奶牛蹄叶炎是一种常见的奶牛蹄部疾病，按照病程分为急性型、亚急性、慢性型^[1-2]，该病发病率高，治疗困难，给奶牛养殖业造成巨大的经济损失^[3]。急性型蹄叶炎的病理变化表现为表皮层的表皮细胞与真皮层的基底膜脱落以及基底膜细胞的变形^[4]。目前针对急性型蹄叶炎的发病原因并无统一的说法，炎症和细胞外基质降解、代谢性疾病、内皮和血管功能障碍目前被认为是蹄叶炎发展的关键因素^[5]。目前已发表的用于研究马急性型蹄叶炎的模型有很多，如胰岛素模型^[4]、碳水化合物模型^[6]、黑胡桃素模型^[7]。相对于牛蹄叶炎的研究模型很少，低聚果糖(oligofructose，OF)模型^[8]是一个稳定而可靠的研究模型。有文献证明，由于能量代谢紊乱导致牛发生蹄病的案例层出不穷^[9]。用高能饲料饲喂蹄部健康的马能导致健康的马发生蹄叶炎并且蹄叶组织的代谢出现异常^[10]。在急性型蹄叶炎中马血浆^[11]和蹄叶组织中挥发性脂肪酸的代谢^{[4, 12]}出现异常。本文用低聚果糖过载诱导奶牛急性型蹄叶炎为研究模型，研究奶牛急性型蹄叶炎发病过程中血糖、血清胰岛素，以及血清脂质代谢的变化，为相关临床研究和后续研究奠定基础。

1 材料与方法 1.1 主要仪器设备和试剂

D240V型全自动生化仪(中国英诺华公司)、Accu-Chek Active罗氏血糖仪(德国Roche公司)、Sigma 3-30K型高速低温离心机(德国Sartorius公司)、U570-86型超低温冰箱(英格兰New Brunswick Scientific公司)、Epoch酶标仪(美国BioTek公司)。

低聚果糖购自山东百龙创园生物科技股份有限公司，纯度为食品级(98%)。胰岛素、瘦素、脂联素、CD36检测ELISA试剂盒购自江苏晶美生物科技有限公司。三酰甘油、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒购自江苏英诺华医疗技术有限公司。

1.2 实验动物及处理

从哈尔滨市青喜养殖场购进12头体格大小相近非妊娠期的中国荷斯坦母牛，年龄在18~20月龄(20.67±3.01)，体重355~403 kg(379.70 kg±19.77 kg)，参照Sprecher等^[13]的文献制定体况评分标准，评分在2.7~3.3(3.00±0.23)，无过往病史。每头母牛在饲养之前进行蹄部检查和跛行评分^[13]确保奶牛蹄部健康无跛行。奶牛饲养在由橡胶铺设的动物房内，由专人饲喂和管理，每天自由饮水，每天三次固定时间饲喂充足的饲草(总水溶性含糖量为8%)。在正式试验前饲喂30 d并且每天对奶牛进行牵溜使奶牛适应生存环境和试验流程。

将所有的奶牛随机分为两组(n=6)，分别为试验组和对照组，在试验的整个过程包括低聚果糖灌服(0 h)前3 d的适应期和随后3 d的试验期，对奶牛进行全天候的监控，以确保试验顺利进行。试验组在0 h灌服大量低聚果糖，剂量为17 g·kg^-1(按体重计量)，溶于20 mL· kg^-1(按体重计量)的温水中，经瘤胃导管一次性灌服。在之前3 d每天通过瘤胃导管灌服5%剂量的低聚果糖作为过渡期。对照组以相同的处理方式给予等体积的温水^[8]。在低聚果糖灌服前的72 h(-72 h)和低聚果糖灌服之后的0 h及以后的6、12、18、24、36、48、60、72 h，观察跛行情况，并进行颈静脉采血。

为保证奶牛的动物福利，在灌服低聚果糖后的18和24 h给予补液^[8]。

1.3 血液处理及检测指标

血液采集后取1 mL全血用于检测血糖，其余4 ℃存放过夜后，在4 ℃条件下3 500 r·min^-1离心15 min后取血清分装，置于-80 ℃冰箱保存。分别检测血清中胰岛素(ELISA)、三酰甘油(酶法)、总胆固醇(氧化酶法)、高密度脂蛋白胆固醇(清除法)、低密度脂蛋白胆固醇(清除法)、瘦素(ELISA)、脂联素(ELISA)、CD36(ELISA)的含量，按试剂盒说明进行操作。

