2. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心, 扬州 225009
, TONG Xishuai1,2, ZHENG Jiaming1,2, ZHAO Hongyan1,2, GU Jianhong1,2, LIU Zongping1,2
2. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China
人和动物的骨质疏松症主要表现为骨组织减少，这主要是由于破骨细胞数量或活性增加引起的骨吸收增多所致[1]。破骨细胞可由小鼠骨髓巨噬细胞(bone marrow-derived macrophage，BMMs)和RAW264.7细胞系在体外经巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)和核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)诱导分化融合成为具有骨吸收活性的多核巨细胞[2]。破骨细胞主要参与生理性骨重建和病理性的骨吸收[3]。因此，保持破骨细胞的分化和功能正常十分重要[4]。近年来，关于自噬与骨代谢关系的研究较多。有研究认为自噬是破骨细胞形成所必须的。ATG5、ATG7和LC3等自噬相关蛋白对破骨细胞皱褶边缘的形成、分泌功能以及骨吸收活性起着重要的作用[5]。这些自噬蛋白通过引导溶酶体与细胞膜融合，参与溶酶体内容物向细胞外分泌，缺失了ATG5和ATG7基因的大鼠破骨细胞的骨吸收活性降低[6]。白藜芦醇[7]、雷帕霉素、依维莫斯[8]等药物均能引发细胞自噬，维持骨健康，也表明自噬积极参与骨生理平衡。但过高的自噬水平，则会发生负调节，甚至导致自噬性死亡[9]。
氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(5-amino-imidazole-4-carboxamide nucleotide, AICAR)作为腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)的经典激活剂[10]，结构与一磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)类似，进入细胞后转化为一磷酸衍生物，模拟AMP变构激活AMPK[11]。目前，AMPK在破骨细胞分化过程的作用仍旧存在争议[12]。Lee等[13]指出，AMPK是RANKL诱导破骨细胞形成过程中的负调控因子，AMPK抑制剂Compound C可促进原代破骨细胞前体的分化和骨吸收功能，体外敲除AMPK基因的小鼠表现出胫骨骨量减少[14]。而Quinn等[15]在小鼠体内注射AICAR后发现骨量大量减少，破骨细胞和成骨细胞数量均升高。但AICAR对破骨细胞自噬和分化的影响机制尚不明确。因此，本试验欲探究AICAR是否通过激活AMPK信号通路作用于破骨细胞的自噬和分化，确定AICAR在破骨细胞自噬和分化中的作用，为临床应用自噬相关药物治疗骨代谢性疾病提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物自扬州大学比较医学中心购买5周龄BALB/c公鼠8只(选择公鼠以防止雌性小鼠体内雌激素的干扰[16])。实验动物许可证号为SYXK(苏)2017-0044，实验动物的实施程序均严格遵循《实验动物管理条例》。
1.2 主要仪器与试剂5810R型冷冻离心机(Eppendorf，Germany)；TCS SP8 STED激光共聚焦显微镜(Leica，Germany)；高内涵分析系统(PerkinElmer，USA)；Tecan Sunrise光吸收酶标仪(Tecan，Switzerland)；α-MEM(Life Technologies，USA)；10%胎牛血清、Opti-MEM(Gibco，USA)；M-CSF、RANKL(R & D，USA)；细胞增殖-毒性检测试剂盒(DOJINDO，Japan)；TRAP染色试剂盒(Sigma，USA)；DAPI染色液(碧云天公司)；LipofectamineTM3000 Transfection Reagent(Invitrogen，USA)；LC3B单克隆抗体、ATG5单克隆抗体、Beclin1单克隆抗体、c-Fos单克隆抗体、AMPKα单克隆抗体、p-AMPK单克隆抗体、GAPDH单克隆抗体、HRP羊抗兔二抗、HRP兔抗鼠二抗(Cell Signaling technology，USA)；AICAR、NFATc1多克隆抗体，TRAP单克隆抗体(Abcam，USA)。
