2. 青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室, 成都 610041
2. Key Laboratory of Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Utilization, Chengdu 610041, China
牛冠状病毒(bovine coronavirus, BCoV)可以引起新生犊牛腹泻、成年牛冬痢和呼吸道疾病，呈世界性流行，给养牛业造成了巨大的经济损失[1]。BCoV属于冠状病毒科，冠状病毒属2a亚群，其基因组长度为27~32 kb，主要包括2个开放阅读框(ORF1a和ORF1b)和编码结构蛋白的5个基因。结构蛋白分别为血凝素酯酶蛋白(HE)、纤毛蛋白(S)、小膜蛋白(E)、跨膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)[2]。S蛋白是一种Ⅰ型膜糖蛋白，该蛋白在病毒的附着及进入宿主细胞过程中具有重要作用，能诱导机体产生中和抗体[3]；HE蛋白可介导病毒颗粒与O-乙酰唾液酸的结合[4]；编码核衣壳蛋白的N基因高度保守，常作为BCoV分子检测的靶基因[2]。
鉴于BCoV危害严重，国外进行了大量血清和病原流行病学调查，结果显示BCoV感染普遍存在[5-6]。在国内，关于奶牛和黄牛冠状病毒的血清流行病学调查资料较多，显示国内BCoV血清阳性率高并且分布广泛[7-9]。目前已经有很多关于BCoV分子检测方法的报道[10-12]，但关于病原流行病学资料很少，仅见对新疆北疆地区奶牛场腹泻样本病原流行病学调查的报道[13]。对牦牛BCoV血清流行病学调查表明，川西北及天山地区血清阳性率很高[14-15]，但还没有见到关于牦牛BCoV病原流行病学资料。本试验的目的是对西藏、青海、四川及云南四个牦牛主产省区进行BCoV病原流行病学调查及分子特征研究，为牦牛腹泻的防控提供参考。
1 材料与方法 1.1 临床样本及细胞系336份3月龄以内牦牛腹泻粪便样本于2015—2017年采集于西藏、青海、四川藏区和云南藏区，其中西藏、青海和云南各60份，四川156份。所有样本于-80 ℃保存备用。分离病毒的HCT-8传代细胞系由本实验室保存；用于分离病毒的样本为采自四川省阿坝藏羌自治州的BCoV阳性的牦牛腹泻粪便样本。
1.2 主要试剂及仪器TrizolTM、Reagent、PrimescriptTM、pMD19-T克隆载体等购于TaKaRa公司；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购于OMEGA公司。DNA Marker、DH5α感受态细胞购于宝生物工程(大连)股份有限公司；1640培养基购自Hyclone公司；胰蛋白酶、胎牛血清购自BI公司；青霉素链霉素双抗、细胞冻存液购自GIBCO公司；戊二醛(25%)购于SIGMA公司；异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔IgG购于Abcam公司；兔抗BCoV重组N蛋白阳性血清由本实验室制备；QIAamp Viral RNA Mini Kit(50)提取试剂盒购于QIAamp公司；Maxima H Minus Double-Stranded cDNA Synthesis Kit购于Thermo Scientific公司；美国Costar细胞刮刀购于上海合星生物科技有限公司；透射电镜Tecnai G2 20(FEI公司，美国)；凝胶成像系统Doc2000(Bio-Rad公司，美国)；荧光倒置显微镜(Olympus Corporation公司，日本)；CO2细胞培养箱(Thermo公司，美国)。
1.3 临床样本的检测采用本实验室前期建立的牛冠状病毒RT-PCR检测方法[16]，对336份临床样本进行检测，检测引物序列：5′-CGAGTTGAACACCCAGAT-3′(F)；5′-GAGACGGGCATCTACACT-3′(R)。随机抽取10%的阳性样本的PCR产物测序，进一步验证检测结果的准确性。
