, HUANG Yongjun, FAN Weihong, WEN Dongmei, SHEN Penglei, PAN Erke, LU Fenghua*
, SHI Deshun*
水牛是中国宝贵的家畜品种资源，其优点：耐粗饲、饲料转化率高、乳品质的营养价值高，被认为有着很好的经济价值和良好的发展前景。但水牛繁殖率低是制约水牛奶业发展的一大障碍。因此，目前主要运用先进的繁殖生物技术如体外受精、体细胞核移植、转基因等胚胎体外生产技术结合胚胎移植来进行改良，但应用这些胚胎生物技术的最基本前提是需要大量体外成熟卵母细胞。然而卵母细胞发育成熟受卵泡内外环境等多种因素的影响，且其发育是十分复杂的过程，对其产生、生长发育和成熟的分子机理尚不十分清楚, 导致卵母细胞的体外成熟质量不高，质量差的卵母细胞则会直接影响后续胚胎的发育[1]。
褪黑素主要是由松果腺合成的一种色氨酸的衍生物，其它松果腺以外的组织都可以产生[2]。褪黑激素对不同物种胚胎体外培养的影响也已有报道[3-6]。在胚胎培养液中添加褪黑素，不但增加了小鼠受精胚胎的分裂率和囊胚率[7]，而且可以保护丙二酚引起的小鼠卵母细胞质量下降[8]。Rodriguez-Osorio等[4]发现，在培养液中添加10-9 mol·L-1 MT对猪体外胚胎的受精率和胚胎率有促进作用。尽管囊胚率没有增加，但囊胚细胞的数量明显要高于对照组。当从猪卵泡中获得的卵母细胞用10-7 mol·L-1 MT处理后，其受精率、囊胚率以及囊胚细胞数均高于未加褪黑素组[9]。在牛的体外成熟培养基中添加一定浓度的褪黑素，可以促进细胞器的正常分布、GSH和ATP含量增加、抗氧化基因表达水平的提高，进而促进卵母细胞受精和发育能力[10]。在牛和羊的卵母细胞上存在着褪黑素的MT1和MT2受体，并且受体也存在于羊的卵丘和颗粒细胞上[10-11]。也有报道称免疫细胞和其它器官的一系列细胞系上也存在受体MT1和MT2的现象。褪黑素在卵巢上功能的发挥是通过膜受体介导的[12]。由于褪黑素受体可通过G蛋白偶联受体介导的信号抑制cAMP生成和促进cGMP合成[13-14]，而cAMP和cGMP对调节卵母细胞减数分裂起着重要的作用[15-16]。因此，本研究通过在成熟液中添加褪黑素，以期能够促进水牛卵母细胞成熟，同时结合褪黑素MT1和MT2受体，探究MT1和MT2受体介导褪黑素影响卵母细胞成熟的作用机制，为改善水牛卵母细胞成熟的机制提供一定的理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料与试剂褪黑素、褪黑素受体拮抗剂、褪黑素受体激动剂和二甲基亚砜(Sigma公司)；褪黑素受体抗体MT1和MT2(Santa Cruz公司)；二抗(山羊抗兔IgG购自Upstate Biotechnology公司)；青霉素、链霉素、TCM-199(Gibco公司)；cAMP检测试剂盒(BioVision)；其它液体配制所需的试剂均购于Sigma公司。褪黑素溶液：褪黑素0.011 6 mg溶于1 mL无水乙醇中，再用DPBS或HEPES缓冲液定容至50 mL制成浓储液，后用成熟液稀释至所需浓度(10-9、10-8、10-7 mol·L-1)；褪黑素受体拮抗剂溶液：褪黑素受体拮抗剂0.043 9 mg溶于1 mL二甲基亚砜，再用PBS定容至15 mL，用成熟液稀释至所需浓度(10-8 mol·L-1)；褪黑素受体激动剂：褪黑素受体激动剂0.052 3 mg溶于1 mL二甲基亚砜，再用PBS定容至15 mL，后用成熟液稀释至所需浓度(10-8 mol·L-1)。
