2. 广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室, 广州 510642;
3. 佛山科学技术学院, 佛山 528231
2. Key Laboratory of Zoonosis Prevention and Control of Guangdong Province, Guangzhou 510642, China;
3. Foshan University, Foshan 528231, China
猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS virus, PRRSV)引起的一种以妊娠母猪繁殖障碍(流产、弱仔、死胎、木乃伊胎)及仔猪呼吸道症状等临床症状为特征的传染病[1-2]。1987年，该病首次在美国出现，随后全球各大养猪地区均有该病的报道[3]。2006年，我国首次出现高致病性PRRSV，近几年，在我国发现新型高致病性PRRSV, 均造成了巨大经济损失[4-5]。当前，PRRS已成为危害全球养猪业的重要疾病之一[6]。
PRRSV基因组全长约15 kb，包括至少10个开放阅读框，编码8种结构蛋白和16种非结构蛋白[7-9]。PRRSV N蛋白由开放阅读框7(ORF7)编码，为PRRSV的核衣壳蛋白，是一种具有多种功能的磷酸化蛋白，同时也是PRRSV中含量最丰富的蛋白[10-11]，该蛋白常用于临床检测[12]。研究表明N蛋白存在多个磷酸化修饰位点，相对分子质量约为15 ku，主要分布在细胞质和细胞核周围，并且可以影响细胞基因的表达[13-14]。PRRSV主要感染猪肺泡巨噬细胞(pulmnary alveolar macrophages, PAMs)和树突状细胞[15-16]。
磷酸化修饰往往对蛋白的功能发挥有着重要的作用。有研究表明麻疹病毒N蛋白磷酸化与形成核衣壳相关[17]；突变腮腺炎病毒的N蛋白磷酸化位点，具有调节病毒复制和转录的作用[18]；冠状病毒的N蛋白磷酸化修饰具有调节亚基因组转录的功能[19]；此外，磷酸化还可以调节病原体的毒力[20]。这些研究结果表明，N蛋白磷酸化对病毒的复制及亚基因组的转录有着重要的作用，但对于PRRSV N蛋白磷酸化的功能知之甚少。
目前，已鉴定的PRRSV N蛋白磷酸化位点包括Ser-105和Ser-120两个位点[21]。本研究运用反向遗传技术，将PRRSV N蛋白上的磷酸化位点进行定点突变，构建全长感染性克隆并拯救突变病毒，在MARC-145细胞以及原代PAMs中研究N蛋白的磷酸化位点突变对病毒的复制和亚基因组转录的影响。
1 材料与方法 1.1 毒株、菌株、载体及细胞系XH-GD PRRSV病毒株(基因2型)、克隆宿主菌E. coli DH5α、XH-GD感染性克隆pok-D、pok-CD、pok-ABCD，BHK-21细胞和MARC-145细胞均由华南农业大学兽医学院传染病教研室保存。
1.2 酶类及相关试剂RNA酶抑制剂Ribonuclease Inhibitor、反转录酶M-MLV(RNase H-)、dNTP Mixture(各10 mmol·L-1)、dNTP (各2.5 mmol·L-1)、Hexadeoxyribonucleotide Mixture：pd (N) 9和Oligo d(T)18 Primers、TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ均购自TaKaRa公司；Fast-2000 RNA提取试剂盒购自上海飞捷生物有限公司；E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit、E.Z.N.A.TM EndoFree-Plasmid Mini Kit购自OMEGA公司；T4连接酶、LipofectamineTM 3000 Transfection Kit购自Invitrogen公司；PRRSV ELISA试剂盒购自IDEXX公司。
1.3 动物及处理3头4周龄健康仔猪购自某猪场，应用实时荧光定量PCR与酶联免疫吸附试验[22-23]对仔猪进行检测，结果为PRRSV抗原、抗体双阴性。
1.4 PAMs的制备将健康仔猪放置于无菌室解剖台上，颈静脉放血致死，剖开胸腔，结扎气管后连同心脏取出完整的肺。在生物安全柜中用无菌PBS充分清洗肺表面，清除污物。将结扎部分的气管切掉，然后将50~100 mL无菌PBS沿气管口导入，轻轻拍打肺表面3~5 min后回收灌洗液。用以上方法重复灌洗2次。用双层无菌纱布过滤，收集全部滤液，250×g离心5 min, 最后用含有双抗的PBS洗涤PAMs两次，250×g离心5 min, 即获得PAMs。