1.4 牦牛源BCoV S1亚基、HE、N基因片段扩增从西藏、青海、四川及云南四省检出的阳性样本各随机选取8个，共计32个样本，自行设计引物，分别扩增牦牛源BCoV S1亚基、HE及N基因片段。扩增S1亚基引物序列：5′-GTTTCTGTTAGCAGGTTTAA -3′(F)；5′-GTCGCATTAACCTCAACAAA - 3′(R)，扩增片段为基因组24 878—25 518位(参考株登录号KX982264.1)，片段大小为641 bp；扩增HE基因片段引物序列：5′-TGATAACCCTCCTACCAATG-3′(F)；5′-AGACAGATTGCTTTAGTGGG-3′(R)，扩增片段为基因组22 334—23 107位(参考株登录号KX982264.1)，片段大小为774 bp。扩增N基因片段引物序列：5′-TCAACCCAAGCAAACTGTCA-3′(FN)；5′-CTGCTTAG-TTACTTGCTGTGGC-3′(RN)，扩增片段为基因组29 445—30 087位(参考株登录号KX982264.1)，片段大小为643 bp，测得序列用于进化树分析。
1.5 病毒的分离培养取适量粪便样本与PBS缓冲液，按照1:5的比例混合涡旋，置于-80 ℃超低温冰箱中反复冻融3次后置于4 ℃的离心机中8 000 r·min-1离心10 min，离心后，吸取上清过0.22 μm的滤膜，滤液置-80 ℃超低温冰箱保存备用；待传代的HCT-8细胞铺满25 cm2细胞瓶时接毒。首先用含终质量浓度2 μg·mL-1胰蛋白酶的Hank's液作用HCT-8细胞2 min，弃液后加入1 mL处理好的临床样本，于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育1 h，再用含终质量浓度1 μg·mL-1胰蛋白酶的维持液(1640培养基)来维持细胞生长，每天观察直至有细胞病变(CPE)产生，待CPE达到70%以上时收毒，进行蚀斑纯化及TCID50测定；若未产生病变，培养96 h后收毒，按照此方法盲传。
1.6 分离毒株的鉴定 1.6.1 RT-PCR鉴定细胞出现CPE后收集病毒，提取总RNA反转录合成cDNA，利用本实验室前期建立的牛冠状病毒检测方法[16]进行验证。
1.6.2 间接免疫荧光鉴定取纯化后的病毒液接种于6孔板，每板3个重复，设置空白对照，加入维持液培养。分别在培养20、40 h后，弃去维持液并用pH 7.4的PBS洗涤3次，每孔加入80%丙酮1 mL，在4 ℃条件下固定10 min，弃掉丙酮后用PBS洗涤3次，每孔加入1 mL 1:400倍稀释的兔抗BCoV重组N蛋白阳性血清作为一抗，37 ℃孵育40 min，弃液后PBS洗涤3次，加入1:1 000倍稀释的羊抗兔IgG作为二抗，每孔1 mL，37 ℃孵育40 min，弃液后用PBS洗涤5次，采用倒置荧光显微镜观察。
1.6.3 透射电镜观察细胞出现CPE后收集病毒，加入终浓度为2.5%的戊二醛3 mL，4 ℃过夜(12 h)，用刮刀刮取已定型的细胞层，用pH为7.2的PBS漂洗3次，锇酸固定2 h后再次用pH为7.2的PBS漂洗3次，丙酮脱水，待包埋剂渗透到细胞后放入包埋板，切片后利用醋酸铀和柠檬酸铅染色，在透射电镜下观察。
1.7 分离株完整S基因克隆与分析自行设计5对引物(见表 1)，对分离株S基因进行分段扩增，采用SeqMan7.0 (version 7.0; DNASTAR, USA)拼接，获得牦牛源BCoV完整S基因序列，进行序列分析。
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表 1 扩增完整S基因的引物信息 Table 1 Primers information for complete S gene amplifying |
对获得的序列采用SeqMan7.0 (version 7.0; DNASTAR, USA)拼接，并在NCBI中进行BLASTN比对；用MEGA6.0中的ClustalW将多个序列比对，并采用邻近法建立核苷酸及氨基酸系统发育树；用DNASTAR7.0中MegAlign (DNASTAR Inc., WI, USA)计算核苷酸和氨基酸相似性；使用SimPlot3.5.1中的7种检测方法(RDP, GeneConv, Chimaera, MaxChi, BootScan, SiScan和3Seq)和RDP 4.0软件进行重组分析。
