非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种由许多病因所致的肝细胞内脂肪过度沉积(占肝质量的5%以上)为主要特征的临床病理综合征，以肝细胞脂肪变性、脂质蓄积为主要特征[1]。NAFLD在世界上很多国家都有着较高的发病率，且发病率在全世界范围内逐年上升，已经影响全球多达三分之一的人群[2]。而非酒精性单纯性脂肪肝(nonalcoholic simple fatty liver，NAFL)作为NAFLD中主要疾病谱之一，研究其有效疗法至关重要。
肾素血管紧张素系统(renin angiotensin systems，RAS)作用于全身多个器官[3]。研究发现，机体处于病理状态时，RAS的两条通路血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)/血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)/血管紧张素Ⅱ 1型受体(angiotensin Ⅱ receptor type 1，AT1R)和血管紧张素转化酶2(ACE2)/血管紧张素1-7(angiotensin 1-7，Ang1-7)/MasR发挥着相互拮抗的作用[4]。研究证实，多种致病因素都可以引起ACE/AngⅡ/AT1通路的异常激活，促进慢性肝病的进程，导致氧化应激、炎症、纤维化等病理过程，而ACE2/Ang1-7/MasR通路被认为具有与前者相反的作用，即对肝有着一定的保护作用[5-6]。Vergniol等[7]指出，人体内NAFLD的进展与RAS的激活相关。汪亮[8]发现，RAS的激活尤其是AngⅡ的生成增加，可通过促进一系列的氧化应激、炎症反应等引起肝组织脂质过氧化反应，加速肝组织的脂肪变性，进而促进NAFLD的进展。ACE2作为RAS的关键酶，在机体内源性表达，ACE2可以通过水解AngⅡ产生Ang1-7，后者通过其受体MasR发挥抗炎、抗损伤，缓解慢性肝病等作用[9]。Cao等[10]提出，ACE/AngⅡ/AT1R经典通路有助于NAFLD的发展，而ACE2/Ang1-7/MasR通路可以抑制肝胰岛素抵抗，具有预防和治疗肝脂质代谢的潜在作用。Cengiz等[11]在人体试验中研究发现，在肝免疫ACE2非酒精性脂肪性肝炎患者中，活检证明ACE2和纤维化呈负相关，证实ACE2确实影响肝纤维化的进程，推测ACE2对肝组织有显著保护作用。ACE2或许可以成为治疗NAFLD疾病的新靶点。但相关的研究并不深入。
本研究以高脂饲料饲喂SD大鼠诱导大鼠发生非酒精性单纯性脂肪肝，通过测定·OH、T-AOC、SOD、TNOS、IL-1β、TNF-α以及IL-10含量，明确单纯性脂肪肝发生时肝氧化应激及炎症损伤过程中肝局部RAS各成员的变化；探讨非酒精性单纯性脂肪肝发展中ACE2在肝组织中的抗损伤作用，初步探讨其可能机制。
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 主要试剂及仪器三酰甘油(TG)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、羟自由基(·OH)、超氧化物歧化酶(SOD)、总一氧化氮合酶(TNOS)、总抗氧化能力(T-AOC)测试试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、血管紧张素1-7(Ang1-7)、白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素10(IL-10)ELISA试剂盒均购自南京奥青生物技术有限公司；ECL化学发光检测试剂盒购自Tanon公司等。
兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)一抗(货号：AP0063)；兔抗大鼠ACE2一抗(货号：ab108252)、兔抗大鼠ACE一抗(货号：ab75762)、兔抗大鼠AT1R一抗(货号：ab124505)、兔抗大鼠MasR一抗(货号：ab156018)、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(货号：BS13278)均购自Abcam公司。
POWER-PAC300电泳仪(美国Bio-Rad公司)；POWER-PAC HC转印仪(美国Bio-Rad公司)；Mikro-22R高速冷冻离心机(德国Andreas Hettich GmbH8 CO.KG)；Synergy2多功能酶标仪(美国伯腾BioTek)；光学显微镜(日本奥林巴斯)；Tanon-3900全自动化学发光图像分析系统(上海Tanon科技有限公司)等。
1.1.2 实验动物雄性SD大鼠30只，体重(140±10)g，购自扬州大学实验动物中心。动物合格证号：SCXK(苏)2014-0001。试验前，动物适应性饲养1周。
