2. 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所, 儋州 571737;
3. 海南大学热带农林学院, 海口 570228;
4. 海南传味番鸭养殖有限公司, 文昌 571326;
5. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193
, XU Tieshan2, LIN Zhemin1, ZHAO Jianguo3, LIN Peng4, YANG Shaoxiong1, LIN Dajie1, HOU Shuisheng5
2. Tropical Crops Genetic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou 571737, China;
3. Institue of Tropical Agriculture and Forestry, Hainan University, Haikou 570228, China;
4. Hainan Chuanwei Muscovy Breeding Ltd., Wenchang 571326, China;
5. Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China
miR-21是miRNA家族的重要成员，是最早鉴定出的哺乳动物miRNAs之一，在人miRNAs功能研究中发挥了重要作用。2001年，Lagos-Quintana等[1]证实，miR-21类似于lin-4和let-7，同时存在于非脊椎动物和脊椎动物中。Mourelatos等[2]从人和小鼠的神经元细胞、人宫颈癌细胞系HeLa中分别鉴定出miR-21。许多学者[3-6]发现，miR-21在多数肿瘤组织中高表达，可作为临床医学诊断学中的一个潜在药物靶标。miR-21可正向促进不同类型癌细胞的增殖，进而加速癌症的发展，同时还能影响肿瘤细胞的细胞周期、DNA损伤修复、细胞凋亡和细胞自噬等[7-9]。在肿瘤细胞的放射治疗过程中，miR-21对放射源的敏感性和耐受性也有一定影响。miR-21还促进心肌肥大导致的心功能衰竭病人成肌纤维增殖[10]和哮喘病人气道平滑肌细胞增殖等[11]。关于miR-21对骨骼肌细胞影响的研究也已有报道，Zuo等[12]发现，miR-21是猪骨骼肌内的重要差异表达microRNA，白立景[13]揭示miR-21能够促进小鼠成肌细胞增殖并抑制其凋亡。
本课题组前期研究表明，北京鸭胚胎发育第19天(E19)胸肌发育最快[14]，同时发现，miR-21在E19胸肌内高表达，且与骨骼肌发育正向调控因子MRF4和MyoG表达趋势一致，与负向调控因子MSTN表达趋势相反[15]。因此，假设miR-21具有促进北京鸭骨骼肌发育的作用。为了验证这种假设，本试验开展了鸭miR-21的分子特征研究及其在胚胎期北京鸭组织中的时空表达模式和对鸭卫星细胞增殖与分化的影响等，以期阐明miR-21对北京鸭骨骼肌发育的作用，为深入探讨鸭骨骼肌发育机制提供基础支撑。
1 材料与方法 1.1 miR-21成熟序列及其前体序列的确定与保守性分析miR-21的成熟序列来自前期的研究结果[15](序列号为PRJNA098308, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)。将miR-21成熟序列与Ensembl数据库中鸭的参考基因组比对，发现该成熟序列可与鸭ENSAPLG00000000474基因的部分序列匹配，根据对该基因的注释结果确定miR-21的前体序列及其二级结构。在miRbase (http://www.mirbase.org/index.shtml)中搜索其他物种的miR-21成熟序列，应用Clustal X软件研究鸭miR-21成熟序列的保守性；在microbrewer (http://people.csail.mit.edu/akiezun/microRNAviewer/index.html)中下载其他物种miR-21的前体序列，与已得到的鸭前体序列一起运用Mega 6.6制作miR-21前体序列进化树，确定其保守性。
1.2 试验样品的采集试验用北京鸭胚胎来自中国农业科学院北京畜牧兽医研究所。选取180枚重量为(98±5) g的鸭蛋，相同条件孵化。从孵化第11天到第27天每天取3枚鸭蛋(分别表示为：E11、E12、E13……E26、E27)。无菌状态下逐只收集鸭胚胸肌样品2份，用于miR-21、其靶基因以及其靶蛋白表达量的研究。E27时另取3只鸭胚逐只采集腿肌、心、肝、肾、肌胃、小肠、腹脂和皮脂，研究miR-21的组织表达特征。所有样品采集后迅速放入液氮内保存并带回实验室放入－80 ℃超低温冰箱保存、待用。
