2. 甘肃省农业科学院畜草与绿色农业研究所, 兰州 730070
, LANG Xia2, WANG Cailian2, LIANG Tingyu1, LIU Ting1, GONG Xuyin2, GAO Liangshuang1, SHI Xiaolei1, WU Jianping1
2. Animal Husbandry, Pasture and Green Agriculture Institute, Gansu Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730070, China
牛场的经济效益受到多方面因素的影响，其中犊牛死亡率是最重要的因素之一，而腹泻是新生犊牛死亡最常见的原因[1]，此外，经济损失还受到兽医治疗、劳动力成本增加、犊牛生长速度降低，甚至早期淘汰的影响[2]。莫能菌素是一种能够提高反刍动物饲料效率的离子载体抗生素，养殖业大量且不受控制的使用增强了所饲动物对其耐药性，降低了对动物疾病治疗的有效性。植物精油作为潜在抗生素替代物的出现引起了科学家们的高度关注[3]。植物的二次代谢产物中含有大量的有机化合物，这些化合物的特殊成分可能在动物营养中有积极的作用。牛至精油是从唇形科牛至属植物牛至中提取的具有高含酚类化合物的植物精油，大量的体外试验已经证明了牛至精油的主要成分百里香酚和香芹酚具有广谱的抗菌作用[4-5]。除抗菌性能外，还发现牛至精油具有抗病毒和抗真菌作用[6]。除大多数在体外完成的试验，在动物试验中，牛至精油在饲喂单胃动物的过程中对改善生长性能表现出积极的作用，Cheng等[7]研究发现，通过在低蛋白饲粮中添加牛至精油可以调节猪的肠道菌群结构、肠道形态和抗氧化能力，从而改善猪的生长性能和其对营养物质的消化率。Abouelezz等[8]研究发现，日粮中分别添加150和300 mg·kg-1的牛至精油均能够显著降低大肠杆菌、总需氧菌和阴性乳糖肠道菌在鸭盲肠中的数量。在反刍动物方面，周瑞等[9]在绵羊饲粮中添加7 g·d-1牛至精油表现出最佳抗菌活性，并能够抑制瘤胃中原虫生长，提高纤维素和蛋白质降解细菌的数量等。有关文献报道，在羊的饲粮中添加含有牛至精油的混合精油刺激了血液和细胞水平上免疫系统的生理变化[10]。Lei等[11]通过高通量测序研究含有牛至精油的混合物对瘤胃微生物区系的影响发现，精油添加剂量对瘤胃微生物群的稳定性有较大影响，且在添加精油的处理组中，拟杆菌属和琥珀弧菌属与挥发性脂肪酸产量的提高呈正相关。Froehlich等[12]研究指出，饲粮中添加0.5 g·kg-1干物质的牛至精油能够改善犊牛生长性能，在免疫系统处于平衡状态的前提下可改善血清免疫指标，降低犊牛腹泻天数。郭竟升[13]研究结果表明，饲粮中添加4 g·kg-1牛至精油可以提高犊牛的采食量、日增重、体长和体高增长等生长性能，也能够提高犊牛的免疫力并对腹泻有较好的抑制作用，但未进一步探究牛至精油作用于动物机体本身时生理机能的变化特征，尤其对瘤胃微生物的调控作用。
本试验以荷斯坦犊牛为研究对象，通过在颗粒饲料中添加牛至精油、莫能菌素研究其对犊牛血清指标、消化酶活性及瘤胃微生物区系的影响，从不同的角度进一步证明牛至精油对犊牛的作用效果，以期为在畜牧生产中实现无抗养殖提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物本研究采用两因素完全随机试验设计，试验因素为牛至精油和莫能菌素。试验前期从临洮华加牧业有限公司选取体重相近((41.31±2.23)kg)，体况良好的荷斯坦初生犊牛80头，随机分为4组，每组20头，采用单栏饲养。添加剂量：1)对照组饲喂全脂牛乳+颗粒料；2)饲喂全脂牛乳+颗粒饲料+4 g·kg-1牛至精油，纯度为1.3%；3)饲喂全脂牛乳+颗粒饲料+3.6 g·kg-1莫能菌素，纯度为2%；4)饲喂全脂牛乳+颗粒饲料+4 g·kg-1牛至精油+3.6 g·kg-1莫能菌素，试验共70 d，犊牛自由采食和饮水。为保证牛至精油和莫能菌素在颗粒饲料中混合均匀，牛至精油和莫能菌素的添加由甘肃德华生物股份有限公司临洮分公司在制备颗粒饲料的过程中添加混匀，牛至精油的添加比例为4 kg·t-1，莫能菌添加比例为3.6 kg·t-1。颗粒饲料的组成及营养水平参照NRC(2001)荷斯坦犊牛饲养标准[14]，详见表 1。
