2. 上海农业遗传育种重点实验室, 动物遗传工程研究室, 上海 201106;
3. 上海交通大学医学院实验动物科学部, 上海 200025
, FU Li3, FAN Wenhua1,2, ZHANG Shushan1,2, WU Caifeng1,2, XU Jiehuan1,2, DAI Jianjun1,2
, ZHANG Defu1,2
2. Division of Animal Genetic Engineering, Shanghai Municipal Key Laboratory of Agri-genetics and Breeding, Shanghai 201106, China;
3. Department of Laboratory Animal Science, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200025, China
精液冷冻技术已逐渐成熟并正成为家畜繁殖育种的重要保障。冷冻复苏过程中会造成精子的系统损伤，影响精液质量，降低受胎率[1]。冻精过程中精子的损伤包括：物理损伤、化学损伤和过氧化损伤[2]，过氧化损伤能产生大量的活性氧(ROS)，导致精子畸形，直接影响精液品质，降低受胎率。已有研究表明，在冻精稀释液中添加外源性抗氧化剂可以有效提高精液品质，降低精子死亡率[3]。Mitoquinone (MitoQ)为线粒体靶向抗氧化剂，其组成成分为辅酶Q10的苯醌和三苯基磷阳离子通过一个十碳脂肪链结合而成，可显著降低细胞线粒体活性氧(ROS)水平，减少氧化损伤[4]。Fang等[5]在黄鲇鱼的精液稀释液中添加20 nmol·L-1的MitoQ，解冻后提高了冻精质量。刘丽等[6]用含有200 nmol·L-1的MitoQ稀释液保存男性冻精，解冻后精液质量最佳。迄今为止，关于MitoQ对绵羊冻精抗氧化性能的影响未见报道。
本研究通过在湖羊冻精稀释液中添加不同浓度的MitoQ，解冻后观察活率、活力、质膜完整率、顶体完整率和线粒体活性等精子质量相关指标，并检测MitoQ对超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)等抗氧化指标的影响，为进一步提高湖羊精液冷冻保存效果提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 主要试剂除特殊说明外，试验所用试剂均购于SIGMA公司；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)试剂盒购于碧云天公司。
1.1.2 精液采集湖羊精液采自永辉羊业湖羊研究所30月龄湖羊种公羊，每隔3 d采精1次。颜色乳白、气味正常，活率不低于80%的精液用于后续试验。将采集的鲜精混合后立即用于试验。
1.2 试验方法 1.2.1 精液稀释液的配制准确称取葡萄糖0.504 4 g、柠檬酸1.825 2 g、TRIS 3.634 2 g、双抗200 IU·mL-1、20 mL卵黄、6 mL甘油，定容至100 mL，混匀。设置6组，分别添加不同剂量的MitoQ，配置成MitoQ浓度为0、50、100、150、200、400 nmol·L-1的最终稀释液。
1.2.2 精液冷冻与解冻将镜检合格的精液混匀，平均分为6份，精液和稀释液同时37 ℃水浴。将稀释液M0~M5与精液分别按照3:1比例稀释并混匀。将盛有样品的温水和样品一起移入4 ℃冰箱，平衡2~3 h，使样品缓慢降温至4 ℃。
在4 ℃操作台，将平衡至4 ℃的样品装入0.25 mL细管中，电加热封口后将其均匀平铺在金属架上，放置于液氮液面上方3 cm处，熏蒸15 min，随后将细管快速投入液氮中保存。
解冻细管时，将其快速从液氮中取出，投入70 ℃水浴锅中，精准解冻5 s后拿出，擦净表面水珠，将冻精移入1 mL的37 ℃稀释液中，37 ℃水浴15 min后用于后续指标检测。
1.3 冻精质量检测 1.3.1 精子活率与活力在37 ℃条件下，取10 μL精液滴于迈朗精子计数板上，使用全自动精子分析仪在200×光学显微镜下观察，随机选取5个视野，每个视野下保证含有100个精子，自动测定精子活率和活力。