1.3 鸭各组织及骨骼肌卫星细胞的RNA提取及反转录Trizol法分别提取鸭组织和骨骼肌卫星细胞的总RNA，核酸测定仪确定RNA的浓度和纯度。按照TaKaRa的PrimeScript RT reagent Kit(Perfect Real Time)试剂盒说明书进行反转录。
1.4 Stem-loop RT-PCR、qRT-PCR和引物合成根据鸭miR-21成熟序列设计颈环反转录引物和miR-21 RT-PCR引物，内参基因为U6，反转录方法同1.3。miR-21的RT-PCR操作按照荧光定量试剂盒FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)说明书进行。荧光定量PCR仪为Icycler IQ5(Multicolor Real-Time PCR Detection System)。qRT-PCR操作方法同miR-21的RT-PCR，β-actin为内参。应用Primer primer 5.0软件设计引物，由上海生物工程有限公司合成，引物序列见表 1。
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表 1 引物序列 Table 1 Sequence of primers used in this study |
分离培养：取孵化10 d的北京鸭胸大肌组织，采用混合酶消化法和差速贴壁法分离和纯化骨骼肌卫星细胞，用特异性标志Pax7免疫荧光鉴定分离到的细胞。
增殖培养：以DMEM + 10%胎牛血清(FBS)+1%双抗为培养基，在37 ℃、5% CO2的条件下进行鸭骨骼肌卫星细胞系(ATCC公司)的增殖培养。当细胞密度达到70%~80%时，用0.25%胰酶消化传代，继续培养。当细胞密度达到40%~50%时，弃去培养基，更换为OPTI，培养4 h后进行转染。
诱导分化：37 ℃，5% CO2条件下，10%胎牛血清的DMEM生长培养基(GM)培养鸭骨骼肌卫星细胞成肌细胞。当细胞密度达到70%时，0.25%胰酶消化，接种细胞到新的培养皿。细胞密度达到90%时换成含有2%马血清的DMEM分化培养基(DM)，诱导成肌分化。
1.6 miR-21模拟物、抑制物转染鸭原代骨骼肌卫星细胞miR-21模拟物(Agomir)和模拟物对照(negative control，NC)为双链，抑制物(Antagomir)和抑制物对照(inhibitor negative control，INC)为单链，均由广州锐博公司合成，序列如表 2所示。Agomir、NC、Antagomir和INC每管均为1 OD，使用前先用125 μL的DEPC水溶解，得到20 μmol·L-1的溶液，－20 ℃保存。
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表 2 miR-21模拟物、模拟物对照、抑制物和抑制物对照序列 Table 2 The sequences of miR-21 Agomir, NC, Antagomir and INC |
培养鸭原代骨骼肌卫星细胞，并接种到12孔板中。转染前4 h预先用1 mL OPTI饥饿处理。转染时，分别用250 μL OPTI溶解2 μL miR-199a-3p Agomir (NC、Antagomir和INC)，用250 μL OPTI溶解2 μL Lipofectamine® 2000(罗氏)，轻轻混匀，室温下静置30 min。然后将这两种混合物混合在一起，轻轻吹打均匀，室温下静置20 min。将上述混合液均匀滴加到细胞培养体系中，轻轻前后左右摇匀，转染6 h后，换GM培养。分化试验，在换GM培养后12 h，用含2%马血清的DMEM诱导分化。
1.7 蛋白质的提取和杂交肌肉组织蛋白提取：将鸭胸肌组织加入液氮研钵中迅速磨碎。称取约400 mg，加入200 μL预冷的蛋白组织抽提液，冰孵。离心后收集上清，BCA法定量，待用。
细胞蛋白提取：将培养细胞的培养皿中的培养液吸取丢弃，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗3次，添加含1%蛋白酶抑制剂(PMSF)的细胞裂解液裂解细胞，并收集于1.5 mL离心管中。充分裂解后，离心，将上清液转移到新离心管中，进行定量分析。调整不同组的蛋白浓度一致后，煮沸10 min，－80 ℃贮存备用。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离得到的蛋白质：80 V电压，约0.5 h后，溴酚蓝完全越过积层胶后，120 V分离胶中分离蛋白约2 h，直至对照marker、目的蛋白已得到充分分离。甲醛浸泡于聚偏二氟乙烯膜(PVDF)3 min，而后用Bio-Rad公司的Western blot装置(ZY5规格)进行装膜。转膜完毕后，5%脱脂奶粉封闭液封闭1 h。根据一抗说明书，进行一抗孵育，37 ℃恒温箱中孵育2 h。Tris-HCl缓冲盐溶液+Tween(TBST)洗膜4次，每次5 min。而后二抗孵育，37 ℃，1.5 h。最后，用Bio-Rad ChemiDocTM XRS+成像系统检测目的蛋白，并用Image J软件统计蛋白条带的灰度值。