1.3 BMMs的分离和破骨细胞的培养小鼠脱颈处死后浸泡于75%酒精2 min，无菌分离出胫骨及股骨，置于预冷的α-MEM培养基中，剪开骨骼两端骨骺，使用无菌注射器吸取培养基冲洗骨髓腔。收集含有细胞的培养基，吹打成单个细胞悬液，过100及200目筛网后收集于离心管中，1 200 r·min-1离心5 min，弃上清。以1:5的比例加入灭菌PBS和红细胞裂解液重悬细胞，1 200 r·min-1离心5 min，弃上清。加入含10% FBS和30 ng·mL-1 M-CSF的α-MEM培养基重悬细胞，接种于培养皿中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养过夜，次日收集未贴壁的悬浮细胞，即为BMMs。将BMMs收集计数后，在96孔板上以25万·mL-1密度接种，用于CCK-8试验和TRAP染色试验，在6孔板和预置爬片的24孔板上以60万·mL-1的密度接种，分别用于Western blot试验和质粒转染试验，使用添加了30 ng·mL-1M-CSF和60 ng·mL-1RANKL的α-MEM培养基诱导分化，每2 d换液，共培养4 d。
分组为对照组和AICAR处理组。因本实验室前期已对AICAR使用浓度和时间进行了筛选，参照文献[17]，本试验选择0.5 mmol·mL-1作为使用浓度，处理时间为4 h。
1.4 抗酒石酸酸性磷酸酶染色鉴定破骨细胞选择培养4 d的细胞，根据TRAP染色试剂盒说明书进行染色，置于显微镜下拍照。
1.5 CCK-8法检测AICAR对细胞存活率的影响弃去培养基，加入新的培养基100 μL。每孔内添加10 μL CCK-8试剂，并设置空白对照组。置于培养箱中孵育2 h，孵育结束后于450 nm波长处测量每孔吸光度值，根据说明书计算细胞存活率。
1.6 高内涵分析细胞指数弃去培养基，加入4%多聚甲醛溶液固定细胞10 min，按TRAP染色试剂盒说明书步骤进行染色，染色完毕后加入DAPI染色液避光静置5 min，弃去DAPI染色液，加入适量PBS，低速振荡洗去DAPI染色液3次。使用高内涵分析系统分析细胞指数。设置放大倍数为200倍，每个孔拍摄69个不同区域以期完整记录整孔细胞，以Alexa633波长激发TRAP+细胞的颜色，364 nm波长激发DAPI染色液的颜色，设置程序以含3个及3个以上核的TRAP+细胞计作破骨细胞。破骨细胞的融合是分化必不可少的一步，融合率和破骨细胞面积一般成正比，因此面积的大小也是破骨细胞分化成熟的一个重要的标志。
1.7 qRT-PCR检测破骨细胞分化和自噬相关基因表达弃去培养基，用Trizol试剂提取两组细胞总RNA。根据260 nm处吸光度值和A260 nm/A280 nm值确定提取的RNA浓度和纯度。根据PrimeScriptTMRT试剂盒说明书进行反转录，得到相应的cDNA。根据ChamQTM Universal SYBRⓇ qPCR Master Mix说明书在荧光定量PCR仪上检测基因的Ct值，2-△△Ct法计算基因表达差异。目的基因引物序列见表 1。
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表 1 本试验所用引物序列 Table 1 Primer sequences used in this study |
弃去培养基，用预冷的PBS洗1次，每孔加入30 μL细胞裂解液，冰上裂解10 min后，使用细胞刮刮取细胞裂解产物，超声裂解30 s，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液。BCA蛋白浓度定量试剂盒测定蛋白浓度，并调整为一致浓度。以1:5的比例加入6×SDS-PAGE Loading Buffer，混匀后100 ℃水浴10 min，储存于-80 ℃冰箱备用。
使用12% SDS-PAGE凝胶进行蛋白样品的电泳，吸取等体积样品加入泳道，110 V恒压电泳。电泳完毕后采用恒压湿转法将蛋白转膜到PVDF膜上(110 V恒压90 min)。转膜结束，使用TBST配制的5%脱脂乳室温低速振荡封闭PVDF膜2 h。根据目的蛋白相对分子质量大小剪开PVDF膜，加入相应一抗(1:1 000)，4 ℃孵育过夜。次日回收一抗，TBST洗膜3次(10 min·次-1)，使用辣根过氧化物酶HRP标记的羊抗兔二抗(1:10 000)室温孵育2 h后回收二抗，TBST洗膜3次(10 min·次-1)。将PVDF膜与化学发光底物检测试剂混合液充分接触，然后将膜置于化学发光图像分析仪内，拍摄照片。使用Gelpro32图像分析软件检测条带灰度值，以GAPDH作为内参，目的蛋白的相对表达量=目的蛋白含量/GAPDH蛋白含量。
1.9 EGFP-pmCherry-LC3质粒转染BMMs诱导至第2天时，进行EGFP-pmCherry-LC3质粒转染，配制A液：25 μL Opti-MEM+1.5 μL Lip3000；B液：Opti-MEM+500 ng质粒+1 μL P3000，将A、B液混匀，室温孵育5 min后加入培养板中转染12 h。第4天时加入0.5 mmol·mL-1AICAR处理4 h，4%多聚甲醛溶液室温固定30 min，封片，激光共聚焦显微镜下观察荧光并摄片。一般认为，EGFP-LC3为绿色，在酸性条件下极不稳定，易淬灭，而pmCherry-LC3为红色，在酸性环境稳定性高，因此在溶酶体内EGFP-LC3淬灭，pmCherry-LC3稳定表达，呈现出红色聚点；EGFP- pmCherry-LC3在自噬小体内的中性环境下稳定表达，显示为黄色聚点。