1.2 水牛卵母细胞收集及成熟水牛卵巢采自南宁市屠宰场。用12号10 mL一次性注射器选取直径为2~6 mm的卵泡抽取卵泡液，卵泡液置于60 mm玻璃皿中。在体视显微镜下将卵丘-卵母细胞复合体(COCs)捡出，经洗卵液洗干净后，放入含1.5 mL成熟液(M)的小玻璃培养皿中，或根据试验设计，放置于各处理组中，于38.5 ℃，5% CO2的培养箱中培养22~24 h后，统计卵母细胞成熟率。卵母细胞成熟以观察到第一极体排出为标准。洗卵液(CCM)：4.75 g TCM-199+0.6 g Hepes +0.45 g NaCl +0.2 g NaHCO3+0.05 g链霉素+0.03 g青霉素+10~15 mL新生犊牛血清(NCS)，三蒸水定容至500 mL。成熟液(M): 9.5 g·L-1TCM-199+5 mmol·L-1Hepes+ 26.2 mmol·L-1 NaHCO3+60 mg·L-1青霉素+100 mg·L-1链霉素+5%发情牛血清(OCS)+ 0.1 μg·mL-1FSH。液体配制pH7.2~7.4，0.22 μm过滤器除菌，分装, 4 ℃保存。
1.3 水牛卵母细胞体外受精及胚胎培养各试验组成熟后的COCs用200 μL移液枪于胚胎培养液(CM)中吹打干净卵丘细胞(卵丘细胞悬液用于制作20 μL胚胎培养小滴，以培养油覆盖做成培养盘)，每滴15个卵母细胞放入20 μL的受精液(F液)液滴(培养油覆盖)中。从液氮罐中取出水牛冻精液，于37.5 ℃水中解冻，镜检精子活率。精液缓慢加入到已平衡2 mL受精液的5 mL圆底试管中，放入恒温培养箱中30 min，使精子上游。30 min后，用移液枪吸出1.5 mL含上游精子的F液上清，置于另一预温的离心管中，封口胶封口，室温1 200 r·min-1离心5 min后，弃上清，轻轻混匀沉淀，用捡卵针吸取适量的精子打入含有卵母细胞的F液微滴中。放入温度38.5 ℃、5% CO2的培养箱中进行受精24 h。在CM液中经移液枪将黏附卵母细胞的精子吹掉，将15~20个受精的卵母细胞移到胚胎培养盘中的微滴进行培养，每隔24 h以CM液进行半量换液，48 h后统计其分裂率，7 d统计囊胚率。胚胎培养液(CM): 9.5 g·L-1TCM-199+5 mmol·L-1Hepes +26.2 mmol·L-1 NaHCO3 +60 mg·L-1青霉素+100 mg·L-1链霉素+3%发情牛血清(OCS)；受精液(F液)：TALP基础液+ 0.6 %BSA+50 mg·L-1肝素+2.5 mmol·L-1咖啡因。液体配制后，调pH7.2~ 7.4，0.22 μm过滤器除菌，分装，4 ℃保存。
1.4 免疫荧光检测水牛卵丘-卵母细胞上MT1和MT2的表达将成熟前收集的水牛COCs或成熟前已吹掉卵丘细胞的卵母细胞置于T-BSA-PBS溶液中
清洗5 min，重复3次；移入4%多聚甲醛中室温固定至少30 min；阻断液洗3次，每次5 min，终止固定；放入1% Triton X-100中透化15 min，用阻断液洗3次，每次5 min；1% BSA封闭处理1 h，放入T-BSA-PBS中洗3次，每次5 min；4 ℃孵一抗过夜；第2天将其放入培养箱中恢复30 min，用T-BSA-PBS中洗3次，每次5 min；避光，孵二抗，室温1.5 h；避光，放入T-BSA-PBS中洗3次，每次5 min。碘化丙啶(PI)染色5 min后，用T-BSA-PBS洗3次，每次5 min；最后，将COCs和卵母细胞放在载玻片上，加入适量抗淬灭剂，用凡士林封片。在荧光显微镜下观察染色结果、拍照并记录结果。其中受体MT1和MT2兔抗一抗和羊抗兔二抗，在488 nm波长下，观察二抗显示，FITC信号阳性为绿色；在543 nm波长下，观察PI信号，阳性为红色。
1.5 卵母细胞cAMP和cGMP含量的检测分别收集体外成熟培养24 h后的褪黑素处理组和未处理组水牛COCs，用200 μL的移液枪反复轻柔地吹打掉卵母细胞周围的颗粒细胞，分别挑出30个排出第一极体的卵母细胞，用PBS洗3遍，然后，用自制捡卵针尽量少带液体吸取卵母细胞，放入含10 μL的细胞裂解液200 μL EP管中。按照说明书进行操作。试验重复3次。
1.6 试验设计 1.6.1应用免疫荧光染色方法分别检测成熟培养前水牛COCs和卵母细胞上褪黑素受体MT1和MT2的表达情况。