1.8 EdU检测鸭骨骼肌卫星细胞阳性细胞数Cell-LightTM EdU荧光显微镜检测试剂盒购买于广州市锐博生物科技有限(Ribobio)公司。将鸭骨骼肌卫星细胞接种至96孔板中，每孔接2 000~3 000个细胞，每组3个重复。处理细胞24 h后，加入EdU培养基孵育细胞2 h，继而用4%多聚甲醛固定。之后按照EdU试剂盒说明书进行检测。最后在荧光显微镜下观察并拍照。
1.9 流式细胞术检测鸭骨骼肌卫星细胞的增殖收集约5×106个细胞，1 000 r·min-1转速离心5 min，弃去培养液。PBS洗涤细胞2次，1 500 r·min-1离心，5 min·次-1。弃PBS，沉淀用冰预冷的70%乙醇4 ℃下固定1~2 h。1 500 r·min-1离心，弃上部固定液，沉淀用3 mL PBS重悬5 min，400目筛网过滤1次。1 000 r·min-1离心，弃去PBS，沉淀用0.5 mL PI染液染色，4 ℃避光30 min。用488 nm激光波长进行流式细胞仪检测。
1.10 免疫荧光检测肌管的形成2%多聚甲醛固定收集细胞15~30 min，PBS清洗后，加入0.5%的Triton X-100。用来源与一抗物种来源不同的PBS稀释血清，室温封闭后，加一抗4 ℃封闭过夜或室温封闭2 h。生物素标记的二抗孵育30 min。SABC-Cy3(稀释比例1:(100~200))，室温孵育30 min，生物素标记的二抗(稀释比例1:(100~200))，室温孵育30 min后，加入SABC-Cy3(稀释比例1:(100~200))，室温孵育30 min。最后核染DAPI(－20 ℃避光保存，Sigma)，荧光显微镜观察拍照。
1.11 数据统计与分析采用SPSS18.0统计软件的One-Way ANOVA进行方差分析与显著性检验。具体操作：SPSS 18.0界面下，数据输入：“Data”选项→激活“Variable View”，建立因素变量和依变量→“Data View”输入试验数据；分析过程：主菜单“Analyze”项→在下拉菜单中点击“Compare Means”项，在右拉式菜单中点击“One-Way ANOVA”项，结果以“mean±SEM”表示。*P < 0.05表示差异显著, **P < 0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 miR-21的成熟序列、前体序列及其保守性分析经过比对发现，miR-21的成熟序列TAGCTTATCAGACTGATGTTGAC覆盖在鸭的ENSAPLG00000000474基因上，位于Scaffold KB742712.1: 1 169 790~1 169 886 bp。经过查找鸭基因注释文件发现，该基因是长度为97 bp的miR-21，且能够形成二级结构(图 1)。考虑到成熟miRNA长度一般为19~30 bp，推断ENSAPLG00000000474是miR-21的前体序列。
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两个箭头间区为成熟序列 Base sequence between two arrows is the mature sequence of miR-21 图 1 miR-21的颈环结构 Figure 1 Stem-loop structure of miR-21 |
miR-21成熟序列保守性分析表明，14个物种miR-21成熟序列的种子区序列完全一致，为AGCUUA。除比目鱼外，其它物种种子序列之外的序列也完全一致(图 2A)。进化分析表明，鸭与原鸡的遗传距离最近，其次是胸斑草雀和火鸡，最远的是家兔和猫(图 2B)。
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A. miR-21成熟序列保守性；B. miR-21前体序列的进化关系 A. The conservation of mature sequence of miR-21; B. The evolutionary relationship of precursor sequences of miR-21 among 14 species 图 2 不同物种miR-21保守性分析 Figure 2 The conservation analysis of miR-21 among different species |