1.10 统计学分析数据以x±s表示。以上数据采用SPSS19.0统计软件进行单因素方差分析，以P＜0.05(差异显著)、P＜0.01(差异极显著)作为差异显著性判断标准。
2 结果 2.1 TRAP染色鉴定破骨细胞如图 1所示，TRAP染色后呈现紫红色，且细胞核数目≥3的多核巨细胞可判断为破骨细胞[2]。
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图 1 TRAP染色鉴定破骨细胞 Fig. 1 Osteoclasts were identified by TRAP staning |
CCK-8法检测细胞存活率，结果如图 2所示，与对照组相比，AICAR处理组细胞存活率没有显著变化(P>0.05)。结果说明0.5 mmol·mL-1 AICAR对破骨细胞无明显毒性。
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图 2 AICAR对破骨细胞存活率的影响 Fig. 2 Effects of AICAR on cell survival rate in osteoclasts |
结果显示(图 3)，与对照组相比，AICAR处理组p-AMPKα/AMPKα的表达量极显著上调(P＜0.01)。提示AICAR处理破骨细胞4 h，可促进AMPKα磷酸化，激活AMPK。
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与对照组相比，**.P＜0.01 **.P < 0.01 versus control 图 3 AICAR对破骨细胞AMPK活性的影响 Fig. 3 Effects of AICAR on the AMPK phosphorylation in osteoclasts |
破骨细胞经AICAR处理后，进行TRAP和DAPI染色，细胞核数≥3的TRAP+细胞为破骨细胞。高内涵分析结果表明，与对照组相比，AICAR显著减少TRAP+细胞率和平均面积(P＜0.05)，TRAP+细胞的荧光强度也有显著的变化(P＜0.05)，平均圆度没有显著变化(图 4)，说明AICAR可抑制破骨细胞分化成熟。
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与对照组相比，*.P＜0.05 *.P < 0.05, versus control 图 4 AICAR对破骨细胞相关参数的影响 Fig. 4 Effects of AICAR on relative cell indexes of osteoclasts |
如图 5所示，与对照组相比，AICAR处理组破骨细胞的AMPK、NFATc1、LC3、p62蛋白对应的mRNA水平无显著变化，c-Fos和TRAP蛋白对应的mRNA水平极显著下调(P＜0.01)，p62蛋白对应的mRNA水平显著下调(P＜0.05)，LC3、ATG5蛋白的mRNA水平显著上调(P＜0.05)。提示AICAR在一定程度上影响了破骨细胞的分化和自噬水平。
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与对照组相比，**.P＜0.01，*.P＜0.05 **.P < 0.01, *.P < 0.05, versus control 图 5 AICAR对破骨细胞分化和自噬相关蛋白相应mRNA水平的影响 Fig. 5 Effects of AICAR on differentiation and autophagy protein at mRNA levels of osteoclasts |
如图 6所示，与对照组相比，AICAR处理组破骨细胞的NFATc1、c-Fos、CTSK蛋白水平极显著下降(P＜0.01)，TRAP蛋白水平显著下降(P＜0.05)。结果提示AICAR抑制破骨细胞的分化和骨吸收活性蛋白的表达。
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与对照组相比，**.P＜0.01，*.P＜0.05 **.P < 0.01, *.P < 0.05 versus control 图 6 AICAR对破骨细胞分化相关蛋白NFATc1、c-Fos、TRAP、CTSK表达的影响 Fig. 6 Effects of AICAR on NFATc1, c-Fos, TRAP, CTSK proteins expression level of osteoclasts |
自噬相关蛋白结果如图 7所示，与对照组相比，AICAR处理组破骨细胞的LC3-Ⅱ、ATG5和Beclin1蛋白水平极显著升高(P＜0.01)，p62蛋白表达水平极显著下调(P＜0.01)。
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与对照组相比，**.P＜0.01 **.P < 0.01 versus control 图 7 AICAR对破骨细胞自噬相关蛋白表达的影响 Fig. 7 Effects of AICAR on the expression level of osteoclasts autophagy related proteins |
