2. 中国科学院地理科学与资源研究所 生态系统网络观测与模拟重点实验室, 北京 100101
2. Key Laboratory of Ecosystem Network Observation and Modeling, Institute of Geographic Sciences and Natural Resources Research, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China
瘤胃微生物包括厌氧性细菌(含古细菌)、真菌、原虫和噬菌体等。1 mL内容物中约含109~1010个细菌，105~106个原虫，103~104个真菌，约占瘤胃液的3.6%。瘤胃液细菌与纤毛虫各占约50%[1]。反刍动物中，因饲草蛋白质含量较低，氨基酸的获取对动物显得十分重要。部分蛋白质降解为氨基酸，氨基酸再降解为挥发性脂肪酸、氨态氮和CO2，最后也被瘤胃微生物合成利用，如瘤胃中嗜淀粉瘤胃杆菌(R. amylophilus)与蛋白质及氨基酸分解密切相关[2]，是外源蛋白的一种同化菌；不可溶性蛋白在肠道中降解为氨基酸，直接被动物吸收利用[3]。反刍动物机体组织代谢所需要的各种含氮物质在很大程度上依赖于瘤胃中降解的养分和瘤胃进入小肠中的微生物蛋白(MCP)。研究表明，随着精料比例的增加，瘤胃中蛋白和高精日粮利用菌，如变形菌门、厚壁菌门、疣微菌门的数量呈增加趋势，而拟杆菌门呈降低趋势[4]。反刍动物小肠中的氨基酸(AA)主要来源于瘤胃微生物[5]，大约占到AA总量的40%~80%[6]。因此，对反刍动物MCP相关的微生物研究显得十分重要。
纤维素在瘤胃中的有效降解，主要归功于反刍动物瘤胃内的纤维降解菌，瘤胃中每天消化的碳水化合物占总碳水化合物的70%~90%，发酵产物中的挥发性脂肪酸提供了70%~80%的反刍动物所需能量[7]。同时，Fernando等[8]研究发现，当高纤维日粮转化为高精日粮时，主要的纤维素分解菌如黄色瘤胃球菌、琥珀酸丝状杆菌和丁酸弧杆菌等数量有所下降，而牛链球菌、乳酸杆菌、嗜淀粉瘤胃杆菌、反刍月形单胞菌和埃氏巨型球菌的数目增加。同时，非结构性碳水化合物在一定程度上也影响瘤胃细菌的消长。适当补饲时，可增加微生物蛋白质产量，增加瘤胃纤维降解菌的数量[9]。但当非纤维性碳水化合物(NFC)含量高时，纤维降解菌的数量相对减少乃至缺乏[10]。
目前，可以进行体外培养的瘤胃细菌仅为10%~20%[11]，复胃家畜瘤胃中庞大的微生物群落相互依存，又相互竞争，是一个互作的过程[12]；研究表明，在蛋白质和结构性碳水化合物保持不变，而不同刈割生长期的秸秆对牛瘤胃微生物没有显著影响[13]，说明纤维素和蛋白的变化在影响着瘤胃微生物种类的消长。采用高通量测序具有准确、高效、信息量丰富等优点，是目前常用和可信的方法[14-15]。试验通过西藏常规养殖中的两种模式，即放牧与舍饲中饲粮不同蛋白质、NFC和纤维素含量对彭波半细毛羊瘤胃微环境的影响，阐明瘤胃中菌群结构的变化，更加清晰地了解瘤胃微生物对养分的依赖程度和消长原因，为探究增加瘤胃主要纤维素分解菌，抑制蛋白利用菌的人工干预方法，也为西藏传统放牧补饲及规模化养殖提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验设计、饲养管理及养分分析试验用彭波半细毛羊均来自于西藏自治区拉萨市林周县白朗村养羊合作社。白朗村(N29°50′~ E91°5′)是西藏河谷地带典型的半农半牧村，天然草地占该村总面积的80%以上。白朗村养羊合作社共饲养600余只羊，属科研院所与村合作示范基地。舍饲组和放牧组各选用2岁左右的母羊10只，平均体重为(23.77±2.34)kg，每组2个重复，每个重复5只羊。
放牧组采用西藏常规全天放牧方式，每天晚上羊群混喂约50 g·只-1左右的玉米粉和适量的盐。主要天然可饲用牧草优势种有：白草(Pennisetum centrasiaticum)、披针叶苔草(Carex lanceolata Boott)、矮草沙蚕(Tripogon humilis H. L. Yang)、高山嵩草(Kobresia pygmaea C. B. Clarke var. pygmaea)、丝颖羽柱针茅(Stipa basiplumosa)、弯叶画眉草(Eragrostis curvula)、矮生蒿草(Kobresia humilis)、线叶蒿草(Kobresia capillifolia (Decne.) C. B. Clarke)、青藏苔草(Carex moorcroftii)、小画眉草(Eragrostis minor Host. Icon. et Deser.)