miR-21在北京鸭E11~E27胸肌内表达量及其在E27腿肌、心、肝、肾、肌胃、小肠、腹脂和皮脂中的相对表达量分别见图 3A和3B。由图 3A可知，miR-21的相对表达量整体趋势是先升高后降低，孵化第19天时miR-21的相对表达量最高，为其表达的拐点。孵化前期(孵化第11~19天)miR-21的相对表达量在第13天时低于第12天，第17天的低于第16天；孵化后期(孵化第19~27天)miR-21的相对表达量第21天高于第20天，第22天高于第21天，与整体趋势相反，但差别程度尚未达到显著水平(P>0.05)，所以并不影响miR-21在孵化第11~27天表达的整体趋势。图 3B表明，miR-21几乎在所有的器官内均表达。其表达量在肝中最高(相对表达量为27)，其次为胸肌、肌胃、腿肌和心(相对表达量分别为26、25、23和20)，在腹脂中表达量最低(相对表达量为8)。
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A. miR-21在E11~E27胸肌内的表达谱；B. miR-21在E27不同组织内的表达谱 A. The expression profile of miR-21 in breast muscle from E11 to E27; B. The expression profile of miR-21 in different tissues on E27 图 3 miR-21在鸭胚胎不同时期及组织中的表达模式 Figure 3 The temporal-spatial expression profiles of miR-21 in different tissues of embryo at different stages in Pekin duck |
鸭骨骼肌卫星细胞的增殖速度随着培养时间的增加而逐步增加，在第4天(D4)时增殖最为旺盛，其后细胞开始凋亡(图 4A)。以D4的活细胞数目为对照，用D0、D2和D6活细胞数占D4活细胞数的百分比来量化鸭骨骼肌卫星细胞的增殖情况(图 4B)。
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A. DAPI染色; B. D0、D2、D4、D6相对于D4的活细胞百分比；C. miR-21的相对表达量。**. P < 0.01；*.P < 0.05，下同 A. The dyed results by DAPI；B. The percent of viable cells of D0, D2, D4 and D6 to D4, respectively；C. The relative expression of miR-21. **. P < 0.01; *. P < 0.05, the same as below 图 4 miR-21在增殖的成肌细胞鸭骨骼肌卫星细胞中的表达情况 Figure 4 The expression of miR-21 during proliferation of duck skeletal muscle satellite cells |
miR-21在增殖的鸭骨骼肌卫星细胞中的表达情况见图 4C。图 4表明，miR-21表达量变化趋势与鸭骨骼肌卫星细胞增殖变化趋势一致。上述结果为研究miR-21在鸭骨骼肌卫星细胞中的作用奠定了基础。
miR-21 Agomir为双链RNA序列，包括一条与miR-21成熟序列一致的序列以及一条与miR-21成熟序列互补的序列。向增殖的鸭骨骼肌卫星细胞转染miR-21 Agomir，利用RT-PCR检测转染效率(图 5A)。结果显示，转染miR-21 Agomir后，miR-21相对表达量为对照组的475倍，达极显著水平(P < 0.01)，说明模拟物质量合格，转染方法及使用量正确，可以用于后续试验。