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表 1 颗粒饲料组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of pellet feed(DM basis) |
新生荷斯坦犊牛采用单栏饲养的方式饲养，保证犊牛圈舍通风干燥并及时清理更换畜栏中的麦草。犊牛在出生0~2日龄内早晚各饲喂1次牛初乳，每天在饲喂牛乳后冲洗干净水桶，倒入足量温水，3~10日龄早晚各饲喂全脂牛乳2 L，11~35日龄饲喂量增至3 L，36~42日龄仅晨饲全脂牛乳3 L，在43日龄时断奶。颗粒饲料在出生2天后开始饲喂，并自由采食至70日龄。
1.3 样品采集与处理 1.3.1 饲料样品采集与分析测定试验期间每周采集饲料样品，放置自封袋中-20 ℃冷冻待测。其中，总能和能量消化率估算公式参考我国《肉牛饲养标准》(NY/T 815—2004)[15]，计算消化能：消化能(MJ·kg-1)=总能×饲料能量消化率。
颗粒饲料营养成分含量的测定：将样品65 ℃烘干48 h，制作成风干样品待测。样品中干物质(DM)的含量按照GB/T 6435—2014[16]方法进行测定，粗脂肪(EE)的含量使用索氏提取仪(FOSS SoxtecTM2043，丹麦)按照GB/T 6433—2006[17]的方法进行测定，粗蛋白质(CP)的含量使用全自动凯氏定氮仪(FOSS Kjelte 8400，丹麦)按照GB/T 6432—1994[18]的方法进行测定，中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量按照Van Soest等[19]的方法进行测定，粗灰分(Ash)含量按照GB/T 6438—2007[20]的方法进行测定，钙(Ca)含量按照GB/T 6436—2002[21]的方法进行测定，磷(P)含量按照GB/T 6437—2002[22]的方法进行测定。
1.3.2 血液样品的采集与检测在犊牛56、70日龄时，每组选取6头公犊采集血样(犊牛56日龄平均体重为(83.48±6.87) kg；70日龄平均体重为(97.42±6.11) kg。70日龄采集血液样品的犊牛同56日龄时一致)[13]，在晨饲前1 h由颈静脉采集血液5 mL，倾斜采血管并静置20~40 min，3 000 r·min-1 4 ℃离心15 min，移液枪取2 mL血清转移至新的冻存管，并在-20 ℃冰箱保存待测。将分离的血清送往湖南锋锐生物科技有限公司，检测血清指标。
1.3.3 瘤胃液样品的采集与酶活测定采用口腔导管方式在犊牛56、70日龄时收集犊牛瘤胃液，丢弃第一次抽取出的瘤胃液约100 mL，固定好口腔导管抽取第二次瘤胃液分装在5支5 mL的冻存管中，2支投入-80 ℃的液氮罐中用于测定瘤胃微生物区系，1支经过4层无菌纱布过滤后放置在冰箱中-20 ℃保存，用于测定瘤胃中消化酶活性，其余备存。测定指标为瘤胃液中纤维素酶(cellulase)、胃蛋白酶(pepsase)、脂肪酶(lipase)、α-淀粉酶(α-amylase)的活性，各指标测定所用的试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，并按照试剂盒说明书进行测定。
1.3.4 瘤胃微生物总DNA的提取与样品测定将待测样品先置于4 ℃冰箱解冻，微生物总DNA提取所用的试剂盒购自天根生化科技有限公司，利用Light Cycler 480Ⅱ型荧光定量基因扩增仪采用荧光定量PCR(qPCR)比较阈值法进行测定。PCR反应体系及反应条件按照罗氏试剂盒说明书操作。PCR扩增采用20 μL反应体系：mix 10 μL，模板2 μL，上下游引物(表 2)各0.6 μL，dH2O 6.8 μL。PCR扩增反应程序：1)95 ℃预变性10 min；2)95 ℃变性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，72 ℃延伸10 s，共45个循环。微生物的数量根据每毫升样品中16S rRNA或18S rRNA的基因拷贝数(copies·mL-1)表示[23]。