、冷地早熟禾(Poa crymophila Keng)。其它可饲用建群草：高山唐松草(Thalictrum alpinum L.)、伊朗蒿(Artemisia persica)、毛香火绒草(Leontopodium stracheyi)、钉柱委陵菜(Potentilla saundersiana)、纤杆蒿(Artemisia demissa)、小龙胆(Gentiana parvula H. Smith)、广布野豌豆(Vicia lilacina)、大头蒲公英(Sect. Calanthodia (Dahlst.) R. Doll)、毛连蒿(A. vestita Wall)、高山豆(Tibetia himalaica (Baker) Tsui)、高山大戟(Euphorbia stracheyi)、大果大戟(Euphorbia wallichii)、马先蒿(Pedicularis resupinata L.)、禾叶点地梅(Androsace graminifolia C. E. C. Fisch)、长把马先蒿(Pedicularis longistipitata)、天蓝苜蓿(Medicago lupulina L.)、二裂委陵菜(Potentilla bifurca Linn.)、矮蒿草(Kobresiapygmaea)等。
天然牧草采食量采用模拟采食法测定。根据公式:I=T×S×D计算绵羊一天的采食量(I为采食量；S为采食速度；D为单口采食量；T为全天采食时间)。由公式计算得知(风干物质基础)，7月轻度放牧区绵羊采食量约为1.51 kg·d-1，重度放牧区采食量约为1.19 kg·d-1。
舍饲组绵羊饲用饲料为课题组研发的全价TMR“草饼干”(表 1)，TMR“草饼干”规格为32 mm×32 mm的长方体，且固化成型，长度为3~5 cm。每只羊每天按规定分两次饲喂，总量为1.43 kg，根据采食情况，上下浮动20%左右，自由饮水。
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表 1 TMR“草饼干”主要养分含量(干物质基础) Table 1 Major nutrients content in TMR fodder (DM basis) |
天然牧草样品来自于试验时段单位样方中可食用天然牧草地上混合样，60 ℃干燥后，80目粉碎备用。放牧组和舍饲组饲草料中部分养分由深圳谱尼测试有限公司测试完成(表 2)。总碳水化合采用酸水解蒽酮法测定，纤维素采用范氏(van soest)法测定，粗蛋白采用凯氏定氮法测定，粗脂肪采用索氏抽提法测定，粗灰分采用灰化重量法进行测定，非纤维性碳水化合物(NFC)=总碳水化合物－(中性洗涤纤维+粗蛋白质+粗脂肪+粗灰分)。
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表 2 舍饲组和放牧组饲草中主要养分含量(风干物质基础) Table 2 The main nutrients in the grazing and barn feeding groups (air-dry basis) |
试验开始于2018年6月份(青藏高原牧草返青季)，严格按要求饲喂半年后进行采样分析。
采样时，放牧组和舍饲组各随机选取两个重复中的彭波半细毛羊5只，于饲喂前或放牧前，用预先消毒好的胃管和器械抽取羊瘤胃液，纱布过滤后，速置于干冰环境下贮存。样品于当天送往青海西宁，再从西宁托运至上海派森诺生物科技有限公司进行细菌宏基因组测定分析。
1.2.2 微生物组DNA的提取及荧光定量分析 1.2.2.1 微生物组总DNA提取及目标片段PCR扩增使用OMEGA Soil DNA Kit(目录号：D5625-01)试剂盒提取样本中的微生物组总DNA，并通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，同时采用紫外分光光度计对DNA进行定量。琼脂糖凝胶电泳检测参数：Marker 5 μL，样品5 μL。
PCR扩增采用NEB公司的Q5高保真DNA聚合酶，并严格控制扩增循环数。总悬浮颗粒物中全部细菌的DNA测序所用扩增引物为V3+V4区338F/806R(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′/5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。扩增体系总量为25 μL：5×reaction buffer 5 μL，5×GC buffer 5 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1)2 μL，正反向引物(10 μmol·L-1)各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.75 μL，Q5 DNA Polymerase 0.25 μL。反应程序：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃终延伸5 min，最后4 ℃保温。
