2. 日照市五莲县畜牧兽医局, 五莲 262300;
3. 福建省生猪疫病防控工程技术研究中心, 龙岩 364012;
4. 西南大学动物科学学院, 荣昌 402460
, ZHANG Lubin2, ZHANG Xuebing1, REN Meiyu1, YANG Xiaoyan1,3, NI Jingxuan4
, ZHOU Xiaoqiong1,3
2. Wulian County Animal Husbandry and Veterinary Bureau of Rizhao City, Wulian 262300, China;
3. Fujian Provincial Engineering Technology Research Center for Pig Disease Control, Longyan 364012, China;
4. College of Animal Sciences, Southwest University, Rongchang 402460, China
大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)引起的一种人畜共患的急性传染病，也是导致幼龄动物高死亡率的主要病因之一，长期制约着养殖业的发展[1-2]。幼仔兔感染E. coli后，如未得到及时、有效的治疗，其死亡率常在60%以上[2]。对E. coli感染仔猪采用药物治疗后，其死亡率仍在50%~90%，且存活个体的饲料报酬降低[1, 3]。我国广泛采用疫苗接种的方法控制此病，但疫苗接种后仍有一些动物不能产生有效的免疫应答，导致免疫失败[4-5]。因此，研究有效的方法来增强动物对E. coli的固有免疫力，或提高灭活大肠杆菌的免疫效力具有重要意义。
艾叶为菊科植物艾(Artemisia argyi Levl. et Vant.)的干燥叶。中医实践证明，艾叶的主要功效是温经止血，散寒止痛，调经安胎，为治疗妇科下焦虚寒、寒客胞宫或胎动不安之要药[6]。现代药理研究表明，艾叶主要含挥发油、三萜类成分和黄酮类成分等，具有止血、镇痛、抗炎等作用[6-7]。我们的前期试验证明，艾叶提取物可以提高肉兔的非特异性免疫指标和生产性能[8-10]。本研究用艾叶水提液给家兔饮水，评价其对灭活大肠杆菌免疫效力和机体抗E. coli固有免疫的影响，并探讨可能的细胞和分子机制，为养殖生产中采用艾叶作为免疫增强剂抗E. coli提供数据参考。
1 材料与方法 1.1 菌株和灭活大肠杆菌的制备菌株：致病性大肠杆菌(O55K5)由浙江省农业科学院馈赠，分离于大肠杆菌病兔死亡病例[11]，用LB肉汤培养基增殖和传代，用LB琼脂培养基进行活菌计数。
灭活大肠杆菌的制备：将培养3代的菌液用生理盐水洗涤3次后，加入终浓度为0.2%的甲醛溶液，放入恒温摇床中(37 ℃，200 r·min-1)灭活48 h，经无菌和安全性检验合格后，调整菌液浓度至5×109 CFU·mL-1备用。
1.2 药品和试剂艾叶购自安徽省亳州市兴和药业有限公司；LB琼脂和LB肉汤培养基均为杭州百思生物技术有限公司产品；纯化的山羊抗兔Ig抗体和HRP标记的山羊抗兔IgG、IgM、IgA抗体均为SouthernBiotech公司产品；内毒素检测鲎试剂盒为厦门鲎试剂生物科技股份有限公司产品；MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser和TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司。
1.3 艾叶水提液的制备称取艾叶100 g放入砂锅中，用超纯水常温浸泡30 min。分别加入10和8倍量超纯水文火煎煮2次，每次1 h。合并滤液，用旋转蒸发仪(50 ℃，0.098 Mpa，20~40 r·min-1)减压浓缩至100 mL。最终含药量为1 g·mL-1，密封后放入4 ℃冰箱保存备用。
1.4 实验动物6周龄普通级雌性新西兰白兔(0.50~0.62 kg)，购自上海市松江区松联实验动物场，饲喂灭菌饲料和纯净水，室内温度为(20±1) ℃。动物适应饲养5 d后开始试验。