2 结果 2.1 临床样本中BCoV的检出情况从336份腹泻样本中检出232份BCoV阳性，阳性率为69.05%；其中，西藏检出41份，阳性率为68.33%(41/60)；青海检出43份，阳性率为71.67%(43/60)；四川检出108份，阳性率为69.23%(108/156)；云南检出40份，阳性率为66.67%(40/60)。
2.2 32条S1亚基序列分析克隆的32个牦牛源BCoV的S1亚基核苷酸序列的相似性为99.5%~100.0%，推导的氨基酸序列相似性为99.4%~100.0%；与GenBank中BCoV的S1亚基的核苷酸序列相似性为96.0%~98.6%，推导的氨基酸序列相似性为96.3%~98.8%。进一步分析发现，32个克隆株S1亚基核苷酸与三个泰国株TWD1、TWD2、TWD3有5个核苷酸的共同变异(A1525C、G1529C、T1572C、T1725C、C1733G)，区别于GenBank里所有BCoV S1亚基核苷酸序列。选取GenBank里所有BCoV的S1亚基核苷酸序列建立系统发育树，本试验全部32条序列聚为独立一支，与三个泰国毒株(KX373886.1、KX373887.1、KX373888.1)聚为一大支(图 1)。
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进化树中数字表示遗传距离；●.本试验克隆株 Numbers in evolutionary tree represent genetic distances; ●. Isolates in this study 图 1 BCoV S1亚基片段核苷酸序列进化树 Figure 1 Neighbor-joining tree based on the S1 gene nucleotide sequences of BCoV |
本试验中克隆的32个牦牛源BCoV的HE基因片段核苷酸序列的相似性为96.9%~100.0%，推导的氨基酸序列相似性为97.3%~100.0%；与GenBank中BCoV的HE基因核苷酸序列相似性为96.8%~ 99.9%，推导的氨基酸序列相似性为96.6%~98.2%。系统发育分析表明(图 2)，32条序列所代表克隆株中的29株聚为独立一支，分析发现有1个共有的核苷酸变异(C/T153A)，区别于GenBank里所有BCoV HE序列，包括本试验克隆的其他3条序列；32条序列所代表克隆株中的3株(S2/S5/S6)独立为一小支，其8个核苷酸的共有变异(T60C、A146C、T171C、C190T、C390T、C476A、G639A、T760C)，区别于GenBank里所有BCoV序列，包括本试验中克隆的其他29条序列。
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进化树中数字表示遗传距离；●.本试验克隆株 Numbers in evolutionary tree represent genetic distances; ●. Isolates in this study 图 2 BCoV HE基因片段核苷酸序列进化树 Figure 2 Neighbor-joining tree based on the HE gene nucleotide sequences of BCoV |
克隆的32个牦牛源BCoV的N基因片段核苷酸序列的相似性为99.7%~100.0%，推导的氨基酸序列相似性为99.5%~100.0%；与GenBank中BCoV的N基因核苷酸序列相似性为95.3%~99.4%，推导的氨基酸相似性为98.1%~99.5%。系统发育分析表明(图 3)，全部32条克隆株聚为独立一支，分析发现其有2个共有的核苷酸变异(A158T、C423T)，区别于GenBank里所有BCoV N基因序列。
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进化树中数字表示遗传距离；●.本试验克隆株 Numbers in evolutionary tree represent genetic distances; ●. Isolates in this study 图 3 BCoV N基因片段核苷酸序列进化树 Figure 3 Neighbor-joining tree based on the N gene nucleotide sequences of BCoV |