1.2.2.2 扩增产物回收纯化PCR扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并对目标片段采用AXYGEN公司的凝胶回收试剂盒回收。
1.2.2.3 扩增产物的克隆按照pMD 18-T Vector Cloning Kit试剂盒的程序进行连接，总反应体系为10 μL：pMD 18-T Vector 1 μL，纯化PCR产物3 μL，ddH2O 1 μL，加入Solution I 5 μL。于16 ℃连接2 h后，全量10 μL连接产物加入到100 μL感受态细胞(JM109)中，转化后加入37 ℃预热的SOC液体培养基890 μL，于37 ℃和180 r·min-1条件下振荡60 min。取50 μL菌液涂于加有Amp、IPTG和X-gal的LB琼脂平板培养基平板上，37 ℃倒置培养12~16 h，直至可观察到菌落为止。
1.2.2.4 阳性质粒的筛选与鉴定挑选单个白色菌斑置于1.5 mL含氨苄青霉素的LB培养基中，于37 ℃，180 r·min-1振荡培养12~16 h，直至培养液变混浊。然后进行菌液PCR鉴定，体系与普通PCR体系一致。每种微生物选3个PCR鉴定为阳性的菌液进行测序鉴定。根据测序结果在GenBank上利用BLAST进行序列的同源性分析。验证的菌液按照TaKaRa Mini BEST Plasmid Purification Kit Ver. 4.0试剂盒的操作要求提取质粒DNA。
菌检：PCR体系为菌液3 μL，M13F-47 0.5 μL，M13R-48 0.5 μL，10× Buffer 1 μL，dNTP 0.5 μL，Taq酶0.25 μL，ddH2O 4.25 μL。将PCR产物加至加样孔中，于120 V电泳15~20 min，电泳结束后于紫外灯下观察，根据目的片段大小判断是否有相应条带，相应编号的菌液可进行质粒抽提。
1.2.2.5 测序选用的试剂为ABI公司的BDT3.1测序试剂盒(BigDyeTerminator v3.1)，测序反应均按照BDT3.1使用手册进行。
1.2.2.6 荧光定量PCR标准曲线的制作分别取各个微生物的阳性克隆质粒，用微量紫外分光光度计检测其浓度。根据各质粒的分子量与质量浓度计算成拷贝数，制得标准品。
质粒拷贝数(Copies·μL-1)＝浓度(ng·μL-1)×10-9×6.02×1023(Copies·mol-1)/[660(g·(mol·bp)-1)×质粒碱基对数(bp)][16]。
对已知拷贝数质粒标准品进行10倍的连续梯度稀释，取5~8个稀释梯度作为模板进行PCR反应。每梯度3个重复，同时设置3个无模板的空白对照。建立反映Ct值与质粒拷贝数对应关系的定量标准曲线。
1.2.2.7 扩增产物荧光定量分析参照电泳初步定量结果，将PCR扩增回收产物进行荧光定量分析，荧光试剂为Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit，定量仪器为Microplate reader(BioTek，FLx800)。
标准质粒和样品中的qRT-PCR条件一致，均采用10 μL反应体系：SYBR Green I荧光染料预混试剂5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.2 μL，质粒DNA模板或样品DNA模板1 μL(DNA模板浓度稀释到10 ng·μL-1左右)，BSA 0.05 μL和灭菌双蒸水3.55 μL。反应条件：按反应体系配置的PCR反应溶液置于Real-time PCR仪上进行PCR反应，选择两步法。反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火和延伸30 s并采集荧光信号，共40个循环；之后进行熔解曲线分析(melt curve)，60 ℃升至95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s，自动采集荧光[17]。
