沙门菌(Salmonella)属肠杆菌科，革兰阴性肠道杆菌，可引起胃肠炎、伤寒、败血症及肠外灶性感染等，发病率较高。常污染蛋、肉、奶等畜产品，引起食源性中毒，每年全球约有28亿因沙门菌感染引起的腹泻病例^[1]。近年来，国内外沙门菌感染事件频繁发生，给人类健康带来严重的威胁，也给全球畜牧业造成巨大的损失。沙门菌的致病性主要来源于大量的毒力因子，包括菌毛黏附素、鞭毛、外膜蛋白、脂多糖、毒力岛和毒力质粒等^[2]。

双组分信号转导系统(two-component signaling transduction system, TCSTS)是一种普遍存在于细菌中的重要信号传导系统，也是基因表达的重要调控系统^[3-4]，与细菌的致病性、耐药性等有着密切的关系。BaeSR双组分系统最初在大肠杆菌中发现，其控制大肠杆菌中的第三个包膜应激反应^[5]。BaeSR与细菌毒力有关，Lee等^[6]研究表明，在甲型副伤寒沙门菌中，BaeR蛋白参与炎症应答反应，BaeR上调诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA水平。Guerrero等^[7]研究发现在鼠伤寒沙门菌中，BaeR通过与sodA启动子区域的直接相互作用正向调节sodA，sodA对鼠伤寒沙门菌中的血清抗性和生物膜形成均有影响。AcrB属于AcrAB-TolC外排泵系统中的RND外排泵，在细菌外排药物和毒力方面均有重要作用。Xuan等^[8]研究发现AcrB缺失突变体对人肠上皮细胞和鼠巨噬细胞的侵袭受损，表明AcrB外排功能缺失导致鼠伤寒沙门菌的毒力降低。在阴沟肠杆菌和肺炎克雷伯菌中，acrAB的缺失导致突变体在小鼠中引起全身性感染和肺炎的能力受损^[9-10]。BaeSR双组分系统的功能主要是通过调节下游基因实现的，如acrB、acrD、mdtABC等，AcrB作为沙门菌中9个RND外排泵之一，它的存在会掩盖其他外排泵的作用^[11]，因此本研究在baeSR缺失的基础上进一步缺失acrB来探究BaeSR在沙门菌中发挥的功能。

转录组测序(RNA-Sequencing, RNA-Seq)可以对基因转录产物进行分类分析，确定功能基因的转录结构，例如基因编码区的起始位点、基因序列末端结构，分析基因的剪接模式以及基因转录后水平的修饰作用，并量化各转录本在个体发育过程中和不同生理条件下的表达差异变化，已成为测量和比较各物种和条件中基因表达水平的标准方法^[12-13]。目前，baeSR和acrB对鼠伤寒沙门菌在毒力调控方面研究较少，其调控机制亦不清楚，因此本研究通过RNA-Seq技术筛选鼠伤寒沙门菌baeSR和acrB缺失株与原始株的毒力相关差异表达基因，采用荧光定量PCR(real-time PCR)方法进行验证，探究baeSR和acrB对鼠伤寒沙门菌毒力的调控作用，为进一步研究鼠伤寒沙门菌致病机制提供参考。

1 材料与方法 1.1 实验菌株

鼠伤寒沙门菌体外诱导环丙沙星耐药株CR由本实验室保存，acrB基因缺失株(CRΔacrB)、baeSR和acrB基因双缺失株(CRΔbaeSRΔacrB)均由本实验室构建。

1.2 细菌培养

分别挑取CR、CRΔacrB、CRΔbaeSRΔacrB的单菌落接种于LB肉汤中，37 ℃ 180 r·min^-1振荡过夜培养。次日，取新鲜菌液以1:100接种于LB肉汤中，37 ℃ 180 r·min^-1振荡培养至菌液OD_{600 nm}值为0.4~0.6，4 ℃ 5 000 r·min^-1离心10 min，取上清液，菌体沉淀用无菌PBS洗涤3次，收集菌体沉淀，-80 ℃保存备用。

1.3 样品测序

将样品送至北京诺禾致源科技股份有限公司，使用Illumina HiSeq^TM2500/Miseq^TM进行测序。具体步骤包括总RNA的提取与检测，文库构建与文库质量检测，库检合格后进行HiSeq/MiSeq测序。

1.4 生物信息学分析 1.4.1 测序数据质量评估比对分析

对原始测序序列(sequenced reads)进行测序错误率分布检查和测序数据过滤，用Bowtie2将过滤后的测序序列进行基因组定位分析。

1.4.2 差异表达基因的筛选

采用HTSeq软件对各样品进行基因表达水平分析，基因组比对结果使用FPKM(fragments per kilobase of exon per million fragments mapped)法进行计算，根据得到的基因的表达量(FPKM值)进行样本间差异分析。差异基因的筛选标准为fold change的绝对值≥2且Q-value＜0.005。

1.4.3 差异表达基因的功能分析

采用GOSeq方法对所有筛选到的差异表达基因进行GO富集分析，明确差异表达基因在GO term上的分布情况。以KEGG数据库中通路为单位，应用超几何检验，找出在差异表达基因中显著性富集的通路，进一步确定差异表达基因所参与的代谢通路及发挥的生物学意义。

