, WANG Yi, ZHANG Shuang, LI Guoli, ZENG Lei, GUO Yukun, ZHAI Yunyun, YU Pengwei, WANG Qi, WANG Chunfeng, DU Yongkun
, WAN Bo
天然免疫系统的防御功能主要是通过胚系编码的模式识别受体(pattern recognition recepters, PRRs) [1]识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)或损伤相关分子模式(damage-associated molecular pattern, DAMP)的方式来实现[2-5]。天然免疫系统被激活后，经信号级联反应诱导白细胞介素(interleukin，IL)、干扰素(interferon, IFN)、促炎性趋化因子、抗菌肽等细胞因子的产生[6-7]，进而发挥抵抗病原体入侵的功能。干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes, STING)是天然免疫系统信号传导过程中重要的衔接蛋白[8]。细胞内第二信使环鸟苷-腺苷酸(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate, cGAMP)是STING的内源性激动剂[9-10]，STING激活TBK1/IRF3信号通路，最终诱导Ⅰ型IFN的表达，抵抗病原的入侵[11-13]。
伪狂犬病(pseudorabies, PR)是由伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)引起的烈性传染病，多种动物易感，病症为发热、奇痒(啮齿类动物)并伴有脑脊髓炎[14-15]。猪是PRV的天然宿主和主要传染源。该病主要危害仔猪以及妊娠母猪，仔猪感染该病多为神经症状，出现抽搐、共济失调、呼吸困难等，死亡率非常高；妊娠母猪感染该病后繁殖能力几乎丧失，主要病理表现为流产、产死胎或木乃伊胎，给养猪业带来了极为严重的经济损失[16]。
有报道称，PRV感染后会造成宿主的持续感染，并且能在宿主体内长期潜伏。然而，目前关于STING在PRV宿主逃逸机制中研究较少。本试验利用CRISPR/Cas9技术构建猪STING基因敲除细胞系，利用PRV-GFP和PRV-QXX毒株检测敲除STING基因对PRV复制的影响，以期为PRV免疫逃逸机制研究奠定基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)、人胚胎肾细胞(HEK293T/17)、非洲绿猴肾细胞(Vero)、大肠杆菌Top10感受态及PRV-GFP和PRV-QXX(野毒株)由本实验室保存；LentiCRISPR v2载体购自Addgene公司；两种辅助包装原件载体质粒pMD2.G和pSPAX2购自Sigma公司；PEI、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；质粒中提试剂盒购自QIAGEN公司；Q5Ⓡ Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase、限制性内切酶Bsmb Ⅰ、T4 DNA连接酶、T7酶购自NEB公司；细胞/细菌/酵母基因组DNA提取试剂盒购自上海莱枫生物科技有限公司。PRV猪源gE单克隆抗体购自普莱柯生物工程股份有限公司；β-actin购自武汉三鹰生物技术有限公司；CCK-8细胞活力检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.2 试验方法 1.2.1 引物设计与合成根据美国国家生物技术中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)网站所公布的猪STING基因序列(GenBank: ACJ70708.1)，在2号外显子区域找到3个合适的靶位点设计sgRNA；其设计规则为以G开头连续20个碱基后为NGG的序列，符合这一规则的序列均可作为Cas9的引导序列；针对三个位点分别设计sgRNA引物，上游引物5′端添加CACC，下游引物5′端添加AAAC，引物序列见表 1。
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表 1 sgRNA引物序列 Table 1 Primers sequence for sgRNA |
根据STING基因序列(GenBank: ACJ70708.1)利用Primer 6.0设计STING序列扩增引物，用于T7核酸内切酶1 (T7E1)检测；根据NCBI网站提供的mRNA序列，应用NCBI的Primer-Blast网页设计Q-PCR引物，目的基因名称及引物序列见表 2。以上引物均由上海生工生物有限公司合成。
