调节性T细胞(regulatory T cells，Tregs)是T细胞亚群，具有免疫调节功能，通过细胞接触和细胞因子调节机制发挥免疫抑制作用，进而抑制炎症反应、维持免疫稳态。抑制性细胞有多种类型，例如Tr1细胞(T regulatory-1 cells)^[1]、Th3细胞^[2]、CD8⁺ Foxp3⁺细胞^[3]、γδT细胞^[4]、NKT细胞^[5]、CD4^- CD8^- TCRαβ⁺细胞等，其中CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺细胞不同于其他抑制性细胞，其叉状头转录因子家族(forkhead box，Fox)的Foxp3是调节性T细胞最具特异性的标志分子，Foxp3对调节性T细胞的分化及功能发挥决定性作用^[6-7]。研究表明，Foxp3仅存在于有颌的脊椎动物中，鸡缺乏Foxp3基因^[8]。鸡的研究中，CD4⁺ CD25⁺细胞较早被鉴定为调节性T细胞，存在于大部分组织中，包括胸腺、骨髓、血液、脾、盲肠扁桃体和肺等。鸡的调节性T细胞来源于胸腺，在胚胎发育的第15天开始出现，但是比例较少。鸡孵化时，CD4⁺ CD25⁺细胞第一次输出，优先迁移至盲肠扁桃体^[9]。新近发现的调节细胞生长和分化的转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)具有免疫调节活性和抑制性，因此也可以作为调节性T细胞的标志物。Gurung等^[10]发现鸡CD4⁺T细胞、CD4⁺ CD25⁺细胞均可以表达TGF-β，即CD4⁺ TGF-β⁺细胞和CD4⁺ CD25⁺ TGF-β⁺细胞统称TGF-β⁺调节性T细胞，该细胞可以抑制效应T细胞的增殖，与哺乳动物的Foxp3⁺调节性T细胞功能类似。

沙门菌病是由沙门菌引起的人畜共患疾病。沙门菌能在禽类胃肠道持续生存，常呈现隐性感染，造成动物源性食品的污染^[11-13]，严重影响家禽养殖业和人类健康。由于畜禽生产中抗生素的滥用导致沙门菌耐药性越发严重，给沙门菌病的预防、诊断和治疗带来挑战。目前已经确认沙门菌有2 600种血清型，其中对肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis, SE)和鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium, ST)的研究较为广泛。沙门菌是典型的利用宿主免疫反应得以存活和增殖的致病菌，主动干扰抗原加工和提呈，诱导抗原提呈细胞(antigen presenting cell, APC)凋亡，导致宿主免疫失衡，而调节性T细胞具有免疫抑制功能，在抑制炎症反应、维持免疫稳态过程中发挥重要的作用，因此提示调节性T细胞可能与沙门菌感染过程有着密切联系，为了揭示沙门菌的免疫抑制机制，本试验选用鼠伤寒沙门菌毒株，构建沙门菌感染模型，探索TGF-β⁺调节性T细胞在沙门菌感染中的作用。

1 材料与方法 1.1 试验材料

鼠伤寒沙门菌21484标准菌株(Salmonella typhimurium CICC 21484)购自中国工业微生物菌种保藏中心(China Center of Industrial Culture Collection, CICC)、LB肉汤培养基(蕾创生物科技有限公司)、SPF雏鸡饲料(北京科奥饲料有限公司)、0.9%生理盐水(山东华鲁制药有限公司)，ELISA试剂盒(武汉华美生物科技有限公司)，KAPA荧光定量试剂盒(北京普凯瑞生物科技有限公司)，鸡脾脏淋巴细胞分离液试剂盒(天津市灏洋生物制品科技有限公司)，CD4-Alexa Fluor^Ⓡ700(Southern Biotech)、CD25-FITC(Bio Legend)、TGF-β1, 2, 3-APC(R & D systems)，流式细胞仪(Beckman Coulter)。