1.5 差异表达基因荧光定量PCR验证

随机选取7个差异表达基因，根据GenBank上该基因序列，以GAPDH为内参基因，利用Primer5.0软件设计引物，引物名称及序列见表 1。采用SYBR Green Ⅰ法进行mRNA表达量分析，数据采用2^-ΔΔCt法进行处理。

2 结果 2.1 差异表达基因的筛选

以fold change的绝对值≥2且Q-value＜0.005为标准筛选差异表达基因。CRΔacrB/CR组共筛选到1 320个差异表达基因，其中上调426个，下调894个；CRΔbaeSRΔacrB/CR组共筛选到1 377个差异表达基因，其中上调405个，下调972个。从两组结果中筛选出部分与细菌毒力相关的差异表达基因(表 2)。

2.2 差异表达基因的差异GO富集分析

对差异表达基因进行GO富集分析结果显示，CRΔacrB/CR组有955个差异表达基因显著富集。差异基因参与的生物过程主要富集在有机物质代谢过程、细胞代谢过程、生物合成过程、核酸代谢过程、基因表达、细胞过程的调节等方面；细胞组分主要富集在膜部分、细胞器、细胞质、细胞核、外膜等方面；分子功能主要富集在水解酶活性、核酸结合反应、小分子结合反应、转移酶活性、裂解酶活性等方面(图 1)。CRΔbaeSRΔacrB/CR组有967个差异表达基因显著富集。差异基因所涉及的生物过程主要有有机物质代谢过程、细胞代谢过程、生物合成过程、杂环代谢过程、基因表达、生物调节等；细胞组分主要有膜部分、细胞器、细胞质、膜蛋白复合物、细菌型鞭毛等；分子功能主要有结合反应、水解酶活性、转移酶活性等(图 2)。

2.3 差异表达基因的差异KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析显示CRΔacrB/CR组有109个基因富集在7个细菌毒力相关的KEGG通路中，其中双组分系统52个，鞭毛组件21个，沙门菌感染12个，上皮细胞的细菌入侵8个，细菌趋化性7个，细菌分泌系统6个，脂多糖生物合成3个(图 3)；CRΔbaeSRΔacrB/CR组有121个基因富集在7个毒力相关的KEGG通路中，其中双组分系统57个，鞭毛组件25个，沙门菌感染17个，上皮细胞的细菌入侵8个，细菌趋化性6个，细菌分泌系统5个，脂多糖生物合成3个(图 4)。

2.4 差异表达基因的荧光定量PCR验证

随机选择7个差异表达基因进行荧光定量PCR验证，real-time PCR验证结果与RNA-Seq分析结果趋势基本一致(图 5)，证实了RNA-Seq分析结果的可靠性。两者之间表达倍数有所差异，可能因两者的仪器、试剂、操作误差或者两种分析方法的灵敏度和检测标准不同所致。

3 讨论

鼠伤寒沙门菌是一种致病性革兰阴性菌，可导致人类和其他哺乳动物的胃肠炎等多种肠道疾病。当细菌进入肠道内壁的上皮细胞时，会诱导上皮细胞膜皱褶形成，膜皱褶能够将黏附的细菌吞噬到沙门菌囊泡(Salmonella-containing vacuoles, SCV)内，从而在宿主细胞生存和繁殖^[14]。Buckley等^[15]研究发现鼠伤寒沙门菌acrB突变体不能诱导膜褶皱，并且不能定植鸡肠道；Webber等^[16]通过转录组学发现鼠伤寒沙门菌acrB突变体中存在大量基因表达变化，包括对入侵必不可少的沙门菌致病岛(SPI)基因的下调，说明acrB对鼠伤寒沙门菌的致病性至关重要。在大肠杆菌中，当BaeR过表达时，能激活59种与TCS、趋化运动、鞭毛合成、麦芽糖运输、多种药物运输有关的基因^[17]。本研究之前发现acrB基因缺失及baeSR、acrB双基因缺失后鼠伤寒沙门菌CR对HeLa的侵袭和黏附能力均显著下降，表明baeSR、acrB缺失后鼠伤寒沙门菌的毒力减弱。为进一步探索其致病机制，通过转录组测序从分子水平上对CR、CRΔacrB、CRΔbaeSR ΔacrB进行研究。

RNA-Seq结果显示两个比较组筛选到的毒力相关基因均主要富集在双组分系统、鞭毛组件、沙门菌感染、上皮细胞的细菌入侵、细菌趋化性、细菌分泌系统、脂多糖生物合成等通路中。其中双组分系统富集到的有ompR、ompN、ompS和rpoS等；鞭毛组件富集到的有fliA、flgB和flhA等；沙门菌感染富集到的有sipC、sopB、sopE2、sseI和sseJ等。