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表 2 PCR和RT-qPCR引物 Table 2 Primers used for PCR and RT-qPCR analysis |
将三对sgRNA上、下游引物分别进行退火杂交，退火条件95 ℃，5 min，关闭PCR仪，使其自然冷却至4 ℃。同时将LentiCRISPR v2质粒用BsmbⅠ 37 ℃酶切1 h，用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收线性片段。将退火杂交的引物与酶切后的载体片段，用T4 DNA连接酶，在4 ℃条件下连接过夜。次日，将连接产物转化至E. coli Top10感受态细胞，挑取单菌落送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。测序正确菌样扩大培养后用QIAGEN质粒中提试剂盒提取质粒，分别命名为STING-sgRNA1、STING-sgRNA2、STING-sgRNA3。
1.2.3 STING基因敲除细胞系构建将STING-sgRNA重组质粒和pMD2.G、psPAX2两种包装质粒共转染至HEK293T/17细胞，48 h后收集包装病毒上清液。3 000 r·min-1离心10 min后吸取1 mL病毒液加入提前种好3D4/21细胞的6孔板中。48 h后用含5 μg·mL-1 Puromycin的1640(含10% FBS)筛选细胞，隔天更换筛选培养基，连续筛选7 d左右。观察3D4/21空白对照组细胞全部死亡，其他三组细胞换用3 μg·mL-1 Puromycin维持培养基继续培养。将筛选获得的细胞接种于60 mm培养皿中，当细胞生长至80%融合度时，取1/3细胞进行基因组提取用于T7E1检测编辑效率，剩余细胞继续传代培养用于单克隆细胞系筛选。T7E1鉴定编辑效率最高的细胞系用有限稀释法筛选单克隆细胞系，单克隆细胞系扩大培养后，提取细胞基因组，用表 2中的PCR-STING引物进行PCR扩增，扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，挑取有效编辑单克隆细胞系用于后续功能评价。
1.2.4 T7核酸酶检测靶基因敲除效率取200 ng基因组为模板PCR扩增，琼脂糖凝胶回收598 bp的目的条带并测定PCR产物浓度。取200 ng PCR产物进行退火杂交后T7E1酶切。体系如下：10 × NEB Buffer2 1.0 μL，模板200 ng，ddH2O补充至10 μL。PCR仪中98 ℃ 5 min，自然冷却至4 ℃后加0.4 μL T7核酸内切酶，37 ℃酶切1 h，用PAGE胶电泳检测T7酶切结果。
1.2.5 细胞计数试剂盒(CCK-8)检测基因敲除细胞增殖以每孔1×104个细胞在96孔板中铺种3D4/21和3D4/21-STING—/—细胞，各6孔。按照0、6、12、24、36、48 h不同时间点，参照CCK-8试剂盒在不同时间点向指定培养孔中加入10 μL CCK-8溶液37 ℃孵育2 h，然后用酶标仪检测在450 nm处的吸光度。试验重复三次。
1.2.6 荧光显微镜检测以每孔2×104个细胞在24孔板中铺种3D4/21和3D4/21-STING-/-细胞，各6孔。细胞融合度40%左右，按照PRV-GFP MOI=0.001感染细胞，在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中吸附1 h，吸附结束后，用PBS清洗一遍，换成维持培养基进行培养。分别在0、6、12、24、36、48 h不同时间点用荧光倒置显微镜拍照记录并利用流式细胞仪检测GFP表达细胞阳性率。
1.2.7 流式细胞仪检测以每孔2×104个细胞在24孔板中铺种3D4/21和3D4/21-STING-/-细胞，各6孔。细胞融合度40%左右，按照PRV-GFP MOI=0.001感染细胞，在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中吸附1 h，吸附结束后，用PBS清洗一遍，换成维持培养基进行培养。分别在0、6、12、24、36、48 h不同时间点用胰蛋白酶消化后用完全培养基终止消化，使贴壁细胞变为悬浮的单个细胞，利用流式细胞仪上机检测GFP表达细胞阳性率。