1.4 数据统计与分析

用Spss22.0进行数据处理，采用双因素的方差分析进行数据统计，用GraphPad Prism 5.0软件进行统计图的绘制(GraphPad Software Inc，USA)。

2 结果

在试验过程中，所有对照组的奶牛均没有表现出蹄叶炎的临床症状，并且饮食正常。试验组的奶牛最早在给药后6 h开始出现腹泻，在给药后18 h全部出现腹泻症状，60 h之后逐渐恢复正常，最早在给药后6 h开始出现跛行，在给药后24 h所有试验组的奶牛均出现跛行，跛行评分^[13]均大于1，在48~60 h全部恢复正常，奶牛还伴有蹄温升高，指(趾)动脉亢进，瘤胃蠕动减慢。在试验过程中所有奶牛均以人道主义的方式对待。

2.1 血糖变化情况

低聚果糖灌服后6 h血糖与对照组相比极显著上升，维持到18 h。18 h之后血糖开始迅速下降(图 1)，试验组血糖与对照组相比基本持平，试验组的6、12、18 h与试验组0 h相比差异极显著(P < 0.01)。

2.2 胰岛素变化情况

灌服低聚果糖后，试验组胰岛素的含量在6 h后开始下降(图 2)，6、12 h的胰岛素含量与对照组相比差异极显著(P < 0.01)，与试验组0 h相比差异极显著(P < 0.01)，18和24 h胰岛素的含量回升与对照组相比无显著差异(P>0.05)，在36和48 h的胰岛素含量下降与对照组相比差异极显著(P < 0.01)，与试验组0 h相比差异显著(P < 0.05)。

2.3 脂代谢变化情况

低聚果糖灌服后，血清常见脂类物质总体上呈现下降的趋势。总胆固醇含量(图 3)从灌服后6 h开始下降，直至72 h，试验组血清总胆固醇含量与对照组相比显著下降，而且差异极显著，同时与试验组0 h相比也差异极显著(P < 0.01)。三酰甘油含量(图 4)和高密度脂蛋白胆固醇含量(图 5)在12 h开始极显著下降(P < 0.01)。三酰甘油含量在12~72 h与对照组和试验组0 h相比均下降且差异极显著(P < 0.01)。高密度脂蛋白胆固醇与三酰甘油差异性大致相同，但高密度脂蛋白胆固醇在24 h表现为正常。低密度脂蛋白胆固醇含量(图 6)与对照组相比在36 h开始极显著下降，与试验组0 h相比在24 h开始极显著下降直至72 h。

灌服低聚果糖之后，血清瘦素的含量(图 7)变化明显，试验组血清瘦素的含量在12 h开始显著升高，24 h恢复正常，可能与给予奶牛支持治疗有关，24 h之后试验组血清瘦素含量极显著升高，并且与试验组0 h相比也显著升高。CD36(图 8)和脂联素含量(图 9)无明显变化。

3 讨论

奶牛蹄叶炎是指奶牛蹄真皮的弥散性无败性炎症，本病最常侵害前肢的内侧指和后肢的外侧趾，其他指(趾)也有发病。如今，蹄叶炎是困扰奶牛产业发展的一个非常重要的疾病，尤其对于高产奶牛的影响更加明显^[14]。目前关于蹄叶炎的病因和致病机制还没有得到很好的解释，这极大地阻碍了奶牛蹄叶炎的诊治和预防工作，造成了较大经济损失。随着全球奶牛产业的发展，蹄叶炎得到了越来越多的重视。目前认为蹄叶炎是动物机体代谢紊乱的局部表现，而饲料中营养物质的不均衡是引起牛蹄叶炎的一个主要原因。

奶牛急性型蹄叶炎在治疗上较为困难，Van Eps等^[15]报道低温治疗能抑制低聚果糖诱导急性型蹄叶炎模型中蹄叶组织中趋化因子、细胞因子、细胞黏附分子和环氧化酶等基因的表达，阻断早期蹄叶炎的损伤过程。虽然低温冷冻治疗能取得一定的效果但由于操作麻烦、设备要求高，并不适合广泛开展。

蹄叶炎的病因一直是研究的热点问题，在马和奶牛上均展开大量的研究，大部分归结为与蹄叶组织的能量代谢衰竭有关^[16]。蹄叶炎的研究虽然很多，但大都依托于牧场亚临床性蹄叶炎和慢性型蹄叶炎进行研究，并未见对急性型蹄叶炎血液糖脂代谢研究的报道，本试验通过建立奶牛急性蹄叶炎模型来探讨奶牛急性蹄叶炎血液中糖脂代谢的变化，同时也可探究急性型蹄叶炎向亚临床型和慢性型蹄叶炎发展的不同变化。