1.5 试验设计 1.5.1 艾叶水提液对灭活大肠杆菌免疫效力的影响将24只家兔随机分为3组，每组8只。组1在饮水中添加艾叶水提液，给药剂量为3 g·(只·d)-1，连续7 d；组2和组3自由饮水。第8天，组1和组2颈部皮下注射灭活大肠杆菌1 mL(含1×109 CFU)；组3注射等量的生理盐水作为空白对照(分组情况见表 1)。免疫后14 d，各组耳缘静脉采血，检测血清中特异性抗体水平。采血后各组动物颈部皮下注射大肠杆菌活菌2 mL(含5×109 CFU)，密切观察家兔的发病和死亡情况，连续72 h。
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表 1 试验分组和处理 Table 1 Experimental groups and treatment measures |
将18只家兔随机分为3组，每组6只。组4在饮水中添加艾叶水提液，给药剂量为3 g·(只·d)-1，连续7 d；组5和组6自由饮水。第8天，组4和组5颈部皮下注射大肠杆菌活菌1 mL(含5×108 CFU)，组6注射生理盐水作为空白对照(分组情况见表 2)。密切观察动物的发病情况，连续48 h。攻毒前心脏采血2 mL，放入EDTA抗凝管中充分混匀，用于血常规和总抗体检测。攻毒后12 h心脏采血，1 mL放入促凝管中，用于血液生化检测；1 mL与肝素钠抗凝剂1:1混匀后，用于血液LPS浓度测定和大肠杆菌计数。攻毒后48 h放血处死家兔，检测脾中与LPS-TLR4信号通路相关炎症因子的mRNA表达水平。
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表 2 试验分组和处理 Table 2 Experimental groups and treatment measures |
采用本实验室建立的间接ELISA方法，主要步骤如下：用大肠杆菌菌体蛋白(自制)包被酶标板，以l:100稀释的待检血清为一抗，分别以1:4 000稀释的HRP标记的山羊抗兔IgM或IgG为二抗，后经TMB显色和H2SO4终止后，用酶标仪检测OD450 nm吸光值。
1.6.2 总IgM、IgG和IgA检测采用本实验室建立的间接ELISA方法，主要步骤如下：用无标记的山羊抗兔Ig抗体包被酶标板，以l:50稀释的待检血清为一抗，分别以1:3 000稀释的HRP标记的山羊抗兔IgM、IgG或IgA为二抗，后经TMB显色和H2SO4终止后，用酶标仪检测OD450 nm吸光值。
1.7 血常规和血生化检测将EDTA抗凝血和促凝血样品送至龙岩市人民医院，采用全自动血球分析仪(Sysmex XN-1000)进行血常规检测，采用全自动生化分析仪(Sysmex BM6010/C)进行血液生化检测。
1.8 血液中细菌含量检测将肝素钠抗凝血立即用无菌生理盐水稀释20倍，取0.2 mL涂布于LB琼脂培养皿上，每个样品3个重复。平皿放37 ℃恒温培养箱中培养24 h后计数。
1.9 血液中LPS浓度检测将肝素钠抗凝血离心(4 ℃，5 000 r·min-1)10 min，收集上清液，按照内毒素检测鲎试剂盒说明书步骤进行LPS浓度的定量检测。
1.10 RT-PCR法检测细胞因子收集家兔脾组织，用MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取总RNA，再用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser合成cDNA。最后用TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒，以β-actin为内参，通过RT-PCR(染料法)检测脾细胞中目的基因(TLR4、TNF-α、IL-1β、IRF7、IFN-β)的相对表达量。引物由生工生物工程(上海)公司合成并验证，序列见表 3。使用StepOnePlusTM Real-Time PCR System(美国ABI)操作，反应体系为20 μL。反应程序：预变性(95 ℃，30 s)，变性(95 ℃，5 s)，退火/延伸(60 ℃，30 s)，共40个循环。结果采用2-ΔΔCt方法计算目的基因的相对表达量。
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表 3 引物序列表 Table 3 Nucleotide sequences of the primers |
借助SPSS 20.0软件中单因素方差分析和独立样本T检验进行组间比较。*代表差异显著(P＜0.05)；**代表差异极显著(P＜0.01)。