1.5 感染性克隆的构建与病毒的拯救根据PRRSV全长cDNA的构建策略[24]，按照图 1所示，构建反向遗传系统，流程如下：设计相关引物(表 1)，构建出突变型的N片段。将突变型的N片段酶切，用T4连接酶连接到pok-D载体上，转入DH5α感受态细胞中，挑菌PCR检测，将阳性样品提取质粒分别命名为pokD-A105、pokD-A120、pokD-A105-120。参照如上方法，用酶切、连接分别将相应的AB段、C段连接到相应的载体上，最终命名为pokABCD-A105、pokABCD-A120、pokABCD-A105-120。按照LipofectamineTM 3000 Transfection Kit说明书方法，将质粒pokABCD-A105、pokABCD-A120、pokABCD-A105-120转染到BHK-21细胞内，以EGFP质粒作为阳性对照，检测转染效果。转染后72 h，将细胞冻融3次，4 ℃ 10 000×g离心5 min，取上清，接种于MARC-145细胞，连续传代3次，将拯救的病毒分别命名为A105、A120、A105-120。
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图 1 感染性克隆的构建 Fig. 1 The construction of the infectious clones |
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表 1 磷酸化位点突变感染性克隆构建引物 Table 1 Primer sequences used for constructing infectious clone contain mutation at the phosphorylation site |
分别在长满MARC-145和PAMs的6孔板中接种0.1 MOI的病毒，感染后12、24、36、48 h分别收集病毒上清，进行病毒滴度测定。将收集的病毒液10倍倍比稀释后加入96孔板中，每孔100 μL，37 ℃、5% CO2培养箱孵育1 h后弃去病毒液，加100 μL含有2%血清的DMEM，放入培养箱，3 d后观察细胞病变(CPE)，按照Reed-Muench法计算病毒的TCID50。
1.7 间接免疫荧光(IFA)鉴定将拯救出的病毒分别接种于长满单层MARC-145细胞的12孔板，在接毒后的第3天，将细胞板取出，用PBS清洗12孔板5次，每次1 mL。每孔加入500 μL 4%多聚甲醛固定液，室温条件下固定，25 min后弃去固定液，用1 mL PBS清洗细胞孔，重复4次。在每孔中加入1:400稀释的抗N蛋白单克隆抗体(韩国金诺公司)，4 ℃过夜孵育12 h，弃去一抗，再用1 mL PBS洗涤12孔板5次，每孔中加入1:100稀释FITC标记的山羊抗鼠荧光二抗(IRDye800标记，Licor公司)，37 ℃湿盒中避光孵育1 h。随后弃去二抗，用PBS洗涤12孔板5次，每次1 mL，将细胞放置在荧光显微镜下观察。
1.8 Western blotting检测磷酸位点突变N蛋白将磷酸化位点突变病毒及其亲本病毒XH-GD以0.1 MOI接种于长满80%MARC-145细胞的6孔板中，在37 ℃培养箱中培养36 h，弃去上清，用PBS清洗细胞5次，用加入蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液在冰上裂解15 min，然后进一步做SDS-PAGE上样处理，用PRRSV N蛋白的单克隆抗体做Western blotting，检测突变病毒和亲本病毒N蛋白的表达情况。
1.9 荧光定量PCR将XH-GD、A105、A120、A105-120分别以0.1 MOI接种于长满PAMs的6孔板上。感染后分别于12、24、36和48 h收集细胞，反复冻融3次，使用Fast 2000 RNA提取试剂盒提取总RNA，使用MLV反转录酶将RNA合成cDNA，用实时荧光定量PCR检测PRRSV各亚基因组转录产物的表达情况，引物序列见表 2。
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表 2 亚基因组转录分析所用引物 Table 2 Primer sequences used for subgenomic transcriptional analysis |
用GraphPad Prism6软件对各试验组与对照组(Control组)的差异性进行T检验分析，所有试验中P < 0.05 (*)为差异显著，P < 0.01 (* *)为差异极显著。
2 结果 2.1 突变病毒感染性克隆的构建根据PRRSV全长cDNA的构建策略，构建出阳性质粒pokABCD-A105、pokABCD-A120、pokABCD-A105-120，序列测定后表明磷酸化位点突变感染性克隆构建成功。