1.2 方法 1.2.1 动物分组与处理SD大鼠称重，随机分笼，普通饲料饲喂1周，自由饮水。1周后随机分成3组(每组10只)：正常对照组(对照组)，喂食基础饲料(麦麸35%+面粉30% +玉米面30%+鱼粉2%+骨粉2%+食盐1%)；模型组，喂食高脂饲料(大鼠普通饲料+猪油+植物油+蔗糖+鸡蛋)+纯净水；洛伐他汀用药组，喂食高脂饲料+抗脂肪肝药物洛伐他汀50 mg·(kg·d)-1。自由饮水和采食，试验过程中动物的饲养和处置符合医学伦理标准。
自由采食6周后，禁食12 h，每只大鼠心脏采血并分离血清，-20 ℃保存。大鼠安乐处死后取肝，称重后，一部分用生理盐水反复冲洗去除血液，-80 ℃保存；另一部分肝组织固定于10%福尔马林溶液中用于病理组织学检查。
1.2.2 肝指数的测定肝指数(liver index，LI)又称肝体比(liver to body weight ratio)，能够反映动物总体营养状况和肝的病变状态。末次灌胃后，禁食24 h后称体重，处死大鼠剥离其肝, 立刻称取质量，计算肝指数。计算公式如下：
肝指数=肝质量(mg)/大鼠体重(g)。
1.2.3 大鼠血清中相关生化指标的测定测定血清中TG、ALT、AST的水平。
TG含量测定：磷酸甘油氧化酶-PAP法。按试剂盒说明书操作，500 nm波长处测吸光度值。
ALT和AST的活性测定：均采用赖氏法。具体步骤按照试剂盒说明书操作，510 nm波长处吸光度值。
1.2.4 大鼠肝中氧化应激相关指标的测定测定肝组织匀浆中T-AOC、TNOS、·OH及SOD的水平。
1.2.4.1 肝组织匀浆的制备及蛋白浓度的测定在冰水浴下进行，将0.2 g肝组织加2 mL 0.9%NaCl溶液，充分匀浆，4 ℃ 3 000 r·min-1离心30 min，取上清于干净EP管中。BCA法测定上清中蛋白质浓度。
1.2.4.2 肝组织中氧化应激相关的测定均按试剂盒方法操作。
T-AOC的测定：比色法，520 nm处测定吸光度值。
TNOS的测定：比色法，530 nm下测定吸光度值。
·OH的测定：Fenton法，在550 nm处测其吸光度值。
SOD的测定：WST-1法，450 nm测定SOD的活性。
1.2.5 大鼠肝组织中炎性因子的测定均选用双抗体夹心ELISA法测定。具体按测定试剂盒说明书进行操作。以空白孔调零，酶标仪测450 nm的吸光度值，根据标准品得出标准曲线及回归方程，根据待测样品的吸光度值计算相应的IL-1β、TNF-α和IL-10含量。
1.2.6 大鼠肝病理组织学观察取每只大鼠相同位置的肝组织，立即固定在10%福尔马林固定液中，常规方法制作石蜡切片及苏木精-伊红(HE)染色，光学显微镜下观察肝组织的病理变化。
1.2.7 肝组织中ACE、ACE2、AT1R、MasR蛋白表达水平的检测使用Western blot法检测肝组织匀浆中的蛋白表达。操作方法参照王鲲等[12]方法。5%浓缩胶，8%分离胶，上样量10 μL，100 V电泳1.5 h。PVDF膜转印，5%脱脂奶粉封闭。4 ℃孵育一抗(4个蛋白-抗皆1:1 000稀释)过夜，洗膜后室温孵育二抗(1:5 000稀释)。凝胶成像系统分析并拍照。
1.2.8 肝组织匀浆中AngⅡ、Ang1-7含量的测定间接ELISA法测定AngⅡ含量，双抗体夹心法测定Ang1-7含量。具体操作按照试剂盒说明书进行。以空白孔调零，450 nm波长测量各孔吸光度值，根据标准品得出标准曲线及回归方程，计算出各个样品AngⅡ、Ang1-7的浓度。
1.2.9 数据统计与分析所有数据均采用SPSS 19.0统计软件分析，差异显著性检验采用独立样本t检验(independent-sample t-test)。所有数值均以“平均值±标准差(x±s)”表示。
2 结果 2.1 大鼠非酒精性单纯性脂肪肝模型的建立 2.1.1 大鼠肝指数的变化整个试验期内各组大鼠生长良好，无腹泻及死亡现象且均未出现异常行为。各组大鼠肝指数见图 1。如图 1所示，模型组和用药组的肝指数均高于对照组，其中模型组差异显著(P＜0.05)。
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与对照组相比，*.差异显著(P＜0.05) Compared with control group, * indicates significant difference (P < 0.05) 图 1 大鼠肝指数(n=10) Fig. 1 Liver index of rats(n=10) |
结果见表 1，模型组TG含量极显著升高(P＜0.01)，模型组肝组织匀浆中的AST、ALT活性同样极显著升高(P＜0.01)。使用抗脂肪肝药物洛伐他汀后，TG含量以及AST、ALT活力极显著降低(P＜0.01)。按照非酒精性脂肪肝病诊疗指南[13]中给出的诊断标准：NAFLD中血清ALT、AST可有小于5倍正常值的轻度至中度增高。本试验模型组大鼠血清中，ALT水平接近正常值的2倍(P＜0.01)，并伴有TG含量的极显著升高(P＜0.01)，与肝脂肪变病症相符。