1.3.2 精子质膜完整率检测采用低渗肿胀法(HOST)观察精子质膜的完整性[7]。制备低渗液为柠檬酸钠0.49 g·mL-1、果糖0.9 g·mL-1。使用37 ℃低渗液稀释精子至6×105个·mL-1，37 ℃水浴60 min。光学显微镜下(200×)随机选取5个视野，每个视野下保证含有100个精子，取5次平均值为最终的结果，计算弯尾精子数与总精子数的比例。
1.3.3 精子顶体完整率检测采用吉姆萨试剂染色测定精子顶体完整率[8]。将吉姆萨原液稀释30×后制成吉姆萨工作液。取精液样品稀释密度至6×105个·mL-1，100 μL滴于载玻片上，制成涂片。待自然风干后滴甲醇液固定精子细胞，风干后滴吉姆萨工作液，避光静置染色10 h，在油镜下观察，计算染成紫色的顶体完整精子数与总精子数比例。
1.3.4 精子线粒体活性检测将待测样品稀释至1.5×106个·mL-1，加入10 μL的碘化丙啶，使待测液中碘化丙啶浓度为1 mg·mL-1；加入10 μL的罗丹明(1 μmoL·L-1)。取待测液涂片，于400倍倒置荧光显微镜，520 nm波长下观察，精子呈现红色荧光为死精，精子尾部呈现绿色荧光有线粒体活性[9]。统计各自百分率。
1.3.5 精子抗氧化能力检测使用碧云天超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)试剂盒分别检测解冻后精子的各项抗氧化指标。
1.4 统计分析本试验的数据用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，结果表示为“平均值±标准误(Mean±SEM)”，P < 0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 MitoQ对湖羊冻精质量的影响本试验研究添加不同浓度MitoQ对湖羊冻精质量的影响。结果显示(表 1)，添加MitoQ浓度为150 nmol·L-1 (M3组)时，其解冻后精子品质最高，活率、活力、质膜完整率、顶体完整率和线粒体活性分别为55.00%、52.34%、48.32%、54.51%和51.28%，均与对照组(M0组)差异显著(P < 0.05)。其中，M3组活率、活力、质膜完整率和顶体完整率与M2组差异不显著，但线粒体活性显著高于M2组(P < 0.05)。当浓度增加至200 nmol·L-1(M4组)时，冻精品质均开始下降，且与对照组(M0)相比有下降。当浓度继续增加至400 nmol·L-1 (M5组)时，冻精质量最差，其中与M0组相比，活率、活力和质膜完整率差异显著(P < 0.05)。
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表 1 不同浓度MitoQ对湖羊冻精质量的影响 Table 1 Effect of different concentrations of MitoQ on the quality of frozen semen of Hu sheep |
添加不同浓度MitoQ对湖羊冻精抗氧化能力的影响见表 2。添加MitoQ浓度为150 nmol·L-1(M3组)时，其解冻后精子抗氧化能力最高，表现为SOD和GSH-Px值最高，分别为203.90 U·mL-1和132.62 U·L-1，与对照M0组(144.53 U·mL-1和125.24 U·L-1)和M1组(157.01 U·mL-1和128.15 U·L-1)相比差异均显著(P < 0.05)。M3组的ROS和MDA水平最低，分别为298.34 U·mL-1和4.99 nmol·L-1，均显著低于M0、M1和M2组(P < 0.05)。当MitoQ添加至200 nmol·L-1 (M4组)时，SOD、GSH-Px酶活力开始下降，ROS、MDA值上升。当浓度继续增加至400 nmol·L-1 (M5组)时，则表现为对细胞的氧化损伤，其中GSH-Px酶活力显著低于对照M0组(P < 0.05)，SOD、ROS和MDA值与M0组差异不显著(P>0.05)。