用HCT-8细胞将病毒盲传至第3代，其中一个毒株在培养48 h出现细胞病变，连续传10代后细胞病变稳定，48 h出现大小不一的空洞，72 h细胞变圆出现拉网状，形成漂流体，对照组无CPE出现。经RT-PCR鉴定为BCoV，利用蚀斑试验纯化，然后按Reed-muech法计算分离株TCID50为10-7.17·0.1 mL-1，将其命名为YAK/HY24/CH/2017。图 4为YAK/HY24/CH/2017株间接免疫荧光照片，分离株感染细胞可见明亮的特异性荧光，荧光细胞的数量和荧光强度随感染时间的延长而增加；图 5为YAK/HY24/CH/2017株透射电镜照片，可以看到直径约75 nm的外周突起排列成皇冠状的病毒颗粒。
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细胞系为HCT-8细胞，A.阴性对照细胞；B.病毒感染后20 h的细胞；C.病毒感染后40 h的细胞 Cultured cells were HCT-8 cells, A. Negative control cell; B. Cells 20 h after virus infection; C. Cells 40 h after virus infection 图 4 YAK/HY24/CH/2017株间接免疫荧光鉴定(400×) Figure 4 Indirect immunofluorescence of YAK/HY24/CH/2017 strain (400×) |
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图 5 YAK/HY24/CH/2017株透射电镜图片 Figure 5 Electron microscopy of yak BCoV strain YAK/HY24/CH/2017 |
经RT-PCR分段扩增后拼接，得到S基因全长为4 092 bp(GenBank登录号：MH741424)，编码1 363个氨基酸，其与U00735.2相似性最高，为98.5%；与KF169923.1最低，为96.5%。利用氨基酸序列建立进化树，分离株完整S基因单独成一支(图 6)。与GenBank里所有BCoV S基因相比较，有13个独特的氨基酸变异，其中，在S1A病毒中和表位有3个氨基酸的变异(A380T、G384R、G400R)，在S1B中和抗体靶位有5个氨基酸的变异(Y525H、T544A、T552C、N575K、S611R)，此外，S1亚基还有2个氨基酸的变异(L/F154V、G239A)，S2亚基有3个氨基酸的变异(T771S、V/A1 100D、E1 354D)。
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进化树中数字表示遗传距离；●.本试验克隆株 Numbers in evolutionary tree represent genetic distances; ●. Isolates in this study 图 6 YAK/HY24/CH/2017株完整S基因编码氨基酸序列进化树 Figure 6 Neighbor-joining tree based on the amino acid sequences encoded by the complete S gene of strain YAK/HY24/CH/2017 |
利用RDP4.0及Simplot3.5.1进行重组分析，结果SimPlot3.5.1以及RDP 4.0(GeneConv, Chimaera, MaxChi, BootScan, SiScan和3Seq)均支持该毒株S基因发生重组事件(置信度为0.569)。利用RDP4.0分析其重组区域位于1 330—1 617 bp，而Simpl ot3.5.1分析其重组区域位于1 310—1 647 bp(图 7)，尽管重组区域略有区别，但都位于诱导中和抗体产生的S1B受体结合域，预测其亲本株是美国株U00735.2和中国新疆株KU886219.1。
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图 7 YAK/HY24/CH/2017株S基因重组分析 Figure 7 Recombinant analysis the S gene of strain YAK/HY24/CH/2017 |
