2. 新乡县农业农村局, 新乡 453007
2. Xinxiang County Bureau of Agriculture and Rural Affairs, Xinxiang 453007, China
豆状囊尾蚴病(Cysticercosis pisformis)是由寄生于犬等食肉动物肠道内的豆状带绦虫的中绦期豆状囊尾蚴(Cysticercus pisiformis, C. pisiformis)所引起的。该病为世界性流行[1-3]，但在发达国家，已得到有效的控制。该病在我国流行甚广，几乎各养兔省市都有不同程度的发生，发病率很高，感染率多在15%~40%，幼兔发病后的死亡率也很高，给养兔业造成巨大损失，导致一些中小养兔场的倒闭[4-8]。因此，深入开展对本病的病原及防治研究有重要意义。目前，国内关于此病的调查和防治研究报道很多[9-14]，而病原研究较少，特别是有关豆状囊尾蚴形态的超微结构变化研究更少。头节是豆状囊尾蚴侵袭终宿主的重要器官，明确豆状囊尾蚴头节结构的变化，对防治本病是非常必要的。作者用扫描电镜对囊泡中的豆状囊尾蚴和经培养后从囊泡中翻出的豆状囊尾蚴头节进行了详细的超微结构观察，发现处于不同状态的豆状囊尾蚴，其头节均有明显不同形态[15-17]。这些形态变化均与豆状囊尾蚴对宿主的侵害有明显的联系。在对兔豆状囊尾蚴进行超微形态的研究过程中，发现了一种未见报道的无钩豆状囊尾蚴。经对有钩和无钩豆状囊尾蚴的超微形态比较观察、PCR检测、18S DNA测序和与其他动物囊尾蚴进行进化树分析，证明兔无钩和有钩豆状囊尾蚴同为一个种属，但有型的区别。
1 材料与方法 1.1 样品来源及处理豆状囊尾蚴采自家兔屠宰场。在对屠宰家兔进行剖检时，发现感染豆状囊尾蚴病兔，挑选发育良好的囊泡，用洁净的外科剪，剪取囊泡，将其放在消过毒的培养皿中，带回实验室备用。在实验室用眼科剪将囊泡剪破，放出囊液，再用眼科镊将粘附在囊壁上的头节和原始体节小心取下，放入生理盐水中轻轻漂洗，除去粘附在头节表面的囊液。再用双蒸水洗涤2次，放入2.5%戊二醛溶液中固定。
1.2 主要仪器及试剂电镜制样真空喷镀仪、Quanta 200型扫描电镜(美国FEI公司制造)、PCR仪、Gel Doc2000紫外凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)、DYCP-31DN型琼脂糖电泳仪、Easy PureⓇ Micro Genomic DNA Kit北京全式金生物技术有限公司、回收胶试剂盒、质料DNA提取试剂盒(美国Axygen公司)、DL2000 DNA Marker和2×Eco Taq PCR SuperMix Peasy-Tlvecto(大连宝生物工程有限公司)。
1.3 无钩和有钩豆状囊尾蚴的辨别对用于PCR扩增和18S DNA序列检测的豆状囊尾蚴，先用生理盐水充分漂洗两次，然后再用双蒸水漂洗两次，将豆状囊尾蚴放在含有少量双蒸水的培养皿中，在解剖显微镜下仔细观察豆状囊尾蚴头节上的吸盘，无小钩的则为无钩豆状囊尾蚴，有小钩者即是有钩豆状囊尾蚴。对用于超微结构观察的经2.5%戊二醛溶液固定的头节，用双蒸水充分漂洗除去固定液，然后在解剖显微镜下区分有钩和无钩豆状囊尾蚴。
1.4 扫描电镜样品的制作将挑选出来的有钩和无钩豆状囊尾蚴，用吸水纸吸去其体表的水分，并进行梯度脱水，再按观察的需要用导电胶将要检查的部位在解剖显微镜下固定在样品检测台上，在真空喷镀仪中喷镀导电金膜，用Quanta 200型扫描电镜观察并记录。
1.5 引物设计与合成根据GenBank中收录的兔豆状囊尾蚴18S DNA全基因序列(JQ609339.1)、18S1基因序列(AJ555167.1)和18S2基因序列(AJ555168.1)分别进行比较，利用DNAStar(version 5.0)软件MegAlign程序进行同源性分析，在基因的高度保守区域应用Primer 6.0引物设计软件，分别设计出两对引物，即18S-P1和18S-P2。18S-P1的上游引物：5′-CCGCGGTAACTCCAGCTCCAATAG-3′，下游引物：5′-TCCGAAAACCAACGAAATAGAACC-3′，目的片段大小为750 bp；18S-P2的上游引物：5′-TTTGGGTTCCGGGGGAAGTAT-3′，下游引物：5′-AACCCTTTCGGGCCAGAAGGT- 3′，目的片段大小为666 bp。