1.2 试验方法 1.2.1 试验动物

京星黄鸡H系雏鸡购自中国农业科学院北京畜牧兽医研究所昌平基地，其父母代均经过白痢净化。为了保证试验的严谨性，将1日龄雏鸡随机分为对照组(n=40)和感染组(n=80)，两组雏鸡均饲养于无菌隔离舱中(IPQ-3型负压隔离器，中国农业大学)，控制相同的温度、湿度，饲喂SPF饲料和无菌过滤人饮用水，自由采食和饮水，至7日龄，两组分别进行试验处理。

1.2.2 沙门菌的培养与计数

按照中国工业微生物菌种保藏中心提供的操作说明进行细菌复苏和传代培养，吸取200 μL菌液接种于200 mL LB肉汤培养基(1:1 000)，置37 ℃恒温摇床，10~12 h后进行传代培养，得到第二代菌液，同样方法传代培养至第四代，第四代菌液进行10倍浓缩(稀释液为生理盐水)，浓缩后的菌液作为感染菌液。将浓缩后菌液倍比稀释，分别涂布于亚硫酸铋琼脂(BS)培养板，每组三个重复，将涂布好的培养板置于37 ℃恒温培养箱，24 h后进行菌落计数，确定感染菌液浓度为3.5×10⁹ CFU·mL^-1。

1.2.3 感染模型的构建

感染组雏鸡于7日龄口服鼠伤寒沙门菌菌液，感染剂量为1 mL·只^-1。对照组雏鸡，于相同时间口服0.9%生理盐水，1 mL·只^-1。

1.3 样品采集

感染后48 h，统计不同时间点死亡率，分别采集两组雏鸡(对照组n=40，感染组n=80)的血液、脾、盲肠扁桃体。血液37 ℃平置，自然析出血清，用于检测血清炎症因子；脾直接用于提取调节性T细胞；盲肠扁桃体置于-80 ℃短暂保存，用于后续提取RNA做下一步分析。

1.4 死亡率统计

统计感染后48 h内雏鸡死亡数，包含死亡个体和濒死个体，濒死个体为炎症反应症状十分明显的个体，即羽毛蓬乱、不能站立、呼吸急促、精神极度沉郁、采食废绝、嗜睡、腹泻严重。

1.5 血清炎症因子测定

感染后随机挑选对照组和感染组(挑选存活个体，下同)血清，用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测血清炎症因子，测定指标包括鸡免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)、溶菌酶(lysozyme，LZM)，按试剂盒的方法进行操作。

1.6 盲肠扁桃体免疫反应相关基因转录情况

感染后随机挑选对照组(n=12)和感染组(n=11)的盲肠扁桃体，参考文献方法，对TLR4^[14-15]、NLRX1^[16]、NLRC5^[16]、IL-6^[17-18]、TNF-α^[19]、NF-κB^[20]、IL-10^[21]的转录量进行实时荧光定量PCR检测。实时荧光定量PCR，通过熔解曲线确保引物扩增的特异性，所得的数据使用2^-ΔΔCt方法处理。

1.7 脾CD4⁺T细胞、Tregs/CD4⁺T细胞比例检测

将新鲜的脾先用剪刀剪碎，再用组织研磨器充分研磨，此过程用匀浆冲洗液边研磨边冲洗，样本稀释液调整细胞悬液浓度为2×10⁸~1×10⁹个·mL^-1备用。将以上单细胞悬液小心叠加于等量的分离液液面上层，离心(550 g，30 min)，此时细胞分为四层，小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层到一新的离心管中，用细胞洗涤液洗涤两次，最后用PBS重悬细胞，调整细胞浓度为1.0×10⁶个·mL^-1。取1.0×10⁶细胞于流式管中，每管加入12 μL抗体混合液，其中CD4-Alexa Fluor^Ⓡ700、CD25-FITC和TGF-β1, 2, 3-APC或同型对照各1、1、10 μL，混匀，室温避光孵育30 min，每管加0.5 mL细胞固定液，4 ℃过夜，上机前用预冷PBS洗涤2~3遍，并用70 μm细胞筛网过滤，流式细胞仪Beckman Coulter检测。