犊牛腹泻是临床上最常见的一类疾病，给养牛业造成了严重的经济损失。犊牛腹泻病因复杂，其中病原微生物感染是造成牛腹泻的重要原因，引起犊牛腹泻的常见病毒有牛冠状病毒、牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒[17-18]，并且有新的致腹泻病毒出现，如诺如病毒、Nebovirus等[19-20]。牦牛是青藏高原特有的物种，世界上共约有1 700万头，90%以上的牦牛都分布在我国境内的青藏高原[21]。牦牛产犊主要集中在4—5月份，犊牛腹泻导致发病率和死亡率都很高，造成严重损失[22]。笔者实验室前期对青藏高原牦牛腹泻样本进行了检测，牛轮状病毒的检出率高达95.00%，是牦牛腹泻的重要病原[23]。本试验首次对青藏高原牦牛腹泻样本进行了BCoV的病原流行病学调查，阳性率高达69.05%，表明BCoV也是青藏高原牦牛腹泻的重要病原。
S蛋白形成BCoV颗粒的包膜突起，介导细胞吸附与膜融合，是BCoV主要的抗原蛋白，与病毒的毒力及组织嗜性有关，病毒的受体识别是病毒感染宿主细胞最重要的一步，也是病毒感染宿主范围和跨物种感染的重要决定因素[24]。由于S基因具有高度变异性，也决定了冠状病毒的抗原性、毒力及组织嗜性的差异性[3]；HE蛋白能通过发挥乙酰酯酶的生物学活性，参与病毒早期吸附[4]；N蛋白参与病毒基因组RNA的复制、亚基因组的转录与翻译是依赖于基因组RNA两末端相结合的结构基础，构成病毒的核衣壳[25]。本试验中作者克隆了西藏、青海、四川和云南四个地区32个阳性样本的BCoV S1亚基、HE及N基因的核苷酸片段，发现32个S1亚基与三个泰国株聚为一支，32条N基因以及29/32条HE基因均独立聚为一支，表明牦牛源BCoV具有独特的遗传共进化趋势，推测可能与青藏高原独特的自然地理环境和牦牛这个特殊宿主有关[26]。
成功分离得到一株致细胞病变的牦牛源BCoV，为进一步研究其生物学特性奠定了基础。利用分离株完整S基因编码氨基酸与GenBank中全部牛源BCoV S基因建立系统发育树并计算遗传距离，分离株聚为独立的一支，与目前GenBank所有的BCoV完整S基因遗传距离显著。该S基因的S1亚基N端1~330区域有2个独特的氨基酸变化(L/F154V、G239A)，区别于GenBank里所有BCoV，该段氨基酸发生替换可能改变冠状病毒的趋向性，诱使病毒在浸染或致病性上发生改变[27]；BCoV S基因S1亚基的第351~403和517~621位区域分别包含S1A和S1B中和抗体靶位[3]，与GenBank里所有BCoV相比，YAK/HY24/CH/2017株S1A区域有3个氨基酸发生变异(A380T、G384R、G400R)，且S1B区域有5个氨基酸发生变异(Y525H、T544A、T552C、N575K、S611R)，其生物学意义有待进一步研究；S2亚基共有3个氨基酸发生变异(T771S、V/A1 100D、E1 354D)，有可能导致亲水性增加，影响病毒复制的速度或诱导细胞产生病变的类型发生改变[28]。综上所述，本试验中分离的牦牛源BCoV YAK/HY24/CH/2017株的S蛋白变异很大，因此，该毒株的生物学特性值得进一步研究。
有意思的是，利用RDP4.0及Simplot3.5.1进行重组分析发现，BCoV分离株YAK/HY24/CH/2017 S基因1 310—1 647 bp区域出现重组，其亲本株是美国株U00735.2和中国新疆株KU886219.1，这对进一步研究牦牛源BCoV的遗传进化有参考意义。本试验分离株YAK/HY24/CH/2017的重组区域与文献报道的BCoV重组区域一致[29]。事实上，关于其他冠状病毒的重组事件已有大量报道[30-31]。由于冠状病毒聚合酶基因nsp14有限的校对能力导致较高的突变率、独特的RNA复制机制即拷贝选择“copy choice”机制能诱导冠状病毒发生同源RNA重组，且冠状病毒基因组是RNA病毒中最大的，故易发生异源重组[32]。
4 结论病原流行病学调查结果显示青藏高原地区牦牛腹泻粪便样本中BCoV阳性率很高，是牦牛腹泻的重要病原；遗传进化分析表明，牦牛源BCoV S、HE和N基因均有独特遗传进化趋势；首次分离得到牦牛源冠状病毒，该毒株S基因发生了重组事件。
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