两对引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.6 无钩和有钩豆状囊尾蚴的PCR检测参照DNA提取试剂盒说明书提取有钩和无钩豆状囊尾蚴DNA，并以此为模板对目的基因进行扩增。PCR反应体系：10×buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，Taq酶0.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA 3 μL，双蒸水15 μL，共25 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.7 序列检测样品的制备将豆状囊尾蚴PCR扩增条带从琼脂糖凝胶上切下，用胶回收试剂盒回收PCR产物。将回收的阳性目的基因，连接到pMD-18T载体。连接体系：pMD18-T-simple载体0.5 μL，胶回收的PCR产物4.5 μL，SolutionⅠ5 μL。将连接载体转化到E. coli TOP10感受态细胞，先用液态LB培养基复壮大肠杆菌，再用含Amp的LB固体培养基培养，从中挑取可疑单菌落，接种于4 mL含Amp的LB液体培养基中再培养12 h, 经PCR鉴定后，用质粒提取试剂盒从菌液中提取质粒，再做质粒PCR检测，确定目的基因阳性后，将质粒送去测序。
1.8 兔豆状囊尾蚴与其他动物囊尾蚴系统发育比较将测定的兔无钩和有钩豆状囊尾蚴的核苷酸序列，根据上、下游引物选取目的片段，用DNAStar软件进行编辑和同源性分析，找出其差异。再将兔无钩和有钩豆状囊尾蚴的核苷酸序列与猪、牛和羊等动物的囊尾蚴的核苷酸序列(选自GenBank，具体见结果部分)进行比对，再用Mega 5.0软件以邻接法(neighbor joining method, NJ)构建系统进化树，从中分析兔无钩和有钩豆状囊尾蚴与其他动物囊尾蚴的进化联系。
2 结果 2.1 无钩和有钩豆状囊尾蚴头节的超微结构比较豆状囊尾蚴大部分寄生于胃的大网膜和肝，少量寄生于直肠和膀胱外膜。选取发育良好的囊泡，将豆状囊尾蚴从囊泡内取出，虫体多呈相对静止状态。从豆状囊尾蚴头节的侧面观察，顶突位于头节的前部，吸盘位于顶突的后部。无钩豆状囊尾蚴的顶突较厚，如同数层圆饼叠放在一起，圆饼的周边有齿轮状花纹。顶突的正面较平，中部稍显凹陷，周边有放射状花纹。顶突的中央有一个较大的表面并不光滑的圆形结节，其直径约20 μm，结节的表面有深浅不一的分裂痕，将结节分成瓣状结构。顶突的周围有数层齿轮状花纹，形成重合式的齿轮状结构。四个吸盘位于顶突的后方，均处于轻度的收缩状态，吸盘口较小。吸盘明显突出于体表，在头节的周围形成四个结节样构造。顶突和吸盘周围的皮层较粗糙，有环形或纵形波纹(图 1A)。有钩豆状囊尾蚴顶突的前端比较钝，通过隆突的皮肌柱，将形似鸡爪样的小钩连接起来。顶突的小钩呈单层排列，每个小钩具有二杠鹿角样的分叉，形成长短不同的一对小钩，分叉处如同人手的虎口。长钩前端尖锐，如同鸡爪，长120~150 μm，短钩钝，如同人的拇指，长50~70 μm。小钩表面光滑，富有光泽，具有坚硬的外观。吸盘位于小钩之后，围绕顶突呈等距离分布在头节四周。吸盘的开口呈圆洞穴状，洞口周边较厚，表皮粗糙，略隆突于体表，洞壁较光滑，洞的深浅与吸盘所处的状态有关，收缩时可深，松弛时则浅。在吸盘之间见皮肌呈环形收缩而形成的波纹(图 1B)。
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A.无钩豆状囊尾蚴的头节；B.有钩豆状囊尾蚴的头节；R.顶突；S.吸盘 A. Scolex of no-hook C. pisiformis; B. Scolex of hook C. pisiformis; R. Rostellum; S. Sucking disc 图 1 无钩与有钩豆状囊尾蚴头节的超微结构比较 Fig. 1 Ultrastructural comparison with the scolex of no-hook and hook C. pisiformis |