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表 2 瘤胃微生物实时定量PCR的引物序列 Table 2 Primer sequences for RT-qPCR of rumen microorganisms |
采用Excel 2010整理试验数据，使用SAS 9.4统计软件混合线性模型(Mixed)中的两因素方差分析计算主效应及交互效应，当两因素有交互效应时运用Tukey’s进行多重比较，P < 0.01表示差异极显著，P≤0.05表示差异显著，0.05 < P≤0.10表示有显著差异趋势。
2 结果 2.1 饲粮中添加牛至精油和莫能菌素对犊牛血清生化指标的影响由表 3可知，添加牛至精油显著提高了56日龄犊牛血清中TP的浓度(P≤0.05)；莫能菌素对56、70日龄犊牛BUN浓度有降低的趋势(P < 0.10)。由表 4可以看出，牛至精油和莫能菌素对犊牛血清脂代谢相关指标均无显著影响(P>0.05)。由表 5可知，牛至精油显著提高了56日龄犊牛血清中SOD、GSH和GSH-Px的浓度(P≤0.05)，而莫能菌素对犊牛血清抗氧化相关指标无显著影响(P>0.05)。
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表 3 牛至精油和莫能菌素对犊牛血清生化指标的影响 Table 3 Effects of OEO and MON on serum biochemical parameters of calves |
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表 4 牛至精油和莫能菌素对犊牛血清脂代谢相关指标的影响 Table 4 Effects of OEO and MON on serum biochemical indices related to lipid metabolism of calves |
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表 5 牛至精油和莫能菌素对犊牛血清抗氧化相关指标生化指标的影响 Table 5 Effects of OEO and MON on serum biochemical indices related to anti-oxidant of calves |
由表 6可知，添加牛至精油显著降低了56、70日龄犊牛瘤胃中产琥珀酸丝杆菌在犊牛瘤胃中的数量(P < 0.05)，显著提高了白色瘤胃球菌的数量(P≤0.05)；莫能菌素显著降低了56、70日龄犊牛瘤胃中原虫的数量(P≤0.05)，并有降低白色瘤胃球菌数量的趋势(P < 0.10)，在56日龄时，莫能菌素有降低黄色瘤胃球菌数量的趋势(P < 0.10)。牛至精油和莫能菌素对56、70日龄犊牛瘤胃中溶纤维丁酸弧菌有显著的交互作用(P≤0.05)，表现为同时添加牛至精油和莫能菌素降低了溶纤维丁酸弧菌的数量。在56日龄时，牛至精油和莫能菌素对栖瘤胃普雷沃氏菌有交互作用的趋势(P < 0.10)，而在70日龄时则呈显著的交互作用(P≤0.05)，表现为同时添加牛至精油和莫能菌素降低了栖瘤胃普雷沃氏菌的数量。由表 7可以看出，牛至精油和莫能菌素对56、70日龄犊牛瘤胃中胃蛋白酶浓度存在显著的交互作用(P≤0.05)，表现为同时添加牛至精油和莫能菌素降低了瘤胃中胃蛋白酶的浓度。
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表 6 牛至精油和莫能菌素对犊牛瘤胃微生物区系的影响 Table 6 Effects of OEO and MON on ruminal microflora of calves |
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表 7 牛至精油和莫能菌素对犊牛瘤胃消化酶活性的影响 Table 7 Effects of OEO and MON on rumen digestive enzyme activities of calves |