2.2 磷酸化位点突变病毒的拯救将提取的质粒pokABCD-A105、pokABCD-A120、pokABCD-A105-120分别转染到BHK-21，72 h后收集上清，接种于长满单层MARC-145的6孔板中，连续传3代，第三代感染48 h后，在倒置显微镜下可见明显的聚团、折光度改变等病变现象(图 2)。
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图 2 突变病毒在MARC-145细胞上的病变(100×) Fig. 2 The CPE of MARC-145 induced by mutant PRRSV (100×) |
将拯救的病毒A105、A120、A105-120、XH-GD分别接种于长满MARC-145细胞12孔板中，感染48 h后，经4%多聚甲醛固定、N蛋白单克隆抗体和FITC标记的羊抗鼠二抗孵育，荧光显微镜下观察结果。结果显示，A105、A120和A105-120组均有明显的绿色荧光，与阳性对照组(XH-GD)相似，阴性对照组无特异性荧光(图 3)。
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图 3 突变病毒的间接免疫荧光鉴定(100×) Fig. 3 The IFA identification of mutant PRRSV(100×) |
将磷酸化位点突变病毒以0.1 MOI接种于MARC-145细胞和PAMs进行生长曲线测定。结果显示，在MARC-145细胞上，105位点和120位点突变病毒的复制速率显著低于亲本毒株(PA105=0.002 4 < 0.01，PA120=0.018 4 < 0.05)，且磷酸化位点突变后，病毒滴度均为5×106 TCID50·mL-1左右，显著低于亲本毒株XH-GD的6.5×107 TCID50·mL-1(PA105=0.006 9 < 0.01，PA120=0.005 2 < 0.01，图 4A)。突变病毒及亲本毒株以0.1 MOI接种原代PAMs后发现，突变105位点会导致病毒中期复制速率下降(PA105=0.008 < 0.01)，同时突变这两个位点会进一步降低病毒的复制速率(PA105-120=0.003 < 0.01)，但最终不影响病毒滴度(均可达107 TCID50·mL-1)(图 4B)。
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星号表示A105与XH-GD之间病毒滴度的显著差异(*.P < 0.05；**.P < 0.01)；井号表示A120与XH-GD之间病毒滴度的显著差异(#.P < 0.05；##.P < 0.01)；比索表示A105-120与XH-GD之间病毒滴度的显著差异($.P < 0.05；$$.P < 0.01) Asterisk indicates a significant difference in the virus titers between A105 and XH-GD (*.P < 0.05;**.P < 0.01);Pound (#) indicates a significant difference between A120 and XH-GD (#.P < 0.05;##.P < 0.01);Peso indicates a significant difference between A105-120 and XH-GD($.P < 0.05;$$.P < 0.01) 图 4 突变病毒的生长曲线 Fig. 4 The growth curve of mutant viruses |
将磷酸化位点突变病毒及其亲本毒株XH-GD以0.1 MOI接种MARC-145细胞，36 h后提取细胞总蛋白，对细胞中N蛋白表达量进行Western blotting检测，结果表明Ser-105磷酸化位点突变显著影响了N蛋白的表达(P < 0.05，图 5、6)。
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图 5 突变病毒在MARC-145细胞中N蛋白表达鉴定 Fig. 5 The Western blotting results of the infected MARC-145 cells |
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*.P < 0.05 图 6 突变病毒N蛋白的Western blotting条带灰度分析 Fig. 6 Western blotting Gray-scale analysis of mutant virus N protein |