1.2.3 数据处理及显著性检验① 通过质量初筛的序列按照引物和基因信息，识别分配入对应样本，并去除嵌合体等疑问序列；②对获得的序列进行OTUs归并划分，每个OTU的代表序列用于分类地位鉴定以及系统发育学分析；③检测及统计分析：根据OTU在不同样本中的丰度分布，利用偏最小二乘判别分析(PLS-DA, partial least squares discriminant analysis)方法进行分析，以偏最小二乘回归模型为基础，根据样本的分组信息，对群落结构数据进行判别分析。PLS-DA通过寻找物种丰度矩阵和给定的样本分组信息的最大协方差值，在新的低维坐标系中对样本重新排序。PLS-DA可以减少变量间多重共线性产生的影响。利用组间群落差异分析(LEfSe, LDA effect size)，即在多组样本中采用的非参数因子Kruskal-Wallis秩和检验检测不同分组间丰度差异显著的物种；再利用Wilcoxon秩和检验检查在显著差异物种类中的所有亚种比较是否都趋同于同一分类级别；最后用线性判别分析(LDA)对数据进行降维和评估差异显著菌种的影响力。
2 结果 2.1 彭波半细毛绵羊瘤胃中细菌的OTU丰度分析宏基因组的研究中，对品系、种、属等同一分类物设置同一标志，产生了操作分类单元(OTU)，而这一序列是根据高变区序列比对得出的，一般要求相似度要大于97%的序列聚为一类，称为同一个OTU。此次分析共鉴定出7 962个有效OTUs。
根据结果(表 3)，瘤胃中的主要优势菌种以拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)两个门的菌为主，其丰度值约占瘤胃测定细菌的90%以上。瘤胃液中放牧组的拟杆菌门丰度低于舍饲组，但两组间差异不显著(P＞0.05)。厚壁菌门在放牧组的丰度高于舍饲组，两组间差异显著(P＜0.05)。
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表 3 已知的16个菌门和前19个优势菌属在羊瘤胃中的相对丰度值 Table 3 Abundance value of the top 19 predominant bacterial genus and the known 16 bacterial phylum in rumen fluid |
根据宏基因组测试分析结果(表 3)，对瘤胃中前19个优势菌属进行统计分析，并对测定菌门和主要菌属进行统计分析。发现瘤胃中普氏菌属(Prevotella)丰度最高，舍饲羊瘤胃中普氏菌属明显增加，但与放牧组差异不显著(P＞0.05)。瘤胃球菌属(Ruminococcus)，属厚壁菌门，是瘤胃纤维素的主要降解菌，包括白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)和黄色瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)，其在放牧组的丰度值显著低于舍饲组(P＜0.05)。丁酸弧菌属(Butyrivibrio)，属厚壁菌门，在放牧组的丰度显著高于舍饲组(P＜0.05)。产芽孢菌科(Erysipelotrichaceae)，RFN20属在放牧组的丰度显著低于舍饲组(P＜0.05)。谜样细菌门(TM7)，TM7-3纲，CW040目，F16科的一类菌在放牧组的丰度值显著低于舍饲组。密螺旋体属(Treponema)，属螺旋体门，其在放牧组的丰度值显著高于舍饲组(P＜0.05)。韦荣氏菌科(Veillonellaceae)的产琥珀酸菌属(Succiniclasticum)在放牧组的丰度值高于舍饲组，但差异不显著(P＞0.05)。假丁酸弧菌属(Pseudobutyrivibrio，因总体丰度不高，未列入表 3中)在放牧组的丰度含量为(1.52±0.39)%，舍饲组为(0.03±0.02)%，显著下降(P＜0.05)。月形单胞菌属(Selenomonas，因总体丰度不高，未列入表 3中)在放牧组的丰度含量为(1.40±0.43)%，舍饲组为(0.06±0.07)%，显著下降(P＜0.05)。
2.2 放牧组和舍饲组绵羊瘤胃主要特征性菌群的显著性分析 2.2.1 偏最小二乘判别分析(PLS-DA)在分析过程中使用R软件，根据物种丰度矩阵和样本分组数据构建PLS-DA判别模型。计算每个菌种变量的投影重要度(variable importance in projection，VIP)系数(需VIP>1，值越大说明该菌种对于组间差异的贡献值越大)。