使用设计的18S-P1和18S-P2引物对无钩和有钩豆状囊尾蚴的目的基因进行PCR检测，于750和666 bp附近出现特异性阳性条带。该条带与设计引物时预测的目的基因片段大小相同(图 2A)。通过对阳性条带进行胶回收，将目的基因片段与载体连接，转化到感受细胞中进行培养，12 h后对菌液进行PCR扩增，检测出目的基因(图 2B)。然后从菌液中提取质粒，通过PCR扩增，检测到相同的目的基因(图 2C)。
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A.18S-P1和18S-P2对无钩和有钩豆状囊尾蚴目的基因的PCR扩增鉴定；B.转化感受态细胞培养后菌液目的基因的PCR扩增鉴定；C.质粒目的基因扩增的PCR鉴定。M. DNA DL2000相对分子质量标准；1. 18S-P1扩增的无钩豆状囊尾蚴DNA PCR产物；2. 18S-P1扩增的有钩豆状囊尾蚴DNA PCR产物；3. 18S-P1引物的阴性对照；4. 18S-P2扩增的无钩豆状囊尾蚴DNA PCR产物；5. 18S-P2扩增的有钩豆状囊尾蚴DNA PCR产物；6. 18S-P2引物的阴性对照 A. Identify target gene of no-hook and hook C. pisiformis through 18S-P1 and 18S-P2 PCR; B. Identify target gene of bacteria medium cultured competent cell by PCR; C. Identify target gene of plasmid by PCR. M. DNA marker DL2000; 1. Product of no-hook C. pisiformis amplified by 18S-P1 PCR; 2. Product of hook C. pisiformis amplified by 18S-P1 PCR; 3. Negative control by 18S-P1 PCR; 4. Product of no-hook C. pisiformis amplified by 18S-P2 PCR; 5. Product of hook C. pisiformis amplified by 18S-P2 PCR; 6. Negative control by 18S-P2 PCR 图 2 无钩和有钩豆状囊尾蚴的18S DNA的PCR鉴定 Fig. 2 Identification of no-hook and hook C. pisiformis by 18S DNA PCR amplification |
通过对无钩和有钩豆状囊尾蚴18S DNA碱基序列的同源性分析，发现无钩豆状囊尾蚴的碱基序列与有钩豆状囊尾蚴的序列有明显的区别，18S-P1引物扩增的750碱基序列的区别比较明显，碱基配对的变化范围较大，差别主要发生于220—230、358—397和410—423碱基配对节段(图 3A), 而1—210和430—750节段的碱基配对变化很小，两者的相似性较高。
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图 3 18S-P1(A)和18S-P2(B)扩增的无钩和有钩豆状囊尾蚴基因序列比对 Fig. 3 Gene sequence alignment of no-hook and hook C. pisiformis amplified by 18S-P1(A) & 18S-P2 (B)PCR |
18S-P2引物扩增的666 bp序列的差别比较小，碱基配对的变化范围较小，主要差别仅出现于195—210、225—243和359—371碱基配对节段(图 3B)，而1—190、270—350和380—666节段的碱基配对变化很小，两者的相似性很高。上述结果说明无钩和有钩豆状囊尾蚴虽然同属豆状囊尾蚴，但18S DNA序列有一定的差别。
2.4 豆状囊尾蚴与其他动物囊尾蚴进化树比较通过对几种动物囊尾蚴18S DNA进化树的分析，发现兔的无钩和有钩豆状囊尾蚴18S DNA扩增长度为750 bp序列结果，显示两者有非常亲密的近缘关系(图 4A)。而18S DNA合成长度为666 bp序列进化树的结果，显示无钩豆状囊尾蚴与牛囊尾蚴具有亲缘性，而有钩豆状囊尾蚴则和猪囊尾蚴有亲缘性(图 4B)。