1.6.2同一批水牛GV期COCs随机分为4组，分别在添加了不同浓度褪黑素(0、10-9、10-8、10-7 mol·L-1)的成熟液中体外成熟培养24 h，统计各组成熟率；同时，成熟后的卵母细胞分别进行体外受精，并统计其分裂率和囊胚率。
1.6.3同一批水牛GV期COCs随机分为4组，分别在添加了根据试验1.6.2筛选的最优浓度10-8 mol·L-1褪黑素(10-8 mol·L-1 MT)、同等浓度褪黑素受体拮抗剂(10-8 mol·L-1 LZU)、同等浓度褪黑素受体激动剂(10-8 mol·L-1 IIK7)、同时添加褪黑素受体拮抗剂和褪黑素(10-8 mol·L-1 LZU+10-8 mol·L-1 MT)的成熟液中体外成熟培养24 h，统计卵母细胞第一极体排出率(成熟率)；同时，成熟后的卵母细胞分别进行体外受精，并统计其分裂率和囊胚率。
1.6.4分别收集体外成熟培养24 h后的最优浓度(10-8 mol·L-1)褪黑素处理组、未处理组、褪黑素受体拮抗剂(10-8 mol·L-1 LZU)处理组及同时添加褪黑素和褪黑素受体拮抗剂组(10-8 mol·L-1 LZU+10-8 mol·L-1 MT)的水牛COCs，用200 μL的移液枪反复轻轻地吹打掉卵母细胞周围的颗粒细胞，分别挑出30个排出第一极体的卵母细胞进行ELISA Kit检测。
1.7 数据分析数据使用生物统计分析软件SPSS 17.0进行差异显著性检验。每个试验至少重复3次。P<0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著，P<0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 褪黑素受体在卵丘细胞和卵母细胞上的表达分析成熟培养前水牛COCs和卵母细胞上褪黑素受体MT1和MT2的表达见图 1，MT1和MT2在水牛卵丘细胞和卵母细胞上(COCs)均有表达。
|
A.褪黑素受体MT1在水牛卵丘细胞上免疫荧光染色；B.褪黑素受体MT2在水牛卵丘细胞上免疫荧光染色; C.褪黑素受体MT1在水牛卵母细胞上免疫荧光染色; D.褪黑素受体MT2在水牛卵母细胞上免疫荧光染色 A.Immunofluorescence staining of melatonin receptor MT1 in cumulus cells; B. Immunofluorescence staining of melatonin receptor MT2 in cumulus cells; C.Immunofluorescence staining of melatonin receptor MT1 in oocytes; D. Immunofluorescence staining of melatonin receptor MT2 in oocytes 图 1 褪黑素受体MT1和MT2分别在水牛卵丘细胞和卵母细胞上的表达(100×) Figure 1 The expression of melatonin receptor MT1 and MT2 respectively in the cumulus cells and oocytes in buffalo(100×) |
各组极体排出率结果见表 1：成熟液添加不同浓度(10-9、10-8、10-7 mol·L-1)的褪黑素均能显著提高水牛卵母细胞的极体排出率(成熟率)(P＜0.05)，而当浓度为10-8 mol·L-1时，卵母细胞的极体排出率达到最高，且显著高于10-9和10-7 mol·L-1 (P＜0.05)。
|
表 1 不同浓度褪黑素对水牛卵母细胞极体排出率的影响 Table 1 The effect of different concentrations of melatonin adding to IVM medium on the first polar body exhaust rates of buffalo oocytes |
