藏鸡是青藏高原地区蛋肉兼用的优质地方鸡种。其体型外貌和生活习性与家鸡祖先红色原鸡极为相似，处于半野生状态，能适应高原、高寒的气候条件[1]。藏鸡具有抗病力强、适应性广、耐粗饲、繁殖周期短、肉质鲜嫩、高蛋白低脂肪、营养丰富等优点，且肉质风味独特，既适合大规模集约化养殖，也适合家庭适度规模养殖[2]。IMF含量是影响动物肉质与风味的重要因素。适量的肌内脂肪含量对肉的嫩度、风味与多汁性很重要[3-4]。动物脂肪沉积由多基因控制，主要受遗传因素制约，基因水平的调控对脂肪的发育具有重要影响。因此，深入研究肌内脂肪沉积发育的调控机制具有重要意义。
调控脂肪细胞分化和脂质代谢的关键基因的表达是影响动物IMF沉积的主要因素[5-10]。KLFs家族是能结合DNA的锌指蛋白转录因子家族，该家族成员普遍在羧基末端含有3个连续且高度保守的具有5-C(A/T)CCC-3结构启动子的锌指结构[11]。该家族在调控机体脂质代谢的过程中扮演重要角色。迄今为止，该家族共发现18个成员(KLF1~KLF18)，其中KLF15可促进脂肪细胞的分化[12-13]。研究发现，KLF15通过调控葡萄糖转运因子GLUT4的表达从而在脂肪组织和肌肉组织的代谢通路中起重要作用[14]。KLF15还能通过提高对心肌脂肪的利用来抑制心肥大疾病[15-17]。此外，有研究发现，KLF15是葡萄糖、脂肪和氨基酸3大主要能源物质在机体内流通的关键调控因子[18-20]。李青莹[21]在猪上的研究发现，KLF15可影响前体脂肪细胞分化过程中三酰甘油的合成及脂质的沉积。以上研究表明，KLF15基因在机体代谢机制中具有重要作用，尤其是在脂肪代谢机制中，因此，推测该基因可能与动物IMF沉积有关。
目前，关于KLF15基因在藏鸡上的研究尚未见报道，其与藏鸡IMF沉积是否有关还需进一步研究来阐述。因此，本研究通过克隆藏鸡KLF15基因序列，并阐明其组织表达的特异性，同时对该基因在肌肉组织不同发育时期的表达水平与IMF含量的关系进行相关分析，研究结果为进一步揭示KLF15在藏鸡IMF沉积中的作用提供了重要的数据。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验选用的1、81、119、154、210日龄(试验动物日龄的确定是以我国大多数优质地方鸡种不同的出栏时间及本验室前期摸索所设定的[22])的健康藏鸡均来自成都益生康健农业有限公司。藏鸡在经过12 h禁食处理后，进行放血屠宰，对其右侧胸肌、腿肌及皮下脂肪组织进行采集，同时采集154日龄公、母鸡心、肝、脾、肺、肾及皮下脂肪组织。采集的样本迅速冷冻于液氮中，置于超低温冰箱(－80 ℃)保存备用。
1.2 试剂D200DNA Marker、Trizol、2*Tag酶PCR Master Mix、DNase/RNase-free去离子水、普通琼脂糖凝胶DNA胶回收试剂盒、DH5a感受态细胞均购自天根生物科技有限公司；琼脂糖Agarose (西班牙)购自成都康迪生物技术有限公司；反转录试剂盒(Thermo Scientific)购自Thermo公司；QuantiNOvaTMSYBR®GreenPCRKit购自德国QIAGEN公司；Pmd19-T载体购自TaKaRa公司；无水乙醇、异丙醇、氯仿等均为国产分析纯。
1.3 方法 1.3.1 藏鸡KLF15基因克隆本研究采用Trizol法(异硫氰酸胍/苯酚法)提取组织总RNA，经紫外分光光度计测定其OD值(在1.8~2.0之间为符合要求)及浓度，然后反转录获得cDNA，备用。根据GenBank中登录的原鸡KLF15基因序列(XM_015293361)，用Premier 5.0设计克隆引物[23](表 1)，送至成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。先以RT-PCR法对目的基因进行克隆，克隆体系总体积为25 μL：ddH2O 9.5 μL，cDNA 1 μL，Taq聚合酶12.5 μL，上下游引物(10 μmol·μL-1)各1 μL。克隆程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共39个循环。获得的克隆产物先取5 μL进行20%的琼脂糖凝胶电泳检测，并用普通琼脂糖凝胶DNA胶回收试剂盒进行胶回收获得纯化的目的基因，然后构建Pmd19-T克隆载体并转化至DH5a感受态细胞中，挑选阳性菌落进行菌落PCR鉴定，最后送至成都擎科梓熙生物技术有限公司进行测序。