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表 1 大鼠血清三酰甘油的含量及谷丙转氨酶、谷草转氨酶的活性测定(x±s，n=10) Table 1 TC content and activity of ALT and AST in rat serum (x±s, n=10) |
结果见表 2，与对照组相比，模型组肝匀浆中氧化应激指标·OH、TNOS极显著升高(P＜0.01)，抗氧化应激酶T-AOC、SOD则极显著降低(P＜0.01)，即模型组大鼠处于氧化应激状态。与模型组相比，用药组·OH、TNOS极显著或显著降低(P＜0.01或P＜0.05)，T-AOC、SOD极显著升高(P＜0.01)，除T-AOC高于对照组外，所有指标介于对照组与模型组之间。说明用药可以减轻模型组氧化应激的损伤程度。
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表 2 大鼠肝匀浆中·OH、T-AOC、SOD和TNOS的活力(x±s，n=10) Table 2 Hydroxyl radical activity, total antioxidant capacity, superoxide dismutase activity and nitric oxide synthase activity in rat liver homogenate (x±s, n=10) |
如图 2所示，模型组与对照组相比，TNF-α、IL-1β均极显著升高(6.11±0.43 vs 2.53±0.58，P＜0.01；16.28±0.42 vs 5.59±0.45，P＜0.01)，IL-10极显著降低(6.88±0.27 vs 10.57±0.15，P＜0.01)。而用药组中的TNF-α、IL-1β与模型组相比显著下降(4.18±0.24 vs 6.11±0.43，P＜0.05；8.13±0.71 vs 16.28±0.42，P＜0.05)，用药组中的IL-10较模型组显著升高(9.91±0.23 vs 6.88±0.27，P＜0.05)。结果提示，模型组炎症因子释放增加，抗炎因子释放减少，存在严重的炎症反应；而用药后炎症因子释放减少，抗炎因子释放增加，炎症反应减轻。
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与对照组相比，*.差异显著(P＜0.05)；**.差异极显著(P＜0.01) Compared with control group, *. Indicates significant difference (P < 0.05); **. Indicates that the difference is extremely significant (P < 0.01) 图 2 大鼠肝组织中IL-1β、TNF-α和IL-10含量(n=10) Fig. 2 Contents of IL-1β, TNF-α and IL-10 in rat liver tissue(n=10) |
光镜下观察肝组织(图 3)，对照组大鼠肝细胞未见明显病变，肝细胞索排列整齐，核位于细胞中央，未见炎性细胞浸润，无脂肪变性。模型组肝细胞索状排列结构消失，肝细胞肿胀，出现气球样脂肪变性，细胞核边移。用药组，基本保持肝小叶的结构，但仍能见到肝细胞轻度脂肪变性，但病变较模型组明显减轻。
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图 3 大鼠肝组织病理学变化(HE染色) Fig. 3 Histopathological changes of rat liver (HE staining) |
通过以上指标可以看出，模型组大鼠肝指数、TG含量均明显升高，肝细胞内转氨酶及氧化应激水平皆明显升高，肝组织炎性因子释放增多，抗炎因子减少，肝细胞发生严重脂肪变性，可判定本试验模型组的大鼠发生了NAFL。
2.2 大鼠肝组织中RAS系统成员变化 2.2.1 大鼠肝组织中ACE、ACE2蛋白表达变化结果见图 4。模型组肝组织中ACE蛋白表达极显著高于对照组(1.264±0.053 vs 0.769±0.050，P＜0.01)，用药组ACE表达与模型组相比则显著下降(0.959±0.089 vs 1.264±0.053，P＜0.05)。模型组大鼠ACE2蛋白表达较对照组极显著下降(1.059±0.105 vs 0.732 ±0.065，P＜0.01)，用药组与模型组相比显著升高(0.732±0.065 vs 0.879±0.060，P＜0.05)。结果提示，高脂饲料诱导NAFL大鼠中，肝损伤严重，ACE表达升高，而ACE2表达降低。