血清生化指标不仅是了解动物机体健康状况的有效工具，同时也能反映动物对饲粮的利用、营养物质的吸收和代谢状况以及部分组织器官机能的变化[28]。血清中TP和ALB也能体现动物饲粮中蛋白质的营养水平及动物对其消化吸收的程度，此外，怀孕、哺乳和炎症都会影响TP的浓度，犊牛血清中的ALB浓度较低可能与长期腹泻时肝损伤或蛋白质分解代谢有关[29]。大量的研究发现，犊牛血清中TP与免疫球蛋白浓度之间存在相关性[30]。在本研究条件下，牛至精油提高了犊牛56日龄时TP的浓度，而试验组中ALB的浓度无显著差异说明该阶段犊牛并不是因为腹泻引起免疫应答而导致TP的浓度升高，本团队前期的研究结果表明，添加牛至精油能够提高犊牛血清中免疫球蛋白的浓度[31]，这可能是牛至精油组中TP浓度升高的原因之一，另一方面，TP浓度高也可能是因为蛋白质代谢旺盛[32]，因此，饲粮中添加牛至精油可以在免疫系统平衡的前提下，提高犊牛免疫力，有利于促进犊牛的生长。BUN能够直观的反映出动物体内含氮物质的代谢情况，也是反映饲粮蛋白质利用效率的指标之一[33]。本试验中，牛至精油组犊牛血清中BUN的浓度未受到影响，说明牛至精油对犊牛体内的氮代谢无显著影响。Gümüş等[34]研究表明，添加200或400 mg·kg-1牛至精油并未显著改善绵羊BUN的浓度，这与本研究结果相一致。莫能菌素具有调控反刍动物瘤胃发酵参数的作用，降低饲料损耗，改善营养物质利用率[35]。本试验结果表明，在犊牛56、70日龄时，日粮中添加莫能菌素有降低血清中尿素氮浓度的趋势，这与Ding等[36]报导的研究结果基本一致。
本试验中，犊牛血清脂代谢相关指标值均在正常范围内，未受到牛至精油和莫能菌素的影响，这可能是新生犊牛抵抗力较弱，动物机体需要消耗体内吸收的能量物质维持免疫防御系统的正常免疫应答，阻止病原体的入侵，清除病原体产生的毒素，并维持机体内环境稳定，这使得机体用于生长所积累的能量和营养物质转而维持免疫反应或抵抗病原体，这可能也是新生犊牛骨骼肌沉积缓慢的原因之一。
血清中SOD、CAT、GSH、GSH-Px和T-AOC的浓度均可反映机体的抗氧化能力。本研究发现，饲粮中添加4 g·kg-1牛至精油显著增加了犊牛血清中SOD、GSH和GSH-Px的浓度。Gümüş等[34]研究表明，饲粮中添加牛至精油显著提高了羊肝GSH和肌肉组织中SOD和CAT的浓度，提高了机体的抗氧化能力。Zhang等[37]在猪的饲粮中添加牛至精油能够增加血清SOD和GSH-Px的浓度以及肝中SOD的浓度，这些研究与本研究结果相一致。植物精油中的酚类活性物质能够诱导内源性抗氧化剂相关基因和转录因子上调，进而增加反刍动物的内源性抗氧化剂，这些内源性抗氧化剂包括芳基烃受体和核因子E2相关因子[38]。通常情况下，犊牛断奶后会出现应激反应，并对犊牛部分血液指标产生影响，本试验第一次采集瘤胃液和血液样品距离犊牛断奶已有14 d，且本研究中的血清生化指标不是判断断奶应激的直接标志物，间接受到应激反应的影响较小，牛至精油组提高了断奶14 d后血清中部分抗氧化指标的浓度，说明了牛至精油的抗氧化性能可能改善犊牛由于断奶而产生的氧化应激反应。在犊牛70日龄时未发现牛至精油的抗氧化作用，这可能是由于犊牛断奶后产生的断奶应激反应刺激了机体内源性抗氧化剂协同外源性抗氧化剂共同作用于氧化应激反应，并随着犊牛日龄增长，应激反应减弱，整个机体的抗氧化系统也逐渐处于平衡状态。
3.2 饲粮中添加牛至精油和莫能菌素对犊牛瘤胃微生物区系和消化酶活性的影响新生犊牛瘤胃尚未发育，主要依靠皱胃和肠道的凝乳酶和胃蛋白酶水解脂肪、蛋白质、乳糖。随着日龄的增加，精料的采食，瘤胃迅速发育，犊牛在56日龄时，瘤胃的发育已占整个胃容积的60%[39]，瘤胃中真菌占整个微生物生物量的8%~20%[40]，大量研究已经证明了真菌能够增强瘤胃中纤维素的降解[41]。在本试验条件下，饲粮中添加牛至精油对真菌无显著影响，但降低了产琥珀酸丝状杆菌在瘤胃中的数量，这与Lin等[42]报道相一致，饲粮中添加含有牛至或香芹酚的混合精油均未显著影响真菌在湖羊瘤胃中的数量，但发现含有香芹酚的试验组中产琥珀酸丝状杆菌的数量降低，而在另一项研究中发现，添加20 mg·L-1含有百里香酚的混合精油显著降低了真菌在奶牛瘤胃中的数量[43]，周瑞等[9]研究表明，饲粮中添加7 g·d-1牛至精油显著增加了绵羊瘤胃中真菌和产琥珀酸丝状杆菌的数量。