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表 1 引物序列、退火温度及预期PCR产物长度 Table 1 Primer sequences, annealing temperature and expected products size |
通过NCBI网站的ORF Finder寻找开放阅读框(open reading frame，ORF)；将获得的cDNA序列利用NCBI网站的BLAST软件进行同源比对，运用DNAMAN软件进行序列比对。采用MEGA 5.0构建进化树。
通过ProtParam在线分析编码蛋白的理化性质；采用PortScale进行疏水性预测；采用NetPhos 2.0、NetOGlyc 4.0、NetNGlyc 1.0分析预测KLF15蛋白磷酸化位点、O糖基化位点、N糖基化位点；NCBI在线分析该蛋白的结构域；PredictProtein预测KLF15蛋白的二级结构。
1.3.3 藏鸡KLF15基因的组织表达分析根据克隆所得到的KLF15基因序列，设计特异检测引物，选取GAPDH为内参基因，设计特异性引物(表 1)，以154日龄藏鸡心、肝、脾、肺、肾、胸肌、腿肌和皮下脂肪组织cDNA(公母各5只，共10只，总计80个样本)为模板，利用实时荧光定量PCR检测KLF15基因在各个组织中的相对表达情况。反应体系为20 μL：SYBRGreen 10 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物(10 μmol·μL-1)各1 μL，RNase-free H2O 7 μL。PCR程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，64 ℃/62 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共39个循环，每个待测样本设2个重复。荧光定量结果先用2-ΔΔCt法[24]进行分析，然后利用SPSS 19.0进行显著性检验分析(P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著)，最后进行绘图，获得表达谱。
1.3.4 藏鸡KLF15基因的时序表达分析以藏鸡各时期胸肌、腿肌的cDNA(每个阶段公母各8只，共160个样品)为模板，利用实时荧光定量PCR检测KLF15基因的相对表达情况。PCR反应体系、反应条件以及分析方法同1.3.3。
1.3.5 藏鸡IMF含量与KLF15基因表达水平的相关性分析本试验采用索氏抽提法测定81、119、154及210日龄藏鸡公鸡与母鸡的胸肌和腿肌IMF含量(每个阶段公母各8只，总计128个样本)。利用SPSS 19.0软件对KLF15基因在藏鸡各组织之间的表达差异进行显著性分析，并对胸肌和腿肌中KLF15基因的表达量与相对应的IMF含量进行相关性分析。
2 结果 2.1 藏鸡KLF15基因的克隆以母藏鸡皮下脂肪组织cDNA为模板，通过克隆获取藏鸡KLF15基因，经成都擎科梓熙生物技术有限公司测序得到该基因序列为1 288 bp，并上传至NCBI(登录号：KY747450)。
2.2 藏鸡KLF15基因的生物信息学分析 2.2.1 藏鸡KLF15基因及蛋白质序列分析通过序列分析可知，藏鸡KLF15基因的开放阅读框为1 212 bp (图 1)，编码403个氨基酸。在DNAMAN上对藏鸡、原鸡的核苷酸及蛋白质序列的CDS区进行比对，结果显示，该基因有6个核苷酸发生突变：c.153C>T、c.354G>A、c.469G>A(p.Gly157Ser)、c.544A>G(p.Asn185Ser)、c.561G>A、c.962G>A(p.Arg321Lys)，其中，c.962G>A(p.Arg321Lys)位于该基因第一个锌指结构中。