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A. miR-21模拟物转染效率检测结果；B. CDK2和CyclinD1基因mRNA表达量检测结果；C. CDK2和CyclinD1蛋白表达量检测结果；D.蛋白杂交条带灰度分析结果；E. EdU阳性细胞检测结果；F. EdU阳性细胞检测结果；G.流式细胞检测结果 A. Transfection efficiency detection results of miR-21 Agomir；B. mRNA expression results of CDK2 and CyclinD1; C. Protein expression results of CDK2 and CyclinD1；D. Gray analysis results of Western blot; E. Detection results of EdU positive cells；F. Analysis results of EdU; G. Detection results of flow cytometry 图 5 miR-21模拟物转染效率检测及对鸭卫星细胞增殖的影响 Figure 5 The transfection efficiency detection of miR-21 Agomir and its effect on proliferation of duck skeletal muscle satellite cells |
收集转染miR-21 Agomir的鸭骨骼肌卫星细胞，提取RNA，qRT-PCR检测内源性细胞增殖标志因子CDK2和CyclinD1 RNA的相对表达量(图 5B)。结果显示，CDK2的表达是对照组的1.2倍，达显著水平(P < 0.05)，CyclinD1的表达是对照组的3.3倍，达极显著水平(P < 0.01)。提取转染miR-21 Agomir的鸭骨骼肌卫星细胞中的蛋白质，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离(图 5C)，Image J软件统计蛋白条带的灰度值，并作图(图 5D)。结果显示，CDK2和CyclinD1的蛋白表达量均增加，但相较对照差异不显著(P>0.05)。说明在分子水平上，过表达miR-21可能促进细胞增殖基因的表达。
用EdU和流式细胞术分别检测细胞各个周期中细胞数目以及细胞增殖指数(图 5E)。通过EdU检测发现，对照组和试验组阳性细胞率分别为62.06%和78.17%(图 5F)，试验组较对照组显著增加(P < 0.05)。本研究还探索了过表达miR-21对细胞DNA复制和细胞周期的影响(图 5G)。利用流式细胞术检测各期细胞数目，结果显示，过表达miR-21极显著降低G2期的细胞数量(P < 0.01)，显著提升S期的细胞数量(P < 0.05)。结果表明，过表达miR-21能够促进鸭骨骼肌卫星细胞的增殖。
miR-21 Antagomir为化学修饰的RNA单链，能够与成熟的miR-21序列竞争性结合，从而起到抑制miR-21表达的效果。在鸭骨骼肌卫星细胞增殖阶段密度达到40%~50%时，转染miR-21 Antagomir，转染24 h后，利用荧光定量PCR检测miR-21抑制效率，CDK2和CyclinD1的RNA相对表达量、蛋白相对表达量及灰度分析，EdU阳性细胞的数量及统计分析，流式细胞仪检测细胞处在细胞周期G1、G2和S期的细胞数量。
结果显示，转染miR-21 Antagomir的鸭骨骼肌卫星细胞中miR-21的相对表达量是对照组的0.07倍，极显著降低(P < 0.01)(图 6A)，说明抑制物质量合格，转染方法及使用量正确，可以用于后续试验。CDK2和CyclinD1的RNA相对表达量分别是对照组的0.24倍和0.49倍(图 6B)，差异均达到极显著水平(P < 0.01)；CDK2和CyclinD1的蛋白相对表达量极显著低于对照组(P < 0.01，图 6C，图 6D)，说明在分子水平上，减少miR-21表达能够抑制细胞增殖基因的表达。试验组EdU阳性细胞率(42.85%)显著低于对照组(59.44%)(P < 0.05，图 6F)。抑制miR-21可极显著提高G2期细胞的数量(P < 0.01)，显著降低S期细胞的数量(P < 0.05，图 6G)。上述结果表明，抑制miR-21的表达减弱了鸭卫星细胞的增殖。