各处理中分裂率和囊胚率见表 2：在成熟液中添加不同浓度(10-9、10-8、10-7 mol·L-1)的褪黑素能显著提高水牛卵母细胞受精后胚胎的分裂率(P＜0.05)；而且10-8和10-7 mol·L-1组的胚胎发育到囊胚的百分率显著高于对照组(P＜0.05)，但10-9 mol·L-1组的囊胚率与对照组相比差异不显著(P>0.05)。
|
|
表 2 不同浓度褪黑素对水牛卵母细胞成熟早期胚胎发育的影响 Table 2 The effect of different concentrations of melatonin adding to IVM medium on buffalo early embryos development |
表 3表明：在成熟液中添加褪黑素受体拮抗剂(10-8 mol·L-1 LZU组)，卵母细胞成熟后的极体排出率与未添加组相比差异不显著(P>0.05)；在成熟液中单独添加褪黑素(10-8 mol·L-1 MT组)或同等浓度的褪黑素受体激动剂(10-8 mol·L-1 IIK7组)，其卵母细胞成熟后的极体排出率均显著高于未添加组(P＜0.05)；但10-8 mol·L-1 MT和10-8 mol·L-1 IIK7两组之间的极体排出率差异不显著(P>0.05)。在成熟液中同时添加褪黑素和褪黑素受体拮抗剂(10-8 mol·L-1 LZU+10-8 mol·L-1 MT组)，卵母细胞成熟后的极体排出率与未添加组相比，差异不显著(P>0.05)。
|
|
表 3 褪黑素及其受体激动剂和拮抗剂对水牛卵母细胞极体排出率的影响 Table 3 The effect of melatonin, melatonin receptor antagonist and agonist adding to IVM medium on the first polar body exhaust rates of buffalo oocytes |
各处理组早期胚胎的分裂率和囊胚率统计结果见表 4：在成熟液中添加褪黑素受体拮抗剂(10-8 mol·L-1 LZU)，水牛卵母细胞成熟受精后胚胎的分裂率和囊胚率与未添加组相比，差异不显著(P>0.05)。然而，在成熟液中单独添加褪黑素组(10-8 mol·L-1 MT)或同等浓度的褪黑素受体激动剂(10-8 mol·L-1IIK7)，卵母细胞受精后的分裂率和囊胚率均显著高于未添加组(P＜0.05)，且10-8 mol·L-1MT和10-8 mol·L-1IIK7之间的分裂率和囊胚率差异不显著(P>0.05)。但在10-8 mol·L-1LZU+10-8 mol·L-1MT处理组，水牛卵母细胞受精后胚胎的分裂率和囊胚率与未添加组相比，差异不显著(P>0.05)。
|
|
表 4 褪黑素及其受体激动剂和拮抗剂对水牛卵母细胞早期胚胎发育能力的影响 Table 4 The effect of melatonin, melatonin receptor antagonist and agonist adding to IVM medium on buffalo early embryos development |
各处理组cAMP和cGMP含量检测结果(图 2)显示：在成熟液中添加10-8 mol·L-1褪黑素显著降低水牛卵母细胞内cAMP的含量，显著增加了cGMP的含量；但在单独添加10-8 mol·L-1褪黑素受体拮抗剂和同时添加10-8 mol·L-1褪黑素与10-8 mol·L-1褪黑素受体拮抗剂对水牛卵母细胞内cAMP和cGMP的含量均无显著影响。
|
不同字母代表组间差异显著(P<0.05) The different letters mean significant difference among different groups (P<0.05) 图 2 褪黑素处理对水牛卵母细胞成熟后cAMP和cGMP含量的影响 Figure 2 The effect of melatonin on cAMP and cGMP levels after buffalo oocyte maturation |