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与对照组相比，*.差异显著(P＜0.05)；**.差异极显著(P＜0.01) Compared with control group, * indicates significant difference (P < 0.05); ** indicates that the difference is extremely significant (P < 0.01) 图 4 ACE、ACE2在大鼠肝组织中蛋白表达(n=10) Fig. 4 protein expression of ACE and ACE2 in rat liver (n=10) |
为了比较两者的优势状况，对ACE/ACE2的蛋白表达量进行分析，结果见图 5。模型组ACE/ACE2比值高于对照组，差异极显著(0.803±0.067 vs 1.246±0.072，P＜0.01)，提示此时ACE蛋白表达量上升。用药组ACE/ACE2比值显著下降(0.969±0.072 vs 1.246±0.072，P＜0.05)。结果提示用药可使ACE2表达增加，ACE表达减少，表明ACE2参与了NAFL疾病发生中的抗损伤过程。
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与对照组相比，*.差异显著(P＜0.05)；**.差异极显著(P＜0.01) Compared with control group, * indicates significant difference (P < 0.05); ** indicates that the difference is extremely significant (P < 0.01) 图 5 大鼠肝组织中ACE/ACE2的比值(n=10) Fig. 5 The ratio of ACE/ACE2 in rat liver tissue (n=10) |
如图 6，与对照组相比，模型组大鼠肝组织中AT1R蛋白表达水平显著上升(0.940±0.082 vs 1.084±0.111，P＜0.05)，用药组AT1R蛋白表达水平下降，但差异不显著(1.084±0.111 vs 0.977±0.080，P>0.05)。说明NAFL发生时，AT1R表达升高，与ACE的表达趋势一致。
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与对照组相比，*.差异显著(P＜0.05)；**.差异极显著(P＜0.01) Compared with control group, * indicates significant difference (P < 0.05); ** indicates that the difference is extremely significant (P < 0.01) 图 6 AT1R、MasR在大鼠肝组织中蛋白表达(n=10) Fig. 6 Protein expression of AT1R and MasR in rat liver (n=10) |
与对照组相比，模型组大鼠肝中MasR表达水平显著下降(1.183±0.066 vs 0.937±0.050，P＜0.05)，用药组较模型组MasR表达显著升高(0.937±0.050 vs 1.098±0.035，P＜0.05)。结果说明NAFL发生时，MasR表达显著下降，与ACE2的表达趋势一致。
2.2.4 大鼠肝组织AngⅡ、Ang1-7含量的变化由表 3可知，模型组大鼠肝组织匀浆中，AngⅡ含量极显著高于对照组(P＜0.01)，Ang1-7含量极显著升高(P＜0.01)。添加药物后，AngⅡ含量较模型组极显著降低(P＜0.01)，而Ang1-7含量较模型组极显著升高(P＜0.01)。结果提示用洛伐他汀可使Ang1-7含量表达升高，AngⅡ含量表达降低，Ang1-7参与NAFL发生时的抗损伤作用。
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表 3 大鼠肝匀浆中AngⅡ、Ang1-7含量(x±s，n=10) Table 3 Contents of AngⅡ and Ang1-7 in rat liver homogenate(x±s, n=10) |
AngⅡ与ACE及AT1R表达结果一致，随着NAFL发生，AngⅡ的含量升高；而与ACE2及MasR表达结果不同的是，Ang1-7的含量在用药组显著升高，推测ACE2/Ang1-7/MasR通路减缓NAFL的发展，是通过ACE2调节Ang1-7生成的增加而实现的。
通过以上指标得出，在NAFL损伤的大鼠模型中，肝局部RAS被激活，肝损伤较重的大鼠模型中，ACE/AngⅡ/AT1R通路成员表达升高，居于主导地位。