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A. miR-21抑制物转染效率检测结果；B. CDK2和CyclinD1基因mRNA表达量检测结果；C. CDK2和CyclinD1蛋白表达量检测结果；D.蛋白杂交条带灰度分析结果；E. EdU阳性细胞检测结果；F. EdU阳性细胞检测结果；G.流式细胞检测结果 A. Transfection efficiency detection results of miR-21 Antagomir；B. mRNA expression results of CDK2 and CyclinD1; C. Protein expression results of CDK2 and CyclinD1；D. Gray analysis results of Western blot; E. Detection results of EdU positive cells；F. Analysis results of EdU; G. Detection results of flow cytometry 图 6 miR-21抑制物转染效率检测及对鸭卫星细胞增殖的影响 Figure 6 The transfection efficiency detection of miR-21 Antagomir and its effects on proliferation of duck skeletal muscle satellite cells |
前期的试验表明，鸭骨骼肌卫星细胞在诱导分化后第2天细胞开始排列，并形成少量肌管；第4天形成的肌管明显增多；第6天肌管数量最多；第8天肌细胞发生凋亡，分化的肌管数量下降[16]。本研究中，miR-21在鸭骨骼肌卫星细胞分化的第－2、0、2、4、6、8天的表达情况表明，在鸭骨骼肌卫星细胞分化过程中miR-21表达量呈现出上升的趋势(第6天的表达约是第0天的7倍)，在第8天又下降(图 7)。说明miR-21可能具有促进鸭骨骼肌卫星细胞分化的作用。
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图 7 miR-21在鸭骨骼肌卫星细胞分化过程中的表达 Figure 7 The expression levels of miR-21 during differentiation of duck skeletal muscle satellite cells |
本试验分别向分化状态的鸭骨骼肌卫星细胞中转染miR-21的Agomir和Antagomir。结果显示，转染Agomir可极显著提高miR-21的表达量(提高了29.2倍)(P < 0.01, 图 8A)；转染Antagomir可极显著抑制miR-21的表达(降低65%)(P < 0.01，图 9A)。说明转染方法及使用量正确，满足试验要求，可以用于后续试验。
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A. miR-21模拟物转染效率检测结果；B. MyoG和MyHC基因mRNA表达量检测结果；C. MyoG和MyHC蛋白表达量检测结果；D.蛋白杂交条带灰度分析结果；E.免疫荧光检测结果；F. MyHC阳性细胞检测结果；G. miR-21超表达对肌管形成的影响 A. Transfection efficiency detection results of miR-21 Agomir；B. mRNA expression results of MyoG and MyHC; C. Protein expression results of MyoG and MyHC；D. Gray analysis results of Western blot; E. Detection results of immunofluorescence；F. The positive cell number statistics results of MyHC; G. The effects of miR-21 over expression on the formation of myotubes 图 8 miR-21模拟物转染效率检测及对鸭卫星细胞分化的影响 Figure 8 The transfection efficiency detection of miR-21 Agomir and its effects on differentiation of duck skeletal muscle satellite cells |
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A. miR-21抑制物转染效率检测结果；B. MyoG和MyHC基因mRNA表达量检测结果；C. MyoG和MyHC蛋白表达量检测结果；D.蛋白杂交条带灰度分析结果；E.