2 结果 2.1 艾叶提高了灭活大肠杆菌诱导的血清抗体水平在家兔的饮水中添加艾叶水提液，7 d后注射灭活大肠杆菌。由图 1可以看出，与对照组相比，用药组极显著地提高了血清特异性IgM和IgG抗体水平(P＜0.01)。在整个试验过程中，用药组未发现任何异常及不良反应。
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图 1 艾叶对灭活大肠杆菌诱导特异性抗体水平(免疫后14 d)的影响 Fig. 1 Effects of Artemisia argyi on the level of specific antibodies (14 days post immunization) induced by inactivated E. coli |
用致病性大肠杆菌攻毒后，未免疫组家兔在10 h后开始出现精神沉郁、饮食废绝、呼吸急促、被毛粗乱、迅速消瘦和腹泻等症状，并在24 h左右开始死亡，48 h内的存活率为12.5%。而免疫组的存活率分别为87.5%(7/8, 艾叶组)和50%(4/8, 对照组)，两组之间存在明显差异(图 2)。
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图 2 艾叶对免疫动物攻毒保护作用的影响 Fig. 2 Effects of Artemisia argyi on the protective effect of immunized animals against E. coli |
如图 3所示，用艾叶水提液给家兔饮水7 d后，显著提高了血清中总IgG和IgA抗体水平(P＜0.05)，但对IgM抗体产生没有显著影响。
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图 3 艾叶对家兔血清总抗体水平的影响(给药后7 d) Fig. 3 Effects of Artemisia argyi on the level of total antibodies in the sera of rabbits (7 days after administration) |
和对照组比较，给家兔口服艾叶水提液7 d后，提高了血液中白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和血小板的数量。其中，显著提高了中性粒细胞数量(P＜0.05)，极显著提高了血小板数量(P＜0.01)，结果见图 4。
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图 4 艾叶对家兔血常规的影响(用药后7 d) Fig. 4 Effects of Artemisia argyi on routine blood parameters of rabbits(7 days after administration) |
家兔口服艾叶水提液7 d后，用小剂量大肠杆菌攻毒。12 h后，艾叶组动物血液中的大肠杆菌含量和LPS浓度显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)低于对照组(图 5)。
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图 5 艾叶对家兔清除大肠杆菌能力的影响(攻毒后12 h) Fig. 5 Effect of Artemisia argyi on the ability of rabbits to clear E. coli(12 h post the challenge) |
家兔口服艾叶水提液7 d后，用小剂量大肠杆菌攻毒。和空白组比较，攻毒后12 h，谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)显著或极显著地升高(P＜0.05或P＜0.01)。艾叶组能显著地降低攻毒所导致的AST和ALT升高(P＜0.05)，其水平与空白组无显著差异。结果见图 6。
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图 6 艾叶对大肠杆菌攻毒所致肝损伤的影响(攻毒后12 h) Fig. 6 Effect of Artemisia argyi on liver damage induced by E. coli attack(12 h post the challenge) |
