。研究发现侵入澳大利亚的BTV-2型毒株来源于亚洲[24]，也表明BTV在亚洲与澳大利亚之间存在着流动。
分离自非洲的BTV-9型毒株与BTV-9型参考毒株(非洲来源)的Seg-2序列在系统发生树上与BTV-5型毒株显示了更近的亲缘关系，与BTV-9型Eastern型毒株的核酸/氨基酸序列相似度最高仅68.92%/75.07%，表明非洲BTV-9型毒株很可能在进化早期与BTV-9型Eastern毒株发生了分歧进化。V013/YN/2013毒株与BTV-9参考毒株VP2蛋白的氨基酸序列相似度仅为74.45%，这很可能是BTV-9参考毒株制备的阳性血清对V013/YN/2013毒株中和抗体效价偏低的主要原因。笔者认为采用V013/YN/2013作为BTV-9型的参考毒株制备标准阳性血清进行血清中和试验，在后继分离的中国BTV-9型毒株的血清型定型中可能更具有参考意义。
对BTV分离毒株的全基因组测序已证实了BTV在流行过程中存在着高频率的基因重配[25]。笔者发现世界范围BTV-9型毒株的Seg-2聚为E基因型，而对于Seg-6情况发生了变化：Eastern毒株的Seg-6聚为一簇(B基因型)，而非洲毒株的Seg-6在系统发生树上却与BTV-1、-2、-23型毒株聚为一簇(C基因型)，因此笔者认为非洲BTV-9型毒株的Seg-6很可能与其他血清型BTV毒株之间发生了基因重配。Shafiq等[28]通过测序发现了Seg-6基因节段在BTV-16与BTV-21血清型毒株之间的重配，进一步表明Seg-6可在不同血清型BTV毒株进行重配。
牛感染BTV后一般不出现临床症状，但可以长期带毒成为散播病毒的重要源头[29]。掌握BTV感染牛后，血液中病毒载量及中和抗体的动态变化情况，在BTV的流行病学研究中具有重要意义。通过对自然感染BTV-9型病毒的B5号牛连续5个月血液中病毒核酸与中和抗体的动态监测，发现动物在病毒血症高峰期后的一周时间即产生了中和抗体，且维持了近两个月的较高的中和抗体水平(1:256)。对血液中BTV核酸的检测结果显示，随着中和抗体的产生，血液中病毒含量虽呈现缓慢下降的趋势，但至监控期结束均可检测到病毒，表明BTV-9型病毒的感染激活了动物机体的免疫应答，但免疫系统并未完全将病毒清除。
由于在次年的1月份笔者更换了监控动物，因此对BTV-9型病毒在感染牛的血液中究竟能持续存在多长时间还不完全明确，但通过BTV核酸检测的动态曲线图的趋势(图 6)来看，笔者认为病毒可能还会在血液中持续存在1~2个月的时间。冬季气温降低，随着库蠓的死亡BTV停止传播，但由于BTV在牛血液中的持续存在，随着次年气温回暖，处于繁殖季节的雌性库蜢对牛的吸血性叮咬使得牛上感染的BTV可继续进行传播[30]。因此，牛可能是BTV越冬传播中重要的一个环节，监测BTV在牛上的动态感染情况，在BTV的流行病学研究中具有重要的意义。
4 结论首次报道BTV-9型毒株V013/YN/2013在我国的分离。分离病毒的Seg-2与Seg-6属Eastern型，与日本、澳大利亚BTV-9型毒株具有最近的亲缘关系；V013/YN/2013在BHK-21细胞上增殖能力明显强于BTV-9型参考毒株；自然感染V013/YN/2013的牛未出现临床症状，虽产生了针对BTV-9型病毒的特异性中和抗体，但在连续5个月的监控期内血液中始终能持续检测到病毒的存在，表明BTV-9型病毒的感染激活了动物机体的免疫应答，但免疫系统并未完全将病毒清除。研究结果为进一步开展中国BTV-9型病毒的全基因组测序、诊断方法的建立、流行病学调查与致病性研究奠定了基础。
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