自噬流相关指标结果显示(图 8)，对照组破骨细胞内极少有LC3荧光聚点，AICAR处理组破骨细胞内黄色荧光聚点和红色荧光聚点均增多，表明自噬小体和自噬溶酶体数量均增多，提示AICAR促进了破骨细胞的自噬流，该结果与Western blot结果吻合，AICAR处理显著上调破骨细胞内LC3-Ⅱ蛋白水平，而自噬的重要底物蛋白p62表达下调。以上结果说明0.5 mmol·mL-1AICAR处理4 h使破骨细胞自噬水平升高。
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图 8 AICAR对破骨细胞内LC3的影响 Fig. 8 Effects of AICAR on LC3 in osteoclasts |
AICAR因与AMP结构相似，在细胞内能够模拟AMP变构激活AMPK[11]，是AMPK的经典激活剂[10]。AMPK是细胞内的“能量传感器”，负责调节细胞内能量平衡[18]。研究表明，AMPK对破骨细胞分化有负调节作用[13]，也参与调控细胞自噬[19-20]。本试验以5周龄BALB/c小鼠的骨髓单核巨噬细胞诱导分化形成的破骨细胞为研究对象，添加AICAR，发现AICAR能够激活破骨细胞中AMPKα，上调细胞自噬水平，抑制破骨细胞的分化和骨吸收活性。
AMPK在破骨细胞分化过程中起着关键性作用。AMPK的缺失会导致破骨细胞面积和数量的增加[21]。Dong等[12]以RAW264.7细胞系诱导形成的破骨细胞为研究对象，添加AMPK抑制剂Compound C后发现破骨细胞内NFATc1、TRAP蛋白表达增加，添加AICAR处理后NFATc1、CTSK和TRAP蛋白表达水平下降。除此之外，高糖环境通过影响破骨细胞AMPK/mTOR/ULK通路抑制自噬和分化[22]，而二甲双胍作为广泛使用的糖尿病治疗药物，被证实可激活AMPK，也具有抑制破骨细胞分化的作用[23]。这与本试验结果一致，AICAR处理后，破骨细胞内NFATc1、c-Fos蛋白、TRAP、CTSK的蛋白表达均显著下调，c-Fos、TRAP的mRNA水平极显著下降。NFATc1和c-Fos作为破骨细胞分化的关键蛋白、TRAP和CTSK作为骨吸收的关键蛋白，其表达量的高低代表破骨细胞的分化和骨吸收活性的高低，证明AICAR降低了破骨细胞的分化和骨吸收活性。但也有研究指出AMPK活化是骨量减少的原因之一[15]，AICAR对破骨细胞的抑制作用与AMPK无关，AICAR影响骨细胞的功能而非抑制破骨细胞的分化。还有研究发现，在体内试验中使用AICAR，引起骨小梁体积和骨密度严重丧失，破骨细胞数量增多。在体外试验时，大剂量的AICAR(2 mmol·mL-1)短期作用(10~60 min)或小剂量(0.2 mmol·mL-1)长期作用(24 h)于破骨细胞，均能够刺激破骨细胞分化[15]。结合先前研究结果，推测AICAR对破骨细胞的影响可能还有其他机制，仍需要进一步探究。
自噬是广泛发生于真核细胞内一种自我清除的过程，可降解细胞内多余的蛋白或受损的细胞器[24]。目前研究发现AMPK调控细胞自噬有两条经典通路，一是抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路激活自噬，二是直接激活自噬起始物ULK从而参与调控线粒体自噬[25]。自噬参与破骨细胞骨吸收功能的过程[26]。mTOR是自噬的有效抑制剂[27]，雷帕霉素作为mTOR抑制剂，具有促进自噬的功能，可抑制破骨细胞的骨吸收活性[8]。这与本试验发现一致。荧光定量PCR结果显示AICAR处理组的LC3、p62蛋白的mRNA水平与对照组相比具有显著变化，与EGFP-pmCherry-LC3质粒的荧光聚点和Western blot结果一致，AICAR处理上调LC3、ATG5、Beclin1的蛋白水平，下调p62的表达水平，活化了破骨细胞内自噬流，表明AICAR增加破骨细胞自噬。NFATc1、c-Fos、TRAP、CTSK的蛋白表达均下调，表明AICAR能抑制破骨细胞分化。但Chung等[28]提出破骨细胞的活性与LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化一致。RAW264.7细胞向破骨细胞分化过程中，黄酮类药物山奈酚抑制自噬并且抑制分化[29]。卵巢切除引起的骨质减少被证实与破骨细胞自噬活性增加有关[5]。特异性敲除自噬关键基因ATG5的小鼠表现出骨质增加[23]。AICAR参与哪条通路调控破骨细胞自噬和分化，还需要进一步探究。
4 结论AMPK激活剂AICAR能增加破骨细胞内AMPK磷酸化水平，上调破骨细胞内的自噬水平，抑制破骨细胞分化和骨吸收蛋白活性。本试验结果可为骨质疏松症等骨骼相关疾病的防治或药物开发提供新的思路。
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