1.2.8 实时荧光定量PCR检测以每孔5×105个细胞在35 mm培养皿中接种3D4/21和3D4/21-STING-/-细胞，各6个处理。感染PRV-QXX MOI=1后分时间点收取RNA。Trizol裂解法收取RNA并反转录成cDNA，以cDNA为模板，用TB GreenTM Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus)进行RT-qPCR检测。以β-actin mRNA表达水平为内参值，计算PRV-gB、PRV-TK、IFN-β、IL-1β和ISG15 mRNA水平，试验重复三次。
1.2.9 Western blot检测PRV-gE蛋白的表达以每孔1×106个细胞在60 mm培养皿中接种3D4/21和3D4/21-STING-/-细胞，各6个处理。感染PRV-QXX MOI=1后分时间点收取蛋白，90 μL RIPA (含protease cocktail)裂解后BCA定量检测样品蛋白含量。取30 μg蛋白样品进行SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)后转膜，5%脱脂奶室温封闭1 h后，加入PRV-gE单克隆抗体(1:1 000稀释) 4 ℃摇床孵育过夜，1×TBST洗膜3次后，室温摇床孵育辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG (1:1 000稀释) 1 h，1×TBST洗膜3次后进行ECL。以β-actin作为内参。
1.2.10 PRV子代病毒滴度测定(TCID50)以每孔2×105个细胞在35 mm dish中铺种3D4/21和3D4/21-STING-/-细胞，各6孔。培养至细胞融合度40%左右，进行病毒处理。以PRV-QXX MOI=1感染细胞，37 ℃、5% CO2细胞培养箱中吸附1 h，吸附结束后，用PBS清洗一遍，换成维持培养基进行培养。按照0、6、12、24、36、48 h不同时间点收取样品，将病毒悬液反复冻融三次，离心取上清。以每孔1×104铺种Vero于96孔板，以10倍递次稀释病毒液，分别加入相对应的孔板中，37 ℃、5% CO2细胞培养箱中吸附1 h，吸附结束后，用PBS清洗一遍，换成维持培养基进行培养。5~6 d后，在显微镜下对病变孔进行统计，然后利用Reed-Muench法计算PRV子代病毒滴度。
1.2.11 统计学分析试验重复三次，应用GraphPad Prism软件中T-test检验方法对数据结果进行统计学分析。
2 结果 2.1 STING-sgRNA重组质粒的构建及鉴定用限制性内切酶BsmbⅠ对LentiCRISPR v2酶切后电泳检测，分离出大小为13 000 bp和1 873 bp左右的目的条带(图 1A)，证明载体酶切成功。为确认sgRNA引物是否连接到载体中及其是否发生突变，对重组质粒进行测序，测序数据结果(图 1B~D)与设计序列信息一致，表明该克隆为正确的STING-sgRNA重组质粒，将其中提后用于后续试验。
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A. LentiCRISPR v2载体Bsmb Ⅰ酶切鉴定结果(M. DL15000 DNA相对分子质量标准；1、2. LentiCRISPR v2单酶切产物)；B. STING-sgRNA1测序结果；C. STING-sgRNA2测序结果；D. STING-sgRNA3测序结果(红框为sgRNA序列) A. LentiCRISPR v2 vector Bsmb Ⅰ digestion results (M. DL15000 DNA marker; 1, 2. LentiCRISPR v2 single-cut products); B. STING-sgRNA1 sequencing results; C. STING-sgRNA2 sequencing results; D. STING-sgRNA3 sequencing results (red boxes for sgRNA sequences) 图 1 Cas9/sgRNA载体的鉴定 Fig. 1 Identification of Cas9/sgRNA vector |
T7酶切检测显示STING基因2号外显子区域3个sgRNA位点均切出了目的条带，表明该靶点存在基因编辑(图 2A、B)。用Image J软件分析后得出的sgRNA3编辑效率最高，并将该细胞系进行单克隆化筛选，经测序比对得到靶区碱基序列混乱的34号单克隆细胞(图 2C)。以上结果表明，成功构建稳定敲除STING基因的3D4/21细胞，并将该单克隆细胞命名为3D4/21-STING-/-。