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表 2 不同浓度MitoQ对湖羊冻精抗氧化能力的影响 Table 2 Effect of different concentrations of MitoQ on the antioxidation of frozen semen of Hu sheep |
精子在冷冻解冻过程中，会产生过量的活性氧自由基ROS，造成精子的不可逆氧化损伤，严重影响精子质量[10-11]。健康精子也会产生微量的ROS，在一定范围内的ROS有助于精子正常获能、受精。但过量的ROS会造成精子细胞负担，导致DNA结构破裂、精子质膜过氧化，并最终使精子死亡[12-13]。另外, 在冻精过程中还会产生脂质氧化终产物丙二醛(MDA)，直接作用于线粒体内关键酶和呼吸链复合物。精子内MDA水平可反映膜脂过氧化损伤的程度[14]。在男科疾病诊断中，MDA被视为诊断精子受精能力的敏感指标，健康精液的MDA水平显著低于不孕症精液[15]。活性氧清除剂主要为SOD，能有效维持ROS代谢平衡、保护精子膜结构。GSH-Px能使有害的过氧化物还原成对精子无害的羟基化合物，并分解H2O2，使细胞膜不被H2O2氧化损伤[16-17]。近年来，精子氧化损伤导致的不孕不育问题被广泛重视，许多实验室开始研究抗氧化剂对精子的保护作用。
在精液冷冻时添加抗氧化剂，可以使解冻后精液质量提高[18-20]。MitoQ是一种有效的抗氧化剂，聚集在线粒体内，可被降解成具有抗氧化活性的泛醌形态，泛醌进入细胞膜被线粒体膜内的基质吸收。MitoQ可持续消除过氧亚硝酸盐、氧化氢、超氧化物[21-22]。可显著阻碍精子细胞生成ROS，并消除过量ROS，减少线粒体DNA、蛋白和脂质氧化损伤而保护线粒体，进而使精子免受氧化损伤，特别是在冻精试验中，其作用尤为明显[23]。本研究中，在湖羊精子冷冻过程中添加150 nmol·L-1的MitoQ可提高冻精的SOD和GSH-Px水平，降低ROS和MDA含量，证实了MitoQ对湖羊冻精的抗氧化保护作用。
MitoQ是一种线粒体靶向抗氧化剂，其已经在相关生物医药研究中得到了广泛证实[24]。在精液冷冻方面，方路[25]在鱼的冻精研究中添加0.1 μmol·L-1 MitoQ可显著提高鱼的冻精质量和抗氧化效果。刘丽等[6]将MitoQ应用在人的冷冻精液中，结果显示，添加200 nmol·L-1的MitoQ能有效提高人精子质量，可作为精液的冷冻保护剂。本试验将MitoQ首次运用到湖羊的冻精稀释液中，结果显示，MitoQ对湖羊冻精质量有显著影响。在一定范围内，随着MitoQ添加浓度的增高，冻精的抗氧化能力增强，当添加浓度为150 nmol·L-1时最佳，与对照组相比能显著提高解冻后精液品质，抗氧化能力最高；当浓度继续升高后，精液品质开始下降，冻精的活率、活力和质膜完整率均低于对照组，其他指标与对照组没有显著差异，且抗氧化能力没有显著提高。本研究得出MitoQ对湖羊冷冻精液有积极影响，可以显著增强其抗氧化能力，这与之前研究结果相同。但各研究得出的最佳抗氧化浓度不同，推断这可能是不同物种间差异造成的。
有关MitoQ的毒性和安全性研究报道较少，近几年有研究发现，过量MitoQ导致线粒体肿胀、去极化和细胞自噬，不利于细胞存活。Gottwald等[26]在对肾组织的研究中发现，过量的MtioQ添加会导致线粒体肿胀和去极化。Sun等[27]发现，过量添加MitoQ会引起肝细胞的线粒体自噬。本试验中，MitoQ的浓度超过200 nmol·L-1时，冻精的质量显著下降，精子氧化损伤开始显现。高浓度的MitoQ表现为对湖羊精子有毒副作用，使精子线粒体活性下降和抗氧化能力降低，因此在其应用过程中需注意MitoQ的合适添加量。
4 结论综上所述，浓度为150 nmol·L-1的MitoQ对湖羊冻精有最佳保护作用，表现为抗氧化能力提高和冻精品质改善。当MitoQ的添加浓度超过200 nmol·L-1时对冷冻精子没有保护作用。
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