双组分系统在沙门菌致病性方面发挥着重要的作用，可以调控细菌生长、毒力、生物膜形成和群体感应等。ompR、ompN和ompS均编码外膜蛋白，在细菌黏附与侵袭、某些功能物质的合成及物质运输等方面发挥重要作用，并且能够避免细菌被宿主免疫系统靶向识别和清除。OmpR是一个转录调控因子，可以结合在csgD启动子区域增强它的表达^[18]，OmpR-P能够与hliC和hliD的启动子区域直接结合，通过促进hliC和抑制hliD的表达，调控沙门菌对上皮细胞的侵袭^[19]；林立萍等^[20]研究发现OmpR通过直接调节prgH和间接调节iagA、invF增加侵袭相关基因的表达，从而增强伤寒沙门菌对上皮细胞的侵袭力。RpoS是沙门菌生物膜形成的主要调控因子，且调节许多应激反应相关基因的表达，与细菌对于环境胁迫的耐受性相关。当细胞受到营养限制时，RpoS产生全局表达变化，提供针对许多应激的交叉保护^[21]；Abdullah等^[22]研究发现转录调节因子RpoS (σ³⁸)的状态影响生物膜形成，并且证实沙门菌在各种胁迫环境下rpoS基因存在显著的突变。本研究中，在双组分系统通路中富集到外膜蛋白相关基因ompR、ompN和ompS等；生物膜形成相关基因rpoS和rpoN等，表明baeSR和acrB可能通过调控外膜蛋白和生物膜形成影响鼠伤寒沙门菌的毒力。

鞭毛是细菌重要的运动器官，鞭毛运动性是细菌入侵宿主细胞的先决条件。此外，鞭毛还参与生物膜的形成和一些毒力因子的表达调控。转录因子FliA是细菌鞭毛生物合成基因的主要调节因子，越来越多的证据表明，除了运动性之外，FliA还参与控制多种细菌行为。Lo等^[23]证明铜绿假单胞菌的FliA是一种重要的全局转录调控因子，涉及多种病理生理网络，包括鞭毛生物合成、细胞毒性、侵袭、黏附、细菌脱落，细菌间竞争和绿脓菌素生成。FlgB构成鞭毛基体的杆状结构，其缺失会损害膜表面上细丝和其他结构的形成，从而阻止鞭毛介导的蛋白质分泌，缺乏flgB的沙门菌会失去运动性，表明鞭毛功能失常^[24]。细菌鞭毛中存在一个类似Ⅲ型分泌系统的装置，可以分泌一些毒性因子，FlhA与FlhB、FliP、FliQ、FliR、FliH、FliI和FliJ组成鞭毛的Ⅲ型分泌装置，将致病细菌的毒力效应蛋白直接注射到真核宿主细胞中^[25]。本研究中，acrB基因缺失后，鞭毛相关基因fliA、flgB和flhA的表达量显著降低，acrB和baeSR基因双缺失后表达量进一步下降，提示fliA、flgB和flhA影响鼠伤寒沙门菌的毒力。

sipC基因编码的SipC蛋白为Ⅲ型分泌系统(T3SS)的主要效应蛋白之一，具有双重功能：效应子的转位和肌动蛋白调节，在沙门菌感染过程中，SipC可转运效应蛋白，并参与宿主肌动蛋白动力学，导致宿主肌动蛋白细胞骨架的重组，以促进细菌侵袭^[26]。SopB和SopE及其旁系同源物SopE2均是由沙门菌致病岛1编码的T3SS转位的效应子，并且对于驱动肌动蛋白细胞骨架重排和宿主细胞表面的膜动力学以促进侵袭是必需的。García-Gil等^[27]研究发现SopB可以激活Akt-YAP途径以促进B细胞内的沙门菌存活；Valenzuela等^[28]研究发现sopE2对鼠伤寒沙门菌的毒力至关重要。SseI是沙门菌致病岛2 (SPI2)编码的T3SS细菌效应蛋白，也称为SrfH，是鼠伤寒沙门菌维持小鼠长期慢性全身感染所必需的，SseI可以抑制原代巨噬细胞和树突状细胞的正常细胞迁移，削弱宿主清除病原菌的能力^[29]；Brink等^[30]研究发现鼠伤寒沙门菌效应物SseI通过异源三聚体Gi蛋白的脱酰胺作用抑制趋化性并增加宿主细胞存活。沙门菌分泌的效应物SseJ可以结合氧固醇结合蛋白1(OSBP1)，并可以与另一个SPI2效应物，去泛素化酶SseL合作，将OSBP1引导至SCV，以促进SCV膜的稳定性^[31]。本研究中，sipC、sopB、sopE2、sseI和sseJ在沙门菌感染通路中显著富集，提示它们参与沙门菌毒力的调控。

4 结论

利用转录组学技术研究baeSR和acrB缺失后对相关毒力基因mRNA表达量的影响，发现鞭毛、菌毛、生物膜、外膜蛋白和脂多糖等相关毒力基因的mRNA表达量显著变化，且这些毒力基因主要富集在双组分系统、沙门菌感染、细菌分泌系统和上皮细胞的细菌入侵等通路中，表明双组分系统BaeSR和外排泵AcrB可能介导这些毒力因子和途径影响鼠伤寒沙门菌的毒力，为鼠伤寒沙门菌致病性的进一步研究提供理论依据。