在本研究中，奶牛灌服低聚果糖之后的症状，与Thoefner等^[17]建立的奶牛低聚果糖诱导急性型蹄叶炎模型的症状表现相同，奶牛在给药后6 h出现腹泻，其中四头奶牛出现了明显跛行，其余两头在给药后24 h出现明显跛行，同时出现蹄温升高，指(趾)动脉亢进，瘤胃蠕动减慢^[8]，因此该模型的合理性得到了证明。Thoefner等^[18]同时进行了该模型的病理组织学切片的研究，发现低聚果糖诱导的奶牛急性型蹄叶炎蹄部病理变化与自然发病的蹄叶炎病理变化相同，证实了低聚果糖诱导奶牛急性型蹄叶炎模型的可行性。

本研究为了奶牛福利考虑在18和24 h对奶牛采取补液措施，在血液结果中部分指标在18和24 h没有显著差异可能与补液有关。血糖浓度在6、12和18 h显著升高，但在6和12 h内胰岛素含量显著下降，18和24 h恢复正常，之后36和48 h显著下降，18和24 h胰岛素含量恢复正常可能与在这两个时间点对病牛进行补液有关。Tadros等^[19]证明，患有垂体中间部机能障碍的马伴有高胰岛素血症发生，同时该类马伴有蹄叶炎发生^[20]，而且以慢性为主，证明了慢性型蹄叶炎可能与高胰岛素血症有关^[21]。在本研究中，随着血糖升高血清胰岛素的含量下降，在本课题组其他人员的研究中发现，试验组中奶牛皮质醇受体的表达量上升，皮质醇的表达量升高有可能抑制了胰岛素的表达，造成血清胰岛素含量下降。

在马的慢性蹄叶炎研究中发现，长期高脂高糖的饮食能诱发马慢性蹄叶炎，与此同时马体内糖脂代谢发生紊乱，挥发性脂肪酸和三酰甘油的含量显著上升^[22]。董书伟等^[23]报道，患有蹄叶炎的奶牛血液中TG表达量上升，HDL-C的表达量下降。Keller等^[11]对大量饲喂低聚果糖之后的马血浆进行核磁共振代谢研究，发现磷脂酰胆碱和低密度脂蛋白胆固醇增加；而在本研究中高密度脂蛋白胆固醇含量显著下降的同时三酰甘油的含量也显著下降，这可能与疾病的发展时期有关，也可能是急性型蹄叶炎与慢性型蹄叶炎和亚临床型蹄叶炎的区别之一。

在本研究中脂代谢产物显著下降，尤其以高密度脂蛋白胆固醇和三酰甘油下降较为明显，表明在奶牛急性型蹄叶炎时脂代谢发生异常。虽然Keller等^[11]的研究显示，饲喂低聚果糖马的低密度脂蛋白胆固醇含量升高，与本研究结果不相符，但Keller等^[11]是长期灌服低聚果糖来建立马蹄叶炎模型，本研究是通过一次性大剂量灌服低聚果糖建立奶牛急性型蹄叶炎模型，在模型和研究动物上均有所差别，由此可见虽然急慢性蹄叶炎均有脂代谢异常的发生，但指标的变化趋势并不完全一致，这也提示急、慢性型蹄叶炎的治疗需要采取不同的措施。

在本研究中，36 h试验组瘦素的变化较为明显，与对照组相比显著增加，而与试验组0 h相比瘦素在60 h显著上升，而瘦素水平的升高可能预示着肥胖的发生^[24]，而Elzinga等^[25]发现慢性型蹄叶炎的马确实发生肥胖，并且有代谢综合征的表现，这与急性型蹄叶炎血清脂类物质下降的结果相反，这可能预示着在急性蹄叶炎转化为下一个病程的时候血液脂质含量会发生改变，在疾病的转归过程中伴随有肥胖和代谢综合征的发生。

4 结论

建立奶牛急性型蹄叶炎模型，并且检测该模型的糖脂代谢，发现在奶牛急性型蹄叶炎模型中血糖含量升高，相反胰岛素浓度下降，这可能是诊断奶牛急性型蹄叶炎的候选指标，同时脂代谢发生紊乱，但脂代谢指标的变化与其他类型蹄叶炎的变化趋势不同，这也可能是急性型蹄叶炎与其他类型蹄叶炎的区别，因此在治疗的过程中要依照不同病程进行区别治疗。