图 1中PLS-DA模型根据主成分因子拟合，从主成分因子VIP中共筛选出46个属的瘤胃细菌VIP>1。这些属中有一类在目前的数据库中没有相关数据，未能匹配。说明这46个属的细菌随着饲料和饲养方式的改变细菌丰度也发生了相应的变化。46个属的细菌分属于放线菌门(Actinobacteria)中的3个属，拟杆菌门(Bacteroidetes)中的8个属，迷踪菌门(Elusimicrobia)中的1个属，厚壁菌门(Firmicutes)中的17个属，黏胶形菌门(Lentisphaerae)中的1个属，变形菌门(Proteobacteria)中的6个属，螺旋体门(Spirochaetes)的1个属，SR1门中的1个属，无壁菌门(Tenericutes)的4个属，TM7门的1个属，疣微菌门(Verrucomicrobia)的1个属，WPS-2菌门的1个属，未知菌门的1个属。在测定的18个细菌门中，有13个门中的部分菌种对放牧组和舍饲组差异性贡献最大，VIP值均>1。同时，在此次分析中发现了75个OTUs未能进行种属的匹配，此75个OTUs可能是植物序列，也可能是动物组织、其它瘤胃微生物或新的菌属序列。
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图 1 PLS-DA模型VIP值图 Fig. 1 VIP value plot of PLS-DA |
LEfSe(LDA effect size)分析是对两组或多组之间进行比较，从而找到组间显著性差异的菌种。图 2中，分类等级树展示了样本群落中从门到属(从内圈到外圈依次排列)所有分类单元的等级关系，节点大小对应于该分类单元的平均相对丰度，白色节点代表没有显著组间差异的分类单元，而绿色和红色则表明这些分类单元有显著的组间差异，且在该色所代表分组样本中丰度较高。字母则标识了组间存在显著差异的分类单元名称。
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图 2 基于分类等级树的组间差异分类单元展示图 Fig. 2 The taxon chart based on classification tree and difference between the two groups |
对已知的124个检测属中，采用LEfSe进行差异性检验，57个属的细菌丰度在两组间存在显著差异。发现放牧组中拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、黏胶球形菌门(Lentisphaerae)、δ-蛋白菌门(Delta proteo bacteria)、SR1菌门、软壁菌门(Tenericutes)、无壁菌门(Tenericutes)、WPS_2菌门中的部分细菌在瘤胃中的分布相对丰度值较高；舍饲组中放线菌门(Actinobacteria)、放线红蝽菌门(Coriobacteriales)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、α-变形杆菌门(Alpha proteobacteria)、α-立克次氏体目(Alpha proteo Rickettsiales)、δ-脱硫杆菌门(Delta proteo Desulfo bacteriales)、γ-肠杆菌门(Gamma proteo Entero bacteriales)、γ-假单胞菌门(Gamma proteo Pseudomonadales)、无壁菌门(Tenericutes)中的部分菌在瘤胃中的分布相对丰度值较高。拟杆菌门(Bacteroidetes)放牧组的拟杆菌纲，拟杆菌目，异普雷沃氏菌科(Paraprevotellaceae)平均相对丰度值高；而舍饲组的拟杆菌纲、拟杆菌目、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)和普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)丰度含量较高。厚壁菌门(Firmicutes)放牧组中的梭菌纲，梭菌目中，梭菌科(Clostridiaceae)、毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)和韦荣球菌科(Veillonellaceae)中菌的相对丰度值高；而同门中，舍饲组的芽孢杆菌纲中，乳酸杆菌目(Lactobacillales)和梭菌纲、梭菌目中毛螺菌科(Lachnospiraceae)和产芽孢菌纲(Erysipelotrichi)中的部分菌相对丰度较高。放牧组中，属无壁菌门(Tenericutes)柔膜菌纲(Mollicutes)中的Acholeplasmatales科、RF3纲中的细菌相对丰富度高；同门中，舍饲组的柔膜菌纲(Mollicutes)中的RF39目中的细菌相对丰度含量较高。