1.8 数据统计

所有数据采用Excel 2010统计，使用SPSS16.0软件进行分析，两组之间采用t检验，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著，二者均具有统计学意义。采用Summit V5.2.0.7477软件对流式细胞检测数据进行分析。试验数据如非特殊标注均为x±s形式。使用GraphPad Prism 5软件进行绘图。

2 结果 2.1 死亡率统计

感染组雏鸡感染后12 h，累计死亡8只；感染后24 h，累计死亡12只；感染48 h后，累计死亡13只，最终死亡率达到16.25%。死亡个体解剖学显示脾肿大，肝有出血现象，炎症反应明显，而对照组雏鸡精神状态良好，无明显异常表现，结合以上结果绘制生存曲线(图 1)。

2.2 沙门菌感染血清炎症因子浓度变化

感染后48 h，检测各组雏鸡血清中IgA(对照组n=19，感染组n=19)和LZM(对照组n=21，感染组n=21)水平，结果显示，感染组和对照组IgA含量分别为(4.74×10⁶±2.10×10⁵)和(4.11×10⁶±1.54×10⁵) ng·mL^-1，LZM含量分别为(1 830.0±275.8)和(1 176.0±150.1) ng·mL^-1，感染后雏鸡血清中IgA和LZM水平均明显增高，且差异显著(P＜0.05)(图 2)。

2.3 盲肠扁桃体免疫反应相关基因转录差异

为了进一步确认ST感染后，雏鸡机体的炎症反应状况，使用RT-PCR定量了两组(对照组n=12，感染组n=11)盲肠扁桃体中炎症反应通路上的几个关键基因。感染组与对照组相比，NLRX1、NLRC5的转录量极显著升高(P＜0.001)，TLR4、IL-6、NF-κB的转录量均显著上调(P＜0.05)，而TNF-α的转录量在两组之间无显著性差异(图 3)。同时定量了盲肠扁桃体中IL-10的转录变化，结果显示感染后其表达量显著升高，且差异极显著(P＜0.01, 图 4)。

2.4 脾中CD4⁺T细胞和Tregs/CD4⁺T细胞比例的变化

感染后48 h，检测雏鸡脾中CD4⁺T细胞和Tregs/CD4⁺T细胞比例的变化，显示两组之间CD4⁺T细胞比例无显著性变化(P＞0.05)，但有降低的趋势(图 5)。两组雏鸡脾中调节性T细胞的比例检测结果显示：对照组CD4⁺CD25⁺TGF-β⁺/CD4⁺为(0.76±0.14)%(图 6、表 1)，感染组CD4⁺ CD25⁺ TGF-β⁺/CD4⁺为(0.29±0.04)%(图 6、表 1)。感染组雏鸡脾中CD4⁺CD25⁺/CD4⁺、CD4⁺ TGF-β⁺/ CD4⁺、CD4⁺ CD25⁺ TGF-β⁺ /CD4⁺均较对照组明显减少(P < 0.01)，差异有统计学意义(对照组n=25，感染组n=34, 表 1)。