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第一行为原鸡核苷酸序列，第二行为藏鸡核苷酸序列，第三行为藏鸡编码氨基酸序列。加粗的斜体为突变的碱基和氨基酸；阴影处为预测的锌指结构；“*”为终止密码子 The nucleotide sequences in the first and second lines are the CDS fo KLF15 in Gallus gallus and Tibetan chicken, respectively; the amino acid sequence in the third line is the protein sequence of Tibetan chicken. Bold and italic characters indicate the mutation bases or amino acids; The shaded indicate predicted the zinc fingers; "*" is the stop codon 图 1 藏鸡KLF15的CDS区及与原鸡的序列差异 Figure 1 The sequences of KLF15 of Tibetan chicken and its difference to Gallus gallus |
藏鸡KLF15蛋白的分子式为C1941H3083N559O610S20，其分子质量为44.65 ku，理论等电点pI=8.30，说明该蛋白为碱性蛋白。带负电荷氨基酸残基(Asp+Glu)数为43，带正电荷氨基酸残基(Arg+Lys)数为46，该蛋白质总体上带正电。不稳定系数为75.97，因此为不稳定蛋白。
2.2.3 藏鸡KLF15蛋白质结构与功能的预测本研究在线预测蛋白质的修饰位点发现，藏鸡KLF15蛋白含有2个N-糖基化位点、46个丝氨酸磷酸化位点、9个苏氨酸磷酸化位点以及1个酪氨酸磷酸化位点。进行疏水性预测，结果显示，该蛋白质的最小亲水指数为－2.922(位于147位点处)，最大亲水指数为1.722(位于250位点处)。亲水性平均数GRAVY=－0.559，说明该蛋白为亲水蛋白。亚细胞定位预测显示，该蛋白主要在细胞核内(95.7%)发挥生物学功能，少部分在细胞质内(4.3%)发挥生物学功能。预测到该蛋白存在一个由内到外的跨膜结构(235~254位氨基酸处)，一个从外到内的跨膜结构(76~94位氨基酸处)。结构域预测结果显示，该蛋白质的3各个锌指结构分别位于380~332、338~362、368~390位氨基酸处。二级结构预测显示，该蛋白质二级结构中α-螺旋占10.42%，β-折叠占2.73%，无规则卷曲占86.85%，并存在28个蛋白质结合位点、26个RNA结合位点、7个DNA结合位点以及6个核苷酸结合位点。
2.2.4 与藏鸡KLF15蛋白质相互作用的蛋白预测在STRING交互式数据库中搜索可能与KLF15蛋白质相互作用的蛋白质时发现，该蛋白与PPARG、ACTA2、ACTG2、ACTR10以及ACTB等蛋白质可能存在相互作用(图 2)。
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图 2 与藏鸡KLF15蛋白相互作用的蛋白质预测 Figure 2 Prediction of proteins interacting with Tibetan chicken KLF15 protein |
将获得的藏鸡KLF15氨基酸序列与NCBI上的原鸡、火鸡以及小鼠、斑马鱼、山羊和人等其他物种的KLF15氨基酸序列一起构建系统进化树(图 3)，系统进化树显示，藏鸡与原鸡、火鸡以及游隼形成一个单独的分支，同属鸟纲目，可信度为100，且与原鸡亲缘关系最近，可信度为91。
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原鸡Gallus gallus(XP_004944662.1)，火鸡Meleagris gallopavo(XP_019475674.1)，游隼Falco peregrinus(XP_005230054.2)，斑马鱼Danio rerio(NP_997911.2)，山羊Capra hircus(XP_005709477.1)，牛Bos Taurus(NP_001075894.1)，小鼠Mus musculus(NP_075673.1)，野猪Bos Taurus(NP_001127821.1)，大熊猫Ailuropoda melanoleuca(XP_002923139.1)，黑猩猩Pan troglodytes(XP_016797329.1)，人Homo sapiens(NP_054798.1) 图 3 藏鸡与其他物种KLF15氨基酸系统进化树 Figure 3 The amino acid phylogenetic tree of KLF15 among Tibetan chicken and other species |