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图 4 18S-P1(A)和18S-P2(B)扩增的无钩和有钩豆状囊尾蚴与其他动物囊尾蚴的基因序列进化树比较 Fig. 4 Contrast of gene sequence evolution tree among no-hook C. pisiformis, hook C. pisiformis and other animals' cysticercus amplified by 18S-P1(A) and 18S-P2(B) |
据教科书记载[18-20]，兔豆状囊尾蚴为有钩囊尾蚴，顶突上有36~48个小钩。经文献检索[17. 21]，除作者在病兔体内发现无钩豆状囊尾蚴外，还未见其他人报道。本研究通过超微结构观察，证明无钩和有钩豆状囊尾蚴的区别主要在顶突，而吸盘的结构基本是相同的。无钩豆状囊尾蚴的顶突较大，前端扁平，像是由数层叠放的饼状物和一个结节组成。顶突的正面有围绕结节呈放射状排列的收缩纹，顶突的侧面有锯齿状花纹。无钩豆状囊尾蚴顶突的这些特殊的结构，可能与其皮层下有多种肌纤维有关。据孙晓林等报道[22]，豆状带绦虫的顶突最外层有呈放射状排列的肌纤维，内层是呈环形排列的肌纤维层。因此，放射状肌纤维的轻微收缩可形成放射状花纹，再加上环形肌纤维的收缩可出现锯齿样花纹。这说明无钩豆状囊尾蚴的顶突在运动时具有主动收缩的潜质，能够通过特异性运动来侵袭宿主的组织。有钩豆状囊尾蚴的顶突主要由皮肌柱、小钩和顶突基部组成。在相对静止状态时，有钩豆状囊尾蚴的顶突呈伞状，前端比较钝，通过顶突的基部和皮肌柱将具有分叉的鹿角样小钩连接起来，小钩呈单层(假复层状)围绕顶突排列。在临床上用头节制作压片时，常看到有两排小钩。因此，现在的教科书[18]将囊尾蚴顶突的小钩描述为两排，其实是一种误解。压片时看到顶突上有两排小钩，实际上是超微结构所见的鹿角样小钩从分叉处压断所形成[12]。从发生学的角度考虑，顶突的小钩如同动物的犄角和蹄壳一样，可能是皮肌柱的衍生物。小钩上含有钙质，HE染色呈蓝色。小钩是豆状囊尾蚴侵袭宿主的利器，有利于头节侵入组织。
众所周知，寄生于人肠道的有钩绦虫，可引起猪囊尾蚴病，无钩绦虫则引起牛囊尾蚴病。也就是说有钩囊尾蚴病和无钩囊尾蚴病可以发生在不同的动物，而本研究发现的无钩和有钩豆状囊尾蚴病却发生于同一种动物。猪囊尾蚴为有钩囊尾蚴，小钩长在顶突上。牛囊尾蚴是无钩囊尾蚴，其头节上只有吸盘而没有顶突。与之相反，兔的无钩豆状囊尾蚴不仅有吸盘，而且有顶突，但顶突上没有小钩。这是否可以认为无钩豆状囊尾蚴是有钩豆状囊尾蚴的一个发育阶段，或是一种畸变？通过更深入的研究否认了这一推测。首先，本研究在采集病料时从不同的寄生部位(胃大网膜、肠系膜、直肠外膜和膀胱外膜)均选择发育良好的豆状囊尾蚴，即囊膜半透明，囊液丰盈，头节明显呈乳白色。镜检时发现有钩豆状囊尾蚴多寄生于大网膜，而从膀胱或直肠外膜采集的囊泡检出了无钩豆状囊尾蚴。这种寄生部位的不同可能与六钩蚴随血液或经肝进入腹腔后的压力变化有关，即当六钩蚴进入腹腔后，腹腔的压力较大，有钩囊尾蚴可利用其顶突的众多小钩，吸着于胃大网膜或肠系膜上，并在此处生长发育；而无钩囊尾蚴吸附力较小，只能从高腹压排挤到低腹压的盆腔，在此附着于膀胱和直肠外膜寄生。其次，先前通过对无钩和有钩豆状囊尾蚴的动态变化超微结构观察[15-17]，发现两种豆状囊尾蚴顶突的变化具有不同的运动特点，呈现出两种不同器官运动。
4 结论通过扫描电镜观察，发现无钩和有钩豆状囊尾蚴顶突的结构是完全不同的。又通过对兔豆状囊尾蚴18S DNA检测和序列分析，发现无钩和有钩豆状囊尾蚴的PCR结果基本一致，没有明显的区别，但经DNA序列分析后，发现引物18S-P1扩增长度为750 bp序列和18S-P2扩增长度为666 bp序列均有明显的差别。说明无钩和有钩豆状囊尾蚴是不同的。再将无钩和有钩豆状囊尾蚴的基因序列与其他几种动物囊尾蚴的序列进行比对和进化分析，虽然发现无钩和有钩豆状囊尾蚴有紧密的亲缘关系，但同时发现无钩豆状囊尾蚴与牛的无钩囊尾蚴有一定的亲缘关系，而有钩豆状囊尾蚴与猪的有钩豆状囊尾蚴则具有亲缘性。据此认为，无钩豆状囊尾蚴是一种新发现的豆状囊尾蚴。
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