褪黑素在有机体内有很多的功能。比如，改善睡眠[17-18]、提高免疫力[18-19]、调节血压[20-21]、调节季节性繁殖[12, 22]、抗肿瘤[23]、抗抑郁[24]、抗氧化、抗衰老等。哺乳动物卵巢中存在褪黑素的两种膜受体及核受体。褪黑素在卵巢中的部分功能是通过膜受体介导的[25]。主要是通过与G蛋白偶联膜受体MT1和MT2结合，抑制了cAMP合成实现[12]。同时，褪黑素也能与核受体RZR/RORa结合，进而引起RZR调控元件结合p21和5-脂氧合酶等基因的启动子，从而调控转录[14]。总之，褪黑素发挥部分功能的关键在于膜上是否存在受体。
本试验采用免疫荧光染色的方法检测了水牛卵母细胞和卵丘细胞上是否存在两种受体，结果表明，水牛卵丘细胞和卵母细胞上均存在褪黑素受体。该结果与相关报道一致[16, 26-28]。牛卵母细胞上均存在MTl和MT2受体，但是在体外生产的牛囊胚中只有MTl存在[26]。猪卵丘细胞与颗粒细胞上均存在褪黑素受体[16]。许多动物(包括人)生殖器官中都存在褪黑素受体[27]。牛卵丘细胞和卵母细胞上均存在MT1受体，而MT2受体只存在牛卵母细胞上[28]。
因此，褪黑激素受体在水牛卵母细胞和卵丘细胞上的表达，可能是褪黑素通过受体信号通路来提高水牛卵母细胞成熟的作用机制。在对其是否通过MT1受体或MT2受体介导完成研究中，本试验使用了褪黑素受体激动剂和褪黑素受体拮抗剂，来探究褪黑素功能的发挥是否依赖于其受体。褪黑素受体激动剂(IIK7)是一种非选择性的激动剂，它能激活褪黑素受体，从而起到类似褪黑素的作用。而褪黑素受体拮抗剂(LZU)则能抑制褪黑素发挥作用。试验结果发现，褪黑素受体激动剂提高了水牛卵母细胞体外成熟率及体外受精后的胚胎发育率和囊胚率，而褪黑素受体拮抗剂对水牛卵母细胞体外成熟率及体外受精后的胚胎发育率和囊胚率没有显著影响，且同时添加10-8 mol·L-1LZU+10-8 mol·L-1MT组水牛卵母细胞的成熟率及体外受精后的胚胎发育率和囊胚率与对照组相比，也没有显著影响，这说明褪黑素受体拮抗剂能阻断褪黑素的促进作用，褪黑素促进水牛卵母细胞体外成熟及体外受精后胚胎发育能力的作用是通过受体介导完成的。这与汪锋[13]研究褪黑素对牛卵母细胞体外成熟机制时的结果一致。但褪黑素受体拮抗剂对水牛卵母细胞体外成熟率及体外受精后胚胎的发育能力没有显著影响，这可能与选择的褪黑素受体拮抗剂的浓度有关。由于褪黑素受体可通过G蛋白偶联受体介导的信号抑制cAMP的生成和促进cGMP的合成实现[11, 13]，而cAMP和cGMP对调节卵母细胞减数分裂起着重要的作用[15-16]。所以本试验采用试剂盒检测了卵母细胞cAMP和cGMP的含量，结果发现褪黑素的添加减少了卵母细胞内的cAMP水平，而提高了cGMP水平，在添加了褪黑素受体拮抗剂之后，对卵母细胞cAMP和cGMP水平均没有影响。这与上述结果一致。说明褪黑素作用的发挥是通过受体介导从而抑制卵母细胞cAMP的生成和促进卵母细胞cGMP的合成而实现的。其他研究也发现，褪黑素介导猪COCs成熟及后期胚胎发育过程，可能与讨音猬因子(shh)信号转导通路存在一定的关系[29]，因此，结合褪黑素功能多样性，其可能还存在其他相关机制仍需继续研究。
4 结论在水牛卵丘细胞和卵母细胞上均存在褪黑素受体MT1和MT2；在水牛成熟液中添加适当浓度(10-8 mol·L-1)的褪黑素有利于水牛卵母细胞的体外成熟及其胚胎发育；褪黑素通过与卵母细胞和卵丘细胞上的褪黑素受体结合，抑制了卵母细胞cAMP生成和促进了卵母细胞cGMP的合成。
| [1] |
黄雅琼, 石德顺, 张晓溪, 等. 猪卵母细胞体外成熟过程中的减数分裂进程[J]. 中国细胞生物学学报, 2010, 32(1): 84–90.