采用qPCR方法并以GAPDH 为内参基因检测KLF15基因在藏鸡8个组织(心、肝、脾、肺、肾、胸肌、腿肌、脂肪)中的表达情况，并以肺组织作为参照，结果如图 4所示，发现KLF15基因在公母藏鸡各个组织中均表达，且公母鸡均在肺组织出现最高表达量，极显著高于其他组织(P < 0.01)；本研究还发现，KLF15基因在藏鸡内脏组织和脂肪组织中的表达量极显著高于其在肌肉组织中的表达量(P < 0.01)。
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数据用“平均值±标准差”表示(n=5)。不同大写字母表示差异极显著(P < 0.01)，不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。下同 Data are presented "mean ±SD" (n=5 for each mean). Different capital letters show significant differences (P < 0.01), different small letters show significant differences (P < 0.05). The same as below 图 4 KLF15在藏鸡不同组织中的表达 Figure 4 Relative expression of KLF15 mRNA in different tissues of Tibetan chicken |
测定KLF15基因在不同日龄藏鸡胸肌和腿肌中的表达量时，均选用1日龄的表达水平作为参照。结果(图 5)显示，胸肌组织中，KLF15基因在1日龄时出现最高表达，并随着日龄的增长呈下降趋势，逐渐维持在一个较为稳定的水平内；腿肌组织中，KLF15基因在119日龄时出现最高表达，1日龄的表达量次之，且整体表达水平的变化都呈现先下降后上升再下降的趋势。综合上述分析发现，KLF15基因在胸肌和腿肌组织中的表达均不存在明显的公母差异。
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图 5 KLF15基因在藏鸡肌肉组织中不同时期的表达 Figure 5 Relative expression of KLF15 mRNA in different development ages of Tibetan chicken muscle tissues |
本研究对本实验室前期获得的藏鸡IMF含量数据(81、119、154和210日龄4个时期公母各8只)[25]与KLF15基因表达水平之间的相关性进行了分析，结果可见，就总趋势而言，藏鸡公鸡154日龄(22周龄)前KLF15基因的表达水平与其对应的IMF含量呈正相关，154日龄以后则呈负相关。藏鸡母鸡KLF15基因表达水平在22周龄前与胸肌中IMF含量呈负相关，22周龄后呈正相关，与各日龄阶段腿肌中IMF含量均呈微弱负相关(表 2)。
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表 2 藏鸡KLF15基因表达水平与IMF含量的相关分析 Table 2 The correlation of KLF15 gene expression and IMF content in muscle tissues of Tibetan chicken |
本研究中，藏鸡KLF15基因序列克隆于其皮下脂肪cDNA文库，其全长1 288 bp，包含完整的ORF区1 212 bp，编码403个氨基酸。与原鸡的该基因序列比对发现其存在6个核苷酸突变位点，其中有3处可导致氨基酸突变，并有一处突变位于第一顺位锌指结构内，研究发现，β3-肾上腺素能受体基因(β3-AR)多态性导致的第64位Trp突变为Arg，能引起脂质和能量代谢异常[26]，因此推测，藏鸡KLF15基因的核苷酸突变可能导致该基因的功能发生变化。此外，同源性分析发现，藏鸡KLF15基因与原鸡和火鸡之间的同源性极高，均为99%，与人及小鼠的同源性低，说明该基因在物种间进化具有较高的保守性。