如图 7所示，与空白组比较，大肠杆菌攻毒后48 h，脾组织与LPS-TLR4信号通路相关的炎症指标(TLR4、TNF-α、IL-1β、IRF7、IFN-β)的mRNA表达均出现极显著上调(P＜0.01)；艾叶组家兔的TNF-α mRNA表达显著低于对照组(P＜0.05)，TLR4、IL-1β、IRF7和IFN-β的mRNA表达极显著低于对照组(P＜0.01)。除IL-1β外，艾叶组各指标与空白组无明显差异。
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图 7 艾叶对大肠杆菌诱导急性炎症反应的影响(攻毒后48 h) Fig. 7 Effect of Artemisia argyi on acute inflammation induced by E. coli attack(48 h post the challenge) |
随着大肠杆菌(E. coli)耐药性日趋严重，抗菌药物的临床疗效明显下降，增加了治疗、研发成本，也缩短了新药的应用周期[3, 12]。疫苗接种的方法能在很大程度上控制大肠杆菌病的发生，但很多养殖场接种了疫苗之后仍有疾病的暴发[4-5]，提示当前的疫苗仍需要进一步改进。本研究发现，给家兔口服艾叶水提液后，能极显著地促进灭活大肠杆菌诱导的特异性IgM和IgG抗体的产生(图 1)，且能明显提高免疫动物的攻毒保护力(图 2)，表明艾叶能增强灭活大肠杆菌的免疫效力。
鉴于E. coli的多重耐药性和抗生素使用的毒副作用，选择安全、有效、廉价的中草药来防控动物大肠杆菌病是有前景的[13-17]。我们前期的研究已经证实，艾叶提取物能促进肉兔的生长，免疫器官发育，并能改善肉品质[8-10]。本研究观察到，艾叶水提液能显著提高家兔血清中总IgG和IgA水平(图 3)，升高血液中免疫细胞(尤其是中性粒细胞和血小板)的数量(图 4)，并能促进机体对E. coli和LPS的清除能力(图 5)。有研究认为，血液中总免疫球蛋白(尤其是总IgA)的水平与动物对E. coli的攻毒保护力呈正相关[18-19]。白细胞(尤其是中性粒细胞)和血小板在抗E. coli感染早期发挥关键作用，与机体对E. coli的抵抗力以及败血症的进展和预后密切相关[20-22]。以上结果说明，艾叶能增强家兔对E. coli的固有免疫力。E. coli感染动物后，会在体内增殖并释放以LPS为主的各种毒素，激活TLR4信号通路，引起急性炎症反应和病理损伤[23-24]。AST和ALT主要存在于肝细胞内，会因肝细胞中毒、脂肪变性或炎症等造成其释放到血液中[25-28]。血清中AST和ALT含量是反映肝健康状况的重要指标，可以比较敏感地监测到肝是否受到损害[29-30]。我们发现，用E. coli给家兔攻毒后12 h，引起血液中AST和ALT显著升高(图 6)，提示了肝损伤；艾叶组的AST和ALT水平与空白组无显著差异(图 6)，表明艾叶可能具有保肝作用，这与之前的研究结果一致[9]。E. coli攻毒后48 h，脾中与LPS-TLR4通路相关的炎症指标——TLR4、TNF-α、IL-1β、IRF7和IFN-β的mRNA呈现过度表达，提示急性炎症反应的存在。相比之下，艾叶组能显著或极显著地下调相关炎症因子的表达(图 7)，说明艾叶具有较好的抗炎作用，这可能是它发挥保肝作用的原因之一。
本研究用艾叶水提液给家兔饮水，显著增强了灭活大肠杆菌的免疫效力。同时，也提高了未免疫动物的抗E. coli固有免疫。这可能与艾叶能提高免疫细胞数量以促进抗体产生，升高血小板和中性粒细胞数量以增强对E. coli和LPS的清除能力，或通过调控炎症反应以减少细胞凋亡和组织病理损伤等相关。因此，艾叶作为一种抗大肠杆菌病中药免疫增强剂，具有很好的研究价值和临床应用潜力。
4 结论艾叶水提液给家兔饮水，一方面能显著增强灭活大肠杆菌诱导的血清特异性IgM、IgG抗体应答和对E. coli攻毒的保护率；另一方面，能显著升高未免疫动物血清总抗体水平，增加血液中性粒细胞和血小板的数量，增强E. coli攻毒后机体对细菌的清除能力，降低E. coli攻毒所致的AST、ALT升高以及与LPS-TLR4通路相关的急性炎症反应。因此，艾叶是一种优良的抗E. coli免疫增强剂。
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