3 讨论 3.1 不同蛋白和纤维素含量对绵羊瘤胃中细菌丰度的影响瘤胃微生物，特别是在庞大的细菌群落中，是相互依存，又相互竞争的关系。核心是菌群对营养物质和代谢产物的竞争和依赖。研究发现，肥胖者比纤瘦者多出约20%的厚壁菌，而拟杆菌则少了约90%。对奶牛瘤胃细菌多样性的研究中，围产前期瘤胃中的优势菌门为拟杆菌门和厚壁菌门[18]，这两个门的细菌丰度也占总量的90%以上[19]。在本试验中，西藏彭波半细毛羊瘤胃中微生物的优势菌中丰度值最高的为拟杆菌门，舍饲组比放牧组高6.00%，其次为厚壁菌门，放牧组比舍饲组高6.60%。这两个现象与人的消化道优势菌群不同，但牛和羊具有一定的共性。试验中，舍饲组粗蛋白含量比放牧组高9.25%，NDF低42.64%，舍饲组中拟杆菌的升高说明拟杆菌门中部分菌可以协同其它菌分解纤维素，但细菌的分裂增殖主要依赖于饲草中丰富的蛋白质是确定无疑的。Crowley等[20]研究认为，草食性动物的肠道菌群中较高的拟杆菌门与采食较高含量纤维的饲粮有关，而藏系绵羊的测试结果与Crowley等[20]的结论不一致。可以推断，较高含量蛋白的饲草可以促进纤维素分解菌的增殖和纤维素的分解。
本研究中，从门的分类而言，绵羊瘤胃中拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度最高，舍饲组的丰度为(55.52±12.18)%，放牧组为(49.52±5.72)%。该门已知分为4个纲，分别为拟杆菌纲(Bacteroidetes)、黄杆菌纲(Flavobacteria)、鞘脂杆菌纲(Sphingobacteria)和未定纲。在瘤胃中的拟杆菌门主要纲包括拟杆菌纲(Bacteroidetes)和黄杆菌纲(Flavobacteria)两类。普氏菌属(Prevotella)是瘤胃中丰度最高的菌属，放牧组达(16.95±5.87)%，舍饲组达(35.96±14.60)%。已发现的普氏菌属有二路普氏菌(bivia)、栖牙普氏菌(denticola)、颊普氏菌(buccae)、和中间普氏菌(intermedia)、变黑普氏菌(nigrescens)、口颊普氏菌(buccalis)、真口普氏菌(veroralis)、黑色素普氏菌(melaninogenicus)、栖瘤胃普雷沃菌(ruminicola subsp. Ruminicola)、短栖瘤胃菌(ruminicola subsp. Brevis)、谭氏普雷沃菌(tannerae)、动胶普氏菌(zoogleoformans)、albensis、brevis、bryantii、corporis、dentalis、disiens、enoeca、heparinolytica、loescheii、oralis、oris、oulorum、pallens等25种[21]。普氏菌属在舍饲组瘤胃中的显著升高是拟杆菌门相对丰度值高的主要因素。舍饲组绵羊饲喂全价TMR饲料，纤维素NDF含量比放牧组少42.64%，说明降低纤维素在饲料中的含量可增加普氏菌属的数量。对人消化道优势菌群的研究发现，降低纤维饮食也会增加普氏菌属(Prevotella)的数量[22]。普氏菌属的主要功能是化能有机营养，分解糖能力中等，主要发酵产物是乙酸和琥珀酸及少量的异丁酸、异戊酸和乳酸，利用氨基酸的能力低。普氏菌属是一类具有多种功能的菌种，它促进最初的蛋白质分解并协同其他分解纤维素的菌种发挥作用，提高机体对纤维素的分解能力[23]。
在绵羊瘤胃中厚壁菌门(Firmicutes)的丰度位于第二，舍饲组的丰度为(36.68±9.78)%，放牧组为(43.28±4.59)%。依据伯杰氏细菌系统分类学，厚壁菌门分为梭菌纲(Clostridia)、柔膜菌纲(Mollicutes)、芽孢杆菌纲(Bacilli)、热石杆菌纲(Thermolithobacteria)。在羊瘤胃中的主要优势菌纲为梭菌纲(Clostridia)和芽孢杆菌纲(Bacilli)。在这一门中，最主要的优势差异菌属分布在梭菌纲(Clostridia)中的3个属，分别为梭菌目(Clostridiales)，毛螺菌科(Lachnospiraceae)的丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、假丁酸弧菌属(Pseudobutyrivibrio)和未定属(Unclassified Lachnospiraceae)，在放牧组的丰度分别为4.57%、1.52%和7.55%，在舍饲组的丰度下降到1.60%、0.02%和2.84%。研究表明，梭菌纲主要以纤维素为底物进行降解，并产生H2[24]。丁酸弧菌属梭菌目主要功能是利用纤维素、淀粉和其他多聚糖。说明随着纤维素含量的下降，分解纤维素的主要菌种丰度值也随之下降，反之亦然，当溶纤维丁酸弧菌数量减少时，反刍动物对粗纤维的消化率会降低[25]。