免疫荧光检测结果；F. MyHC阳性细胞检测结果；G. miR-21抑制表达对肌管形成的影响 A. Transfection efficiency detection results of miR-21 Antagomir；B. mRNA expression results of MyoG and MyHC; C. Protein expression results of MyoG and MyHC；D. Gray analysis results of Western blot; E. Detection results of immunofluorescence；F. The positive cell number statistics results of MyHC; G. The effects of miR-21 over expression on the formation of myotubes 图 9 miR-21抑制物转染效率检测及对鸭卫星细胞分化的影响 Figure 9 The transfection efficiency detection of miR-21 Antagomir and its effects on differentiation of duck skeletal muscle satellite cells |
为研究miR-21对鸭骨骼肌卫星细胞分化的影响，本研究在过表达和干扰miR-21后，分别检测了试验组和对照组细胞内分化标志因子MyoG和MyHC的mRNA和蛋白质的表达量及肌管形成情况。
结果显示，在分化状态的鸭骨骼肌卫星细胞转染miR-21 Agomir，增加miR-21的表达，MyoG的mRNA相对表达量较对照组增加1.35倍，MyHC的mRNA相对表达量较对照组增加1.76倍(图 8B)，均达到了极显著水平(P < 0.01)；蛋白杂交(图 8C)检测细胞分化标记基因MyoG和MyHC的蛋白质表达量分别增加了0.24倍(P < 0.05)和1.21倍(P < 0.01)(图 8D)；免疫荧光检测(图 8E)发现, 过表达miR-21可使MyHC阳性细胞数增加0.68倍，达极显著水平(P < 0.01)(图 8F)，10核以上肌管增加了0.53倍，达极显著水平(P < 0.01，图 8G)，因此，miR-21可能促进了肌管的形成。
在分化状态的鸭骨骼肌卫星细胞转染miR-21 Antagomir，抑制miR-21的表达。结果显示，MyoG和MyHC的mRNA表达量分别是对照的0.37倍和0.30倍，均达极显著水平(P < 0.01，图 9B)；MyoG蛋白表达量是对照组的0.78倍，差异显著(P < 0.05)，MyHC蛋白表达量是对照组的0.43倍，差异极显著(P < 0.01)(图 9C，图 9D)；免疫荧光检测(图 9E)发现，干扰miR-21则会导致MyHC阳性细胞比例减少约51%(P < 0.01，图 9F)，1-4核和5-10核肌管比例显著增加(P < 0.05)，10核以上肌管比例极显著降低(P < 0.01，图 9G)。上述结果表明，过表达miR-21能促进肌细胞融合和分化，而干扰miR-21则抑制肌细胞融合。
3 讨论miRNAs是一类21~23 bp的短非编码RNA分子，具有保守性和时序表达差异性。miR-21作为miRNAs的一员，它的种子序列、成熟序列和前体序列在爬行动物[17-19]、鱼类[20-21]和鸟类[22-23]同样具有高度保守性。本研究通过测序的方式确定了鸭miR-21的成熟序列，并与miRBase库里13个物种的miR-21成熟序列进行比对，发现其种子序列高度保守，和miRBase库里13个物种的种子序列完全一致；成熟序列中只和比目鱼有一个碱基的差异，和其他12个物种的序列完全一致。前体序列的进化树分析进一步佐证了鸭miR-21的特性。
miRNAs的时序表达性和他的功能密切相关[24]。目前已发现，miR-21在水牛泌乳期[25]、宫颈癌[26]、增殖骨细胞[27]、卵巢癌[28]、心肌纤维化[29]等组织中呈高水平表达。现在普遍认为，miRNAa与其靶mRNAs序列互补配对，从而抑制其靶mRNA活性或使其靶mRNA降解[30-32]。前期研究结果显示，miR-21的表达随着北京鸭胚胎期胸肌的发育先增加后降低，孵化到第19天时达到最高峰，这和北京鸭胸肌发育的规律基本一致。另外，北京鸭胸肌在孵化第19天之前以增殖为主，孵化第19天到出壳以肌纤维细胞的分化为主[14]。以上结果表明，miR-21可能具有促进胚胎期鸭胸肌发育的作用。
为验证上述假设，本课题组开展离体验证miR-21对骨骼肌卫星细胞增殖和分化影响的工作。目前应用较多的验证方法是mRNA水平上标记基因的荧光定量检测[33]、蛋白杂交检测[34]以及细胞水平[35]和代谢途径[36]的检测等。本试验同样采用了上述的检测技术，检测包括增殖和分化标志基因CDK2、CyclinD1、MyoG和MyHC在mRNA和蛋白水平上的表达，以及EdU和免疫荧光在细胞水平上的检测，流式细胞术对细胞分裂细胞周期的检测。应用先进的科学技术，多层次，多水平检测，有助于全面阐明miR-21对鸭骨骼肌卫星细胞增殖和分化的影响。