3 讨论

沙门菌感染时，宿主通过模式识别受体(PRRs)与病原菌的病原相关分子模式(PAMPs)相互作用从而产生免疫应答。该免疫应答过程中，沙门菌可表达多个PAMPs，都能被宿主PRRs识别，尤其是Toll样受体(TLRs)和NOD样受体(NLRs)^[14]，TLRs、NLRs和细胞因子是禽类免疫应答的关键介质，具有不同程度的免疫调控和抗菌或抗病毒活性，在先天性和获得性免疫之间形成至关重要的联系^[15-16]。本研究分别选择具有代表性的Toll样受体TLR4，NOD样受体NLRX1和NLRC5，细胞因子IL-6、TNF-α和NF-κB，血清中抗原特异性IgA和广谱杀菌物质LZM等，检测其在ST感染后的变化从而反映机体的炎症反应程度。结果显示，感染组雏鸡在ST感染后48 h，盲肠扁桃体Toll样受体TLR4和NOD样受体NLRX1、NLRC5、IL-6和NF-κB表达水平均显著升高，而TNF-α表达水平升高但无显著性差异。以上结果表明，ST感染促进了盲肠扁桃体中宿主细胞对ST的识别，相关基因被明显激活从而启动宿主免疫系统对病原菌的清除，发生炎症反应。机体发生严重的炎症反应时，需要免疫调控因素维持机体的免疫稳态，调节性T细胞在此过程中发挥免疫抑制作用。调节性T细胞免疫抑制方式主要有细胞接触性抑制和细胞因子调节机制^[22-23]，IL-10主要是调节性T细胞产生的抑制性细胞因子，IL-10阻止强干扰素γ驱动的免疫反应，使病原菌有效逃避宿主免疫应答，从而发挥免疫抑制功能^[24]。沙门菌感染时，肠上皮内淋巴细胞和固有层淋巴细胞介导的T细胞免疫过程是宿主对沙门菌保护性免疫的主要环节^[25-26]，调节性T细胞产生的IL-10和TGF-β等抑制性细胞因子可抑制CD4⁺和CD8⁺效应T细胞对病原体的免疫应答，这有利于沙门菌在肠道的定植^[26]。本研究发现ST感染后，盲肠扁桃体IL-10表达量明显增高，提示沙门菌抗原刺激可能促进盲肠扁桃体中调节性T细胞IL-10的表达，发挥免疫抑制作用。

调节性T细胞比例是衡量机体免疫平衡的一个重要指标^[27]。有研究报道调节性T细胞的产生可能是由于肠道长期暴露于正常菌群提供的外源性抗原诱导所致，表现出对正常菌群的免疫耐受^[28]。沙门菌致病的一个确定因素是宿主免疫失衡，调节性T细胞在该过程调节免疫反应，确保免疫的持续性调节，调节性T细胞可抑制效应细胞的增殖，对效应CD4⁺T细胞的抑制试验研究较多，体外细胞共培养试验证明调节性T细胞对效应CD4⁺T细胞的抑制随着沙门菌感染时间呈现先增强后减弱的趋势^[29]。本研究中ST感染后48 h，两组鸡脾中CD4⁺T细胞比例虽无显著性变化，但有降低的趋势，这表明炎症反应早期调节性T细胞对效应CD4⁺T细胞增殖的抑制作用增强。调节性T细胞在机体分布广泛，有研究报道，在各个组织的比例分布是一动态过程，但在盲肠扁桃体中比例最高，机体感染沙门菌后，CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的比例在鸡盲肠扁桃体中显著增加，而脾中无明显变化^[30]。与以上报道不完全相同的是，本研究发现ST感染48 h后，雏鸡脾中CD4⁺CD25⁺/CD4⁺、CD4⁺TGF-β⁺/CD4⁺和CD4⁺CD25⁺TGF-β⁺ /CD4⁺比例均明显下降，猜测在炎症反应早期，调节性T细胞对靶细胞的免疫抑制作用增强，此时促炎因子IL-6和抗炎因子IL-10同时增加，而促炎因子占据优势，这需要进一步证明。由于机体调节性T细胞的比例与试验群体遗传背景、日龄和采样时间密切相关，且本研究未检测盲肠扁桃体等其他外围组织中TGF-β⁺调节性T细胞比例的变化，无法进一步解释脾中调节性T细胞变化的动力学机制，但本研究分析了脾TGF-β⁺调节性T细胞在炎症早期反应中的变化，也许能够为解释调节性T细胞在肠道疾病中的作用提供生理学基础。

4 结论

构建雏鸡沙门菌感染模型，首次分析了鸡新型TGF-β⁺调节性T细胞在鼠伤寒沙门菌感染时的变化。脾中TGF-β⁺调节性T细胞比例变化与早期炎症反应相关，且发挥免疫抑制功能，进一步丰富了鸡调节性T细胞的研究。