在绵羊瘤胃中丰度值排在第三的菌为螺旋体门(Spirochaetes)，放牧组丰度为(1.99±1.75)%，舍饲组为(0.76±0.59)%。对饲料变化影响最大的是密螺旋体属(Treponema)。根据长期瘤胃液显微观察和培养，瘤胃中的密螺旋体与半纤维素的降解具有相关性，同时也影响其它菌群数量的变化。
3.2 绵羊瘤胃细菌在不同样本中的差异性分析不同的组间差异性分析软件各有其优缺点，本研究利用PLS-DA和LEfSe统计软件寻找对环境依赖性均明显的瘤胃微生物，再判断这些微生物在瘤胃中依赖的主要养分因素。
PLS-DA分析的特点是根据测量到的若干变量值进行主成分分析，构建PLS-DA差别模型，对不同样本的特征分别进行训练，产生训练集，并检验训练集的可信度，计算菌种的VIP值，确定菌种与瘤胃微环境的依赖程度。优点是减少变量间多重共线性产生的影响，使检验尽可能归真。
LEfSe分析是将两样本混合排序，按顺序赋秩，如果两个样本的平均秩差别不大，则差异不显著，若两样本平均秩相差较大，则进行检验，计算P值并作出判断决策。其优点是可以判断出某一样本的特征对菌属的影响程度。
从两种检验分析中排除假阳性，筛选出的纤维素依赖菌有假丁酸弧菌属(Pseudobutyrivibrio)、月形单胞菌属(Selenomonas)、粪球菌属(Coprococcus)、梭菌属(Clostridium)、厌氧弧菌属(Anaerovibrio)、毛螺旋菌科下一属(Shuttleworthia)、类普雷沃氏菌科下一属(CF231)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、类普雷沃氏菌科下一属(YRC22)、毛螺菌属(Lachnospira)、毛螺菌科下一属(Moryella)。说明这些菌属对高纤维饲草具有依赖性，或当依赖于高蛋白质和高能量水平的菌大量繁殖时可抑制此类纤维素菌的生长。这与通过提高饲粮精粗比，溶纤维丁酸弧菌(B.fibrisolvens)的相对表达量下降，产甲烷菌(Methanogen)的相对表达量增加[26]的研究结果相符。假丁酸弧菌属(Pseudobutyrivibrio)在瘤胃中分泌较高的纤维素酶，在纤维降解过程中发挥重要的作用[27]。月形单胞菌是瘤胃主要的琥珀脱羟微生物，是生糖前质丙酸的主要提供者[28]，同时也是瘤胃乳酸代谢的一类重要菌[29]。总体而言，不同品种家畜瘤胃内微生物具有特征性，但当饲粮中粗饲料增加时，纤维分解菌的相对丰度也随之增加[30]。
当饲粮中增加精料时，瘤胃内淀粉分解菌的数量随之增加[31]。舍饲组的脱硫叶菌属(Desulfobulbus)、奇异菌属(Atopobium)、韦荣球菌科下一属(p-75-a5)、普氏菌属(Prevotella)、布劳特氏菌属(Blautia)、链球菌属(Streptococcus)丰度较高，它们是依赖于高蛋白质能量水平的菌或依赖于其代谢产物进行增殖的瘤胃菌。
4 结论在绵羊瘤胃中优势菌门丰度最高为拟杆菌门，舍饲组比放牧组高6.00%；第二优势菌群为厚壁菌门，放牧组比舍饲组高6.60%；第三优势菌群为螺旋体门，放牧组比舍饲组高1.23%。放牧组(高纤维素)显著高于舍饲组的主细菌属有：假丁酸弧菌属(Pseudobutyrivibrio)、月形单胞菌属(Selenomonas)、粪球菌属(Coprococcus)、梭菌属(Clostridium)、厌氧弧菌属(Anaerovibrio)、毛螺旋菌科下一属(Shuttleworthia)、普雷沃氏菌科下一属(CF231)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、普雷沃氏菌科下一属(YRC22)、毛螺菌属(Lachnospira)、毛螺菌科下一属(Moryella)。舍饲组(高蛋白和NFC)主要显著的瘤胃细菌属有：脱硫叶菌属(Desulfobulbus)、奇异菌属(Atopobium)、韦荣球菌科下一属(p-75-a5)、普氏菌属(Prevotella)、布劳特氏菌属(Blautia)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、链球菌属(Streptococcus)。结果说明，合理的蛋白能量水平饲料不仅利于蛋白、淀粉依赖菌(协同纤维素降解菌、普氏菌(Prevotella))的增殖，也有利于主要纤维降解菌(瘤胃球菌(Ruminococcus))的增殖。同时，高蛋白能量水平的饲料也抑制了部分纤维素分解菌，如厚壁菌门(Firmicute)、螺旋体门(Spirochaetes)等。
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