有研究发现，KLF15与PPAR家族成员PPARα相互作用形成的KLF15-PPARα可调控心肌对脂肪的利用[14]，因此推测，该蛋白可能与PPARs家族蛋白质存在相互作用。本研究对与藏鸡KLF15蛋白质相互作用蛋白质的预测发现，其可能与PPARg存在相互调控作用，为上述报道提供佐证。
3.2 KLF15基因在藏鸡各个组织中的表达本研究采用qPCR技术对藏鸡各个组织中的KLF15表达量进行检测，并构建组织表达谱，结果显示，KLF15基因在藏鸡各个组织中均表达，且在肺组织中的表达量最高，胸肌和腿肌中最低。这与其他学者的研究存在相似及不同之处。Prosdocimo等[27]报道，KLF15基因在小鼠肝和肾中的表达量最高。王杰等[28]指出，KLF15基因在白色脂肪组织、棕色脂肪组织、心和骨骼肌等组织中均有表达，且该基因在小鼠肝、肾和脂肪组织中的表达量要显著高于骨骼肌和脾，这说明KLF15基因的表达具有物种差异。朱江江等[29]研究表明，KLFs家族中的KLF5、KLF6 和KLF7 在牦牛的肺组织中具有较高的表达水平。由此推测，其可能是由于藏鸡及牦牛均是高原物种，长期处于低氧环境导致肺功能进化有关。
3.3 藏鸡KLF15基因在不同肌肉发育阶段的表达本研究在构建藏鸡不同发育阶段肌肉组织中KLF15基因表达水平的时序表达谱发现，藏鸡胸肌KLF15基因的表达量在1日龄最高，并随着日龄的增长出现下降趋势，下降到一定程度后维持在一个较为稳定的水平，吕世杰[30]的研究发现，KLF15基因在1日龄固始鸡胸肌的表达量要高于36周龄，这与本试验结果类似。而在藏鸡腿肌组织中，KLF15基因在119日龄时表达量最高，极显著高于其他日龄阶段，在1日龄时的表达量次之，总体呈现先下降再上升最后下降的趋势。这说明KLF15基因在藏鸡骨骼肌中的表达存在日龄的差异但不存在性别的差异。
3.4 藏鸡KLF15基因表达与IMF沉积的相关性KLF15可通过调控PPARγ、AP2、C /EBPα的表达影响前体脂肪细胞的分化进而影响脂肪细胞脂质生成和沉积能力[31]。KLF15能够通过诱导PPARγ的表达促进3T3-1L细胞(小鼠前脂肪细胞)的分化[32]，还可通过诱导葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)的表达进而影响脂肪细胞的成熟和脂肪组织的发育[14]。研究发现，KLF15可以通过增强KLF3的转录活性从而促进牛脂肪细胞的分化和脂肪沉积[33]。此外，长链酰基辅酶A合成酶1(long-chain acyl-CoA synthetase 1, ACSL1)基因被确定为骨骼肌中脂肪酸合成的重要候选基因，而KLF15能够结合该基因的启动子，激活其转录[34]。综上所述，KLF15在骨骼肌脂质代谢方面具有重要的调控作用，且调控的方式具有多样性。本研究结果显示，藏鸡公鸡22周龄前KLF15基因的表达水平与其对应的IMF含量呈正相关，22周龄以后则呈负相关。藏鸡母鸡在各个日龄段则表现出微弱的负相关，该现象可能是由藏鸡公鸡和母鸡之间的代谢方式有所差异且KLF15基因对脂质代谢调控的多样性导致的。基于其他学者的报道推测，该基因在肌内脂肪沉积中具有重要作用。因此，本试验室正在扩大样本量进一步检测其表达水平与IMF含量的相关性，同时在细胞水平利用超表达和干扰手段来证明其对藏鸡肌内脂肪细胞分化的影响。
4 结论本研究成功克隆得到藏鸡KLF15基因序列(GenBank登录号：KY747450)，ORF长1 212 bp，共编码403个氨基酸，与原鸡的核苷酸序列进行比对发现，其有6处核苷酸发生突变，其中3处导致氨基酸突变，与原鸡的亲缘关系最近。KLF15基因在藏鸡心、肝、脾、肺、肾、脂肪、胸肌及腿肌等各个组织中广泛表达，但在肺中存在较高表达水平。KLF15基因在藏鸡不同发育阶段的肌肉组织中表达水平具有差异，且与公鸡22周龄前肌肉组织中的IMF含量呈正相关关系。
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