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A.sgRNA打靶区；B.T7酶切鉴定STING-sgRNA编辑效率；C.敲除STING基因的单克隆细胞系测序结果 A.Target region of sgRNA; B.Identification of STING-sgRNA editing efficiency by T7 digestion; C.Sequencing analysis of STING knockout monoclonal cell lines 图 2 敲除STING基因的3D4/21细胞系鉴定 Fig. 2 Identification of 3D4/21 cell line knockout of STING gene |
为验证敲除STING基因后，是否影响细胞活性，我们检测了细胞活性，结果表明，敲除STING基因后对细胞活性无影响(图 3)。
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图 3 敲除STING基因对细胞活性无影响 Fig. 3 Knockdown of STING gene has no effect on cell viability |
按MOI=0.001 PRV-GFP感染3D4/21和3D4/21-STING-/-细胞，通过荧光倒置显微镜观察各组细胞的荧光情况，同时利用流式细胞仪检测荧光阳性率。结果显示，STING基因敲除显著促进PRV-GFP复制(图 4)。
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A. PRV-GFP荧光显微镜观察结果；B. PRV-GFP流式检测结果；C.流式结果统计分析(***. P < 0.001) A. Demonstration of PRV-GFP in cells by fluorescence microscopy; B. Demonstration of PRV-GFP in cells by fluorescence microscopy; C. Statistical analysis of streaming results(***. P < 0.001) 图 4 敲除STING基因促进PRV-GFP复制 Fig. 4 STING gene knockout can induce the replication of PRV-GFP |
按MOI=1 PRV-QXX感染3D4/21和3D4/21-STING-/-细胞，RT-qPCR检测PRV-gB、PRV-TK mRNA表达水平。如图 5所示，随着PRV复制，PRV-gB和PRV-TK mRNA表达量递增。敲除STING基因后PRV-gB和PRV-TK mRNA水平从感染后6 h就显著高于对照组。结果表明，敲除STING基因促进PRV基因转录。
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A. RT-qPCR检测感染PRV-QXX不同时间PRV-gB基因拷贝数；B. RT-qPCR检测感染PRV-QXX不同时间PRV-TK基因拷贝数；***. P < 0.001 A. PRV-gB gene copies were quantified by RT-qPCR; B.PRV-TK gene copies were quantified by RT-qPCR; ***. P < 0.001 图 5 敲除STING基因促进PRV基因转录 Fig. 5 STING gene knockout can induce the transcription of PRV gene |
RT-qPCR检测3D4/21和3D4/21-STING-/-细胞感染PRV后细胞内白细胞介素、干扰素及干扰素刺激基因转录水平。如图 6所示，3D4/21细胞内IL-1β、IFN-β和ISG15表达量随着PRV感染时间而上调，48 h达到最高值。然而3D4/21-STING-/-细胞内IL-1β、IFN-β和ISG15表达量并不随着感染时间上调，与3D4/21细胞相比组间差异显著。结果表明，敲除STING抑制了产生IL-1β和IFN-β信号通路，抑制了干扰素刺激基因的表达进而促进病毒的复制。
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A. RT-qPCR检测感染PRV-QXX不同时间IL-1β基因拷贝数；B. RT-qPCR检测感染PRV-QXX不同时间IFN-β基因拷贝数；C. RT-qPCR检测感染PRV-QXX不同时间ISG15基因拷贝数；ns. P>0.05；*. P < 0.05；**. P < 0.01；***. P < 0.001 A. IL-1β copies were quantified by RT-qPCR; B. IFN-β copies were quantified by RT-qPCR; C. ISG15 copies were quantified by RT-qPCR; ns. P>0.05; *. P < 0.05; **. P < 0.01; ***. P < 0.001 图 6 敲除STING基因抑制PRV诱导的IL-1β、IFN-β及ISG15基因的转录 Fig. 6 STING gene knockout restricts the transcription of PRV-induced IL-1β, IFN-β and ISG15 genes |