肌细胞是畜禽肌肉的主要组成部分，对于增加畜禽肉产量具有重要作用。成肌细胞生长发育是肌细胞增生过程中的一个关键阶段，期间受到一系列基因和调控因子的影响。机体中存在一些miRNAs在肌肉中尤其是心肌和骨骼肌中特异表达，它们的转录本在心肌和骨骼肌中特异转录，且受到上游调控区域的控制，例如miR-1/206[37]；除了对肌肉特异的miRNA外，也有许多非特异的miRNA在肌肉中也发挥作用，miR-21就是其中之一。
miR-21拥有自己独立的启动子，其表达不受重叠的蛋白编码基因启动子调控。miR-21促进病理状态下细胞的增殖，例如miR-21的降解可诱导肝癌细胞凋亡及抑制细胞增殖[38]，miR-21的超常表达促进宫颈癌[39]、结肠癌[40]等细胞的增殖。miR-21异常表达与多种人癌症发生直接相关, 使其可能作为一种新型的分子靶标。近年来的研究发现，miR-21对正常生长的细胞也具有增殖作用。miR-21的表达和肝细胞增殖显著正相关(P < 0.05)，且具有潜在的促进作用[41]，miR-21反义寡核苷酸(AS-miR-21)可抑制血管内皮细胞增殖相关转录因子的表达[42]。2011年，梁如意[43]首次报道了miR-21通过作用于靶基因TGFBI调控猪骨骼肌的生长发育；2013年，彭兴[44]进一步确定了miR-21与猪肌肉发育的相关性，并通过双荧光素酶方法证实TSC1和SMAD7为其靶标基因；2014年，白立景[13]利用二代测序的方法鉴定出229个与猪骨骼肌发育相关的已知miRNAs，miR-21是其中之一，miR-21模拟物和抑制物转染C2C12细胞，mRNA水平、蛋白水平和细胞水平上的检测都表明miR-21促进猪成肌C2C12的增殖，其作用机理是通过抑制TGFBI基因的表达，解除TGFBI对AKT-mToR通路的抑制作用，不足之处是没有使用猪骨骼肌卫星细胞进行验证。
鸭骨骼肌卫星细胞是研究肉质性状的良好素材。肌卫星细胞是位于基底膜和包裹着整个肌纤维的肌膜之间的单核细胞，以其解剖学位置和独特的形态学被鉴定。卫星细胞被鉴定后，就立即被验证能成为使骨骼肌拥有卓越再生能力的肌源性干细胞的主要候选者。研究发现，肌卫星细胞代表着静息的成肌细胞，在肌肉受到损伤后，肌卫星细胞会被激活，通过增殖、分化并融合到已经形成的肌纤维来完成肌肉损伤后的修复[45]。在生长肌肉中对肌卫星细胞进行同位素标记，发现有丝分裂的一半子细胞为分化肌肉提供细胞核，而另一半仍为肌卫星细胞，说明肌卫星细胞在体内有自我更新的能力。总之，成肌分化和自我更新能力可确保肌卫星细胞能成为成年肌肉干细胞[46]。此外，肌卫星细胞可以通过增殖、分化融合肌纤维形成新的肌核从而导致骨骼肌纤维的肥大以及骨骼肌纤维类型的相互转化，进而影响肉品质的形成。目前，通过单根肌纤维法获得的卫星细胞再生能力强，并且更接近于骨骼肌卫星细胞的活体研究结果。
成肌细胞退出细胞周期停止增殖时，经过成肌诱导即可定向分化。成肌细胞的分化受到包括miRNAs在内的多种因素影响。miRNA通过控制大量基因产物的水平来精确滴定基因表达剂量，从而指导机体的生物学过程。miRNA在不同的细胞类型中具有不同的功能和作用，这取决于表达的定位和时间，当然也存在潜在的靶位点。越来越多的证据表明了miR-21在干细胞分化中的重要作用，miR-21可能限制和损害心血管修复反应，促进心肌细胞分化[47]。王涛等[48]在C2C12细胞中抑制miR-21的表达，Northern blot检测miR-21在分化过程中的表达变化及组织表达谱，转染DNA/LNA杂合体反义链进行loss-of-fuction功能研究，RT-PCR检测其对分化相关分析的影响，结果发现成肌分化过程未受到影响。本研究结果表明，过表达miR-21可以显著提高成肌分化标志因子MyoG和MyHC的mRNA和蛋白质的表达量(P < 0.05)，同时能够显著促进肌管的融合(P < 0.05)。干扰miR-21则能够观察到与过表达miR-21相反的结果。这和王涛等[48]报道的miR-21对C2C12成肌细胞无显著影响结果不一致，分析原因可能是因为所用细胞不同的缘故，本试验使用的为来自鸭本身的骨骼肌卫星细胞，而王涛等[48]使用的是来自哺乳动物小鼠的C2C12细胞。
4 结论miR-21在北京鸭胚胎期胸肌内的表达模式与胸肌发育的规律一致。过表达和干扰miR-21试验表明，miR-21可以促进成肌细胞鸭骨骼肌卫星细胞的增殖和分化。本研究结果为探讨miR-21调控骨骼肌纤维细胞的作用机理奠定了基础。
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