将XH-GD、A105、A120、A105-120病毒以0.1 MOI感染原代PAMs，在感染后12、24、36和48 h分别收集细胞，提取总RNA，采用相对荧光定量方法检测病毒亚基因组在细胞内的转录水平。结果显示，磷酸化位点突变病毒与亲本毒株在感染后不同时间点的基因组RNA以及各亚基因组转录水平均存在显著差异。与基因组RNA(gRNA)比较分析发现，磷酸化位点突变后病毒gRNA转录水平显著降低(P < 0.01或P < 0.05)，感染后的12、24 h，A105、A120位点突变病毒基因组水平显著低于亲本毒株(P < 0.01或P < 0.05)，且105位点突变在各个时间点均差异极显著(P < 0.01，图 7A)。亚基因组比较分析发现，磷酸化位点突变病毒长链亚基因组sgmRNA2、sgmRNA3的合成均显著低于亲本病毒(P < 0.01或P < 0.05，图 7B和C)；在各病毒感染后12及24 h，短链亚基因组sgmRNA4、sgmRNA5、sgmRNA6以及sgmRNA7的合成与gRNA呈相同趋势(图 7D、E、F和G)，即A105、A120突变病毒的亚基因组合成量显著低于亲本毒株(P < 0.01或P < 0.05)，但感染后期，突变病毒sgmRNA4和sgmRNA5的合成显著高于亲本病毒(P < 0.01或P < 0.05，图 7D和E)。以各组gRNA合成量为基准进行分析，发现A105突变病毒的sgmRNA4、sgmRNA5合成极显著升高(P < 0.001，图 7H)。
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*.P < 0.05；**.P<0.01；***.P < 0.001 图 7 拯救病毒的亚基因组转录水平 Fig. 7 The subgenomic transcription level of viruses |
N蛋白作为PRRSV的主要结构蛋白，参与病毒的转录与复制。磷酸化修饰是一种常见的蛋白修饰方式，然而，关于磷酸化N蛋白在病毒复制中的功能知之甚少。我们前期研究表明N蛋白的磷酸化可以影响体内PRRSV的毒力[25]。此外，还有研究表明HIV-1核衣壳磷酸化可影响病毒的脱壳和cDNA合成[26]。在本研究中，笔者发现磷酸化位点突变毒株在MARC-145细胞和PAMs上都会降低病毒的复制速率，其105位点和120位点的突变，有可能延迟了病毒粒子的脱壳和cDNA合成，进而降低了病毒粒子的复制速率。突变毒株在MARC-145细胞上会降低病毒的滴度，但在PAMs上不影响病毒滴度。PRRSV可以与细胞表面的唾液酸黏附素受体结合，从而入侵PAMs，有助于病毒的增殖[27]。PAMs膜表面存在唾液酸黏附素(sialoadhesin，Siglec-1又称为CD169)，而MARC-145细胞膜表面没有该受体[28]。这可能是导致突变毒株在两种细胞上最终病毒滴度存在差异的主要原因之一。
PRRSV的基因表达模式与冠状病毒类似，其基因组都是先产生6个亚基因组mRNA再表达[29-30]。有研究发现冠状病毒核衣壳的磷酸化与RNA解旋酶DDX1促进长链sgmRNA合成有关[19]。早些时候，已发现DDX1参与IBV N蛋白与细胞的相互作用[31]。本研究中病毒的RNA转录水平结果显示，在感染的48 h内，突变毒的基因组转录水平随着时间缓慢增长，但持续低于亲本病毒，同时，病毒的亚基因组RNA转录水平结果显示，与亲本病毒相比，突变病毒的sgRNA和长链亚基因组转录水平降低，我们推测在PPRSV感染PAMs过程中，宿主的RNA解旋酶DDX1也参与了N蛋白的磷酸化过程。
以基因组RNA(gRNA)表达量为基准对各亚基因组表达量进行整体分析，结果表明N蛋白磷酸化显著影响了sgmRNA4、5的表达。有研究表明，IBV的N蛋白磷酸化修饰可改变N蛋白与RNA的亲和力[32]。N蛋白酸化位点突变，可能会影响其与不同body TRS(body transcription regulating sequence)的结合，从而导致了各个亚基因组转录的不同变化，故我们推测body TRS4、5区域与N蛋白磷酸化有关。
4 结论将PRRSV N蛋白的已知磷酸化位点Ser-105和Ser-120分别或同时突变为Ala，拯救突变病毒，突变病毒在MARC-145的病毒复制速率与滴度显著低于亲本病毒(P < 0.01或P < 0.05)，而在原代PAMs复制速率降低(P < 0.01)，但不影响病毒最终的滴度。突变病毒的gRNA、sgmRNA2、3转录水平显著降低(P < 0.01或P < 0.05)，但短链sgmRNA4、5表达量随时间延长呈增加趋势。
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