WB检测结果(图 7)显示3D4/21细胞感染PRV-QXX 24 h后可以检测到PRV-gE蛋白，48 h后PRV-gE表达量最高。虽然3D4/21-STING-/-细胞也是在24 hpi可以检测到PRV-gE蛋白，但结果显示3D4/21-STING-/-细胞检测到的PRV-gE蛋白明显高于3D4/21细胞。结果表明，敲除STING基因促进PRV-gE蛋白表达。
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图 7 敲除STING基因促进PRV-gE蛋白表达 Fig. 7 Knockout STING gene promotes expression of PRV-gE protein |
病毒滴度测定结果显示，随着感染时间增加3D4/21-STING-/-细胞的病毒滴度高于3D4/21细胞的病毒滴度(图 8)。结果表明，STING基因敲除促进PRV-QXX子代病毒的增殖。
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ns. P>0.05;**. P < 0.01 图 8 敲除STING基因促进PRV-QXX子代病毒的增殖 Fig. 8 Knockout of STING gene promotes proliferation of PRV-QXX virus |
本试验利用近年来发展迅速的基因定点修饰技术CRISPR/Cas9系统敲除3D4/21细胞STING基因。该技术作为第三代基因编辑技术具有设计简单、操作方便、效率高、成本低并且可同时进行多点编辑等优势[25]，该技术已经迅速发展为实验室的一种常规试验手段。由于近年发现的新型DNA感受器cGAS是STING已知的上游信号感受器，所以科学家们对STING的研究也越来越多[18]。研究表明，STING介导异常的细胞质DNA触发的免疫信号传导，在天然免疫以及某些自身免疫性疾病的发病中起着关键作用。一方面，STING作为模式识别受体可以直接识别环二核苷酸(例如c-di-GMP和c-di-AMP)诱导IFNs和促炎因子的表达[19]；另一方面，作为关键的衔接蛋白，STING负责传递上游感受器发出的信号，调节免疫应答的发生[20]。STING被激活后经磷酸化、泛素化和亚细胞转位，招募并磷酸化下游效应分子TBK1和IRF3，最终诱导Ⅰ型IFN的表达[21-22]。
STING作为天然免疫中重要的调节因子，能够诱导TBK1以及IRF3的磷酸化激活并调控Ⅰ型干扰素和干扰素刺激基因的表达，STING对于病原入侵所引起的天然免疫应答非常关键[23-24]。目前研究称，多种病毒可利用自身蛋白与宿主免疫系统相关蛋白相互作用，进而实现自身免疫逃逸。有研究报道，HSV-1病毒皮层蛋白VP22和UL46分别通过抑制cGAS酶活性和作用于STING及TBK1，来阻断干扰素信号通路的传递[27]；FMDV 2B蛋白通过阻断TBK1和IRF3的磷酸化抑制宿主细胞Ⅰ型IFN产生[28-29]；PEDV N蛋白以及HCV非结构蛋白NS3通过与TBK1相互作用而抑制IRF3活化及Ⅰ型干扰素的生成[30]；然而，目前关于PRV免疫逃逸机制研究较少，PRV蛋白是否与STING相互作用研究还未见报道。并且，STING不仅在天然免疫反应中发挥功能，而且还参与自身免疫病及肿瘤的发生，所以对STING深入了解，不仅为PRV免疫逃逸机制研究奠定基础，还有助于开发针对传染性、自身免疫性和癌性疾病的新型免疫治疗策略。
4 结论首先利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了STING基因稳定敲除3D4/21细胞系，CCK-8检测细胞活力与3D4/21细胞无显著差异。其次，通过流式检测显示本试验成功构建的STING基因稳定敲除细胞系可以促进PRV-GFP的复制。另外，进一步研究显示该细胞系感染PRV-QXX时抑制IL-1β、IFN-β及ISG15的转录，促进病毒基因转录、蛋白表达以及子代病毒的感染力。以上研究结果表明STING在宿主细胞抵抗PRV感染中发挥重要功能。本试验所构建的稳定敲除STING基因细胞系可为PRV免疫逃逸机制研究提供可用工具。
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