以上研究结果表明，不同精油之间的活性物质可能存在协同或拮抗作用，亦或在反刍动物不同的生长阶段，添加牛至精油对瘤胃微生物产生不同的作用效果。有研究表明，产琥珀酸丝状杆菌对抗生素具有较强的耐受力，而黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌对抗生素较为敏感[44]，饲喂添加有离子载体饲料的时间越长，真菌对莫能菌素的抵抗力也增强，这与本研究结果相一致，莫能菌素未能影响真菌以及产琥珀酸丝状杆菌的数量，但降低了瘤胃中黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌的数量，这可能是瘤胃球菌属对莫能菌素较敏感[44]。相关研究表明，牛至精油能提高瘤胃球菌属在瘤胃中的数量[9]，然而本研究发现，牛至精油只提高了白色瘤胃球菌在瘤胃中的数量，黄色瘤胃球菌的数量没有发生显著变化，这可能是由于菌群之间存在协同作用，也存在拮抗作用，黄色瘤胃球菌的生长可被白色瘤胃球菌所产生的细菌素抑制[45]。
栖瘤胃普雷沃氏菌、溶纤维丁酸弧菌和嗜淀粉瘤胃杆菌是瘤胃中3种主要的蛋白降解菌。本研究发现，同时添加两种添加剂时则显著降低了溶纤维丁酸弧菌的数量，这种拮抗作用同时也显著降低了栖瘤胃普雷沃氏菌的数量。王志博等[46]报道，奶牛日粮中添加莫能菌素能显著提高瘤胃中栖瘤胃普雷沃氏菌数量，而显著降低溶纤维丁酸弧菌的数量，这与本研究结果相一致。Tekippe等[47]在泌乳牛的饲粮中添加牛至叶发现有提高瘤胃中溶纤维丁酸弧菌数量的趋势，而栖瘤胃普雷沃氏菌的数量不受影响。而在体外试验中，Patra和Yu[48]的研究结果表明，0.5 g·L-1的牛至精油提高了溶纤维丁酸弧菌和栖瘤胃普雷沃氏菌的数量，这一结果与本研究基本一致，也说明牛至精油能对瘤胃内的蛋白质降解菌产生不同程度的影响。
原虫可消化瘤胃内三分之一的纤维，瘤胃纤毛虫能够直接将淀粉和植物纤维素转变成挥发性脂肪酸[49]。Newbold等[50]报道，绵羊饲粮中添加0.11 g·d-1含有百里香酚的混合精油对瘤胃中原虫数量无显著影响，这与本研究结果相一致。此外，饲粮中添加莫能菌素降低了原虫在瘤胃中的数量，这与大多数的研究结果相同[51]。
瘤胃中大量的厌氧细菌、原生动物和真菌产生一系列微生物代谢物，然后被瘤胃生态系统中存在的其他微生物种类进一步利用或通过瘤胃中产生的微生物酶消化和代谢，这种非常高效的纤维素分解机制有助于提高饲料转化的效率[52]。Moharrery和Das[53]研究表明，绵羊瘤胃中瘤胃微生物的数量和代谢与消化酶活性存在密切的关系。本研究中，饲粮中添加牛至精油和莫能菌素对瘤胃中纤维素酶、α-淀粉酶和脂肪酶的浓度无显著影响，但显著提高了胃蛋白酶的浓度，这可能是由于牛至精油提高了降解蛋白质相关细菌在瘤胃中的数量，例如：栖瘤胃普雷沃氏菌是瘤胃内数量最多的蛋白质降解菌，溶纤维丁酸弧菌不仅有产纤维素酶的能力，也能产生淀粉酶和蛋白质酶。此外，饲料中同时添加两种添加剂产生的交互作用降低了胃蛋白酶活性，这可能是由于牛至精油中含量较高的酚类化合物和离子载体的协同作用加强了抗菌活性。由于与纤维降解有关的细菌(如产琥珀酸丝状杆菌和瘤胃球菌)的数量在牛至精油的作用下此起彼伏，这可能是纤维素酶的浓度未发生显著变化的主要原因。α-淀粉酶和脂肪酶的浓度未发生显著变化，这需要进一步验证与其相关的细菌在瘤胃中的数量，如广泛存在于瘤胃中的淀粉降解菌-牛链球菌(Streptococcus bovis)以及已知只有一种的脂解厌氧弧杆菌(Anaerovibrio lipolytica)[54]。
4 结论本研究表明，饲粮中添加牛至精油(4 g·kg-1)能够提高犊牛的免疫力和抗氧化能力，而添加莫能菌素(3.6 g·kg-1)均未改善初生犊牛的免疫力和抗氧化能力，莫能菌素在抑制瘤胃内原虫数量上强于牛至精油，牛至精油对提高主要蛋白质降解菌数量的作用效果优于莫能菌素。此外，饲料中同时添加牛至精油和莫能菌素长期饲喂可能会对动物机体产生负面影响。总之，犊牛断奶期间使用牛至精油可改善犊牛的健康状况以及调控瘤胃微生物区系，牛至精油作为天然植物抗生素可替代犊牛期预防性治疗的其他类抗生素生长促进剂。
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