HUANG Y Q, SHI D S, ZHANG X X, et al. The meiotic progress of porcine oocytes matured in vitro[J]. Chinese Journal of Cell Biology, 2010, 32(1): 84–90. (in Chinese) |
| [2] | IVANOVA T N, IUVONE P M. Melatonin synthesis in retina:Circadian regulation of arylalkylamine N-acetyltransferase activity in cultured photoreceptor cells of embryonic chicken retina[J]. Brain Res, 2003, 973(1): 56–63. |
| [3] | PAPIS K, POLESZCZUK O, WENTA-MUCHALSKA E, et al. Melatonin effect on bovine embryo development in vitro in relation to oxygen concentration[J]. J Pineal Res, 2007, 43(4): 321–326. DOI: 10.1111/jpi.2007.43.issue-4 |
| [4] | RODRIGUEZ-OSORIO N, KIM I J, WANG H, et al. Melatonin increases cleavage rate of porcine preimplantation embryos in vitro[J]. J Pineal Res, 2007, 43(3): 283–288. DOI: 10.1111/jpi.2007.43.issue-3 |
| [5] | TIAN X Z, WEN Q, SHI J M, et al. Effects of melatonin on in vitro development of mouse two-cell embryos cultured in HTF medium[J]. Endocr Res, 2010, 35(1): 17–23. DOI: 10.3109/07435800903539607 |
| [6] |
姜园园, 张宝修, 孙婧陶, 等. 褪黑素对小鼠卵母细胞氧化应激及孤雌发育的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2013, 44(7): 1037–1042.
JIANG Y Y, ZHANG B X, SUN J T, et al. The effect of melatonin on the oxidative stress of oocyte and parthenogenetic development in mouse[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2013, 44(7): 1037–1042. (in Chinese) |
| [7] | TAMURA H, TAKASAK A, TAKETANI T, et al. The role of melatonin as an antioxidant in the follicle[J]. J Ovarian Res, 2012, 5(1): 5. DOI: 10.1186/1757-2215-5-5 |
| [8] | ZHANG M Q, DAI X X, LU Y J, et al. Melatonin protects oocyte quality from Bisphenol A-induced deterioration in the mouse[J]. J Pineal Res, 2017, 62(3): e12396. DOI: 10.1111/jpi.2017.62.issue-3 |
| [9] | SHI J M, TIAN X Z, ZHOU G B, et al. Melatonin exists in porcine follicular fluid and improves in vitro maturation and parthenogenetic development of porcine oocytes[J]. J Pineal Res, 2009, 47(4): 318–323. DOI: 10.1111/jpi.2009.47.issue-4 |
| [10] | ZHAO X M, WANG N, HAO H S, et al. Melatonin improves the fertilization capacity and developmental ability of bovine oocytes by regulating cytoplasmic maturation events[J]. J Pineal Res, 2018, 64(1): e12445. DOI: 10.1111/jpi.2018.64.issue-1 |
| [11] | TIAN X Z, WANG F, ZHANG L, et al. Beneficial effects of melatonin on the in vitro maturation of sheep oocytes and its relation to melatonin receptors[J]. Int J Mol Sci, 2017, 18(4): 834. DOI: 10.3390/ijms18040834 |
| [12] | REITER R J, TAN D X, MANCHESTER L C, et al. Melatonin and reproduction revisited[J]. Biol Reprod, 2009, 81(3): 445–456. DOI: 10.1095/biolreprod.108.075655 |
| [13] |
汪锋.白藜芦醇和褪黑素对卵母细胞成熟及胚胎发育的作用机制[D].北京: 中国农业大学, 2014.