3 讨论非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是全身性疾病在肝的一种病理改变，关于其机制，Day和James[14]于1998年提出“NAFLD中二次打击假设”模型。第一次打击反映了肝细胞中三酰甘油(triglyceride，TG)和游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)的积累，这是IR、饮食增加和肝脂肪生成增加的结果。第二次打击涉及脂质过氧化、线粒体功能障碍和炎症，导致肝细胞损伤和肝纤维化的发展[15]。脂质过氧化可促进星状细胞增殖，促进纤维发生，而活性氧(reactive oxygen species，ROS)诱导细胞因子从肝细胞释放，导致各种免疫反应介导机制的启动，导致进一步的肝细胞损伤[15]。高脂饮食容易引起肥胖，而肥胖是导致NAFLD的一个公认的危险因素。Yan等[16]通过给大鼠饲喂高脂饲料获得NAFLD模型。本试验同样采用高脂饲料饲喂SD大鼠，大鼠血清中TG含量、ALT和AST活性明显升高，肝组织中氧化应激指标及TNF-α、IL-1β炎性因子含量显著升高，肝组织发生脂肪变性，说明模型组大鼠肝发生了非酒精性单纯性脂肪变性。
肾素血管紧张素系统(RAS)被认为是一种重要的代谢系统，对机体循环系统维持内环境稳态发挥重要作用[14]。已被证实可影响非酒精性脂肪肝病的发生发展[17]。研究发现组织局部RAS还具有调节肝细胞氧化应激、炎症反应等作用。RAS系统中的关键酶ACE2，可以通过调节AngⅡ的降解来限制其作用，并且可以增加Ang1-7的形成抵消AngⅡ的作用。Santos等[18]研究使用Ang1-7口服制剂使高脂喂养的小鼠肝中的促炎反应和脂肪沉积得以改善，肝脂肪变性和体重减轻，三酰甘油和转氨酶水平降低，所有这些发现都伴随着肝炎症因子的显著降低。Cao等[19]利用ACE2过表达载体转染人肝细胞株HepG2，ACE2对细胞氧化应激的改善作用能被Mas受体阻断剂A779抑制，而在FFA诱导的HepG2细胞中，Ang1-7/ACE2可减轻肝脂肪变性、氧化应激和炎症。
本研究结果显示，高脂饲料诱导大鼠6周的NAFL模型组中，AngⅡ、Ang1-7水平均升高，ACE、AT1R水平升高，ACE2、MasR表达下降，ACE/ACE2比值升高，说明ACE/AngⅡ/AT1R通路的激活处于优势。与霍苗苗等[20]研究长期高脂饲喂大鼠ACE通路活性升高结果一致。本试验模型组的大鼠中，氧化应激反应明显增加，抗氧化应激能力减弱，肝炎症活动显著增高。提示疾病发生时，肝功能发生损害，刺激RAS的激活，而AngⅡ的增加会进而促进炎症和氧化应激，这样相互促进，加速NAFL的发展。本试验中以降血脂药物洛伐他汀为阳性对照，进一步验证ACE2与NAFL导致的肝损伤中的关系。结果用药组ACE2/Ang1-7/MasR通路成员表达增加，取代了局部肝损伤时ACE/AngⅡ/AT1R通路的优势地位，此时氧化应激水平降低，促炎因子减少抗炎因子增多，表明ACE2参与了NAFL引起的氧化应激与炎症的抗损伤过程。
之前的研究发现，高脂饲料饲喂大鼠3周建立的轻度脂肪变性模型中，ACE2/Ang1-7/MasR通路在RAS系统中占主导地位，对ACE/AngⅡ/AT1R通路呈拮抗作用，对肝病的进程有一定的缓解作用[21]。而此次试验结果证实，高脂饲喂大鼠6周建立的NAFL模型中，ACE2/Ang1-7/MasR通路的拮抗作用减弱，ACE/AngⅡ/AT1R轴占主导地位，病情加重。对比两次试验提示，高脂饲喂大鼠肝RAS系统被激活，在肝轻度损伤中，ACE2/Ang1-7/MasR通路处于优势地位，而肝损伤加重，ACE/AngⅡ/AT1R通路处于优势地位。
总之，肝局部RAS系统两条通路在NAFL的发展过程中起着重要作用。肝细胞的损伤刺激RAS的激活，继而AngⅡ的增加促进炎症和氧化应激的发生，如此相互促进，加速了NAFL的进展和恶化。使用洛伐他汀干预可以恢复ACE2/Ang1-7/MasR通路的优势，肝内源产生的ACE2可能通过介导Ang1-7/MasR通路的激活发挥一定的抗损伤作用。
4 结论近年来，由于RAS与肝病发生的机制越加清晰，使用经典通路抑制剂或激活ACE2/Ang1-7/MasR通路是一种有前景的肝病治疗新策略，可以作为预防和治疗慢性肝病的新型治疗选择。本试验通过高脂饲料诱导大鼠6周，发生非酒精性单纯性脂肪肝，肝局部肾素血管紧张素系统处于激活状态，ACE/AngⅡ/AT1R通路异常激活，导致肝组织氧化应激、炎症反应，而ACE2/Ang1-7/MasR通路具有与前者相反的作用。试验结果表明，肝产生的内源性ACE2在外源性刺激物诱导肝损伤时，可能通过介导Ang1-7/MasR通路的激活在非酒精性单纯性脂肪肝的预防中发挥重要作用。结果提示：以ACE2/Ang1-7/MasR通路为靶点在早期预防NAFLD具有重要意义。
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