WANG F.Mechanisms of resveratrol and melatonin on oocyte maturation and embryo development[D].Beijing: China Agricultural University, 2014.(in Chinese) http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10019-1014225961.htm |
| [14] | JUNG B, AHMAD N. Melatonin in cancer management:Progress and promise[J]. Cancer Res, 2006, 66(20): 9789–9793. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-06-1776 |
| [15] | NAIK E, DIXIT V M. Mitochondrial reactive oxygen species drive proinflammatory cytokine production[J]. J Exp Med, 2011, 208(3): 417–420. DOI: 10.1084/jem.20110367 |
| [16] | KANG J T, KOO O J, KWON D K, et al. Effects of melatonin on in vitro maturation of porcine oocyte and expression of melatonin receptor RNA in cumulus and granulosa cells[J]. J Pineal Res, 2009, 46(1): 22–28. DOI: 10.1111/jpi.2008.46.issue-1 |
| [17] | FISHER S P, DAVIDSON K, KULLA A, et al. Acute sleep-promoting action of the melatonin agonist, ramelteon, in the rat[J]. J Pineal Res, 2008, 45(2): 125–132. DOI: 10.1111/jpi.2008.45.issue-2 |
| [18] | VAN GEIJLSWIJK I M, KORZILIUS H P L M, SMITS M G. The use of exogenous melatonin in delayed sleep phase disorder:A meta-analysis[J]. Sleep, 2010, 33(12): 1605–1614. DOI: 10.1093/sleep/33.12.1605 |
| [19] | CARRILLO-VICO A, REITER R J, LARDONE P J, et al. The modulatory role of melatonin on immune responsiveness[J]. Curr Opin Investig Drugs, 2006, 7(5): 423–431. |
| [20] | GUERRERO J M, REITER R J. Melatonin-immune system relationships[J]. Curr Top Med Chem, 2002, 2(2): 167–179. DOI: 10.2174/1568026023394335 |
| [21] | SIMKO F, PECHANOVA O. Potential roles of melatonin and chronotherapy among the new trends in hypertension treatment[J]. J Pineal Res, 2009, 47(2): 127–133. DOI: 10.1111/jpi.2009.47.issue-2 |
| [22] | REITER R J. Circannual reproductive rhythms in mammals related to photoperiod and pineal function:A review[J]. Chronobiologia, 1974, 1(4): 365–395. |
| [23] | COS S, GONZÁLEZ A, MARTÍNEZ-CAMPA C, et al. Estrogen-signaling pathway:A link between breast cancer and melatonin oncostatic actions[J]. Cancer Detect Prev, 2006, 30(2): 118–128. DOI: 10.1016/j.cdp.2006.03.002 |
| [24] | DRÖGE W. Free radicals in the physiological control of cell function[J]. Physiol Rev, 2002, 82(1): 47–95. DOI: 10.1152/physrev.00018.2001 |
| [25] | REITER R J, ROSALES-CORRAL S A, MANCHESTER L C, et al. Peripheral reproductive organ health and melatonin, ready for prime time[J]. Int J Mol Sci, 2013, 14(4): 7231–7272. DOI: 10.3390/ijms14047231 |
| [26] | SAMPAIO R V, CONCEICAO D S B, MIRANDA M S, et al. MT3 melatonin binding site, MT1 and MT2 melatonin receptors are present in oocyte, but only MT1 is present in bovine blastocyst produced in vitro[J]. Reprod Biol Endocrinol, 2012, 10: 103. DOI: 10.1186/1477-7827-10-103 |
| [27] | WOO M M, TAI C J, KANG S K, et al. Direct action of melatonin in human granulosa-luteal cells[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2001, 86(10): 4789–4797. DOI: 10.1210/jcem.86.10.7912 |
| [28] | EL-RAEY M, GESHI M, SOMFAI T, et al. Evidence of melatonin synthesis in the cumulus oocyte complexes and its role in enhancing oocyte maturation in vitro in cattle[J]. Mol Reprod Dev, 2011, 78(4): 250–262. DOI: 10.1002/mrd.v78.4 |
| [29] | LEE S, JIN J X, TAWEECHAIPAISANKUL A, et al. Melatonin influences the sonic hedgehog signaling pathway in porcine cumulus oocyte complexes[J]. J Pineal Res, 2017, 63(3): e12424. DOI: 10.1111/jpi.2017.63.issue-3 |