2. 青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室, 成都 610041;
3. 青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室, 成都 610041
2. Key Laboratory of Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Utilization of Ministry of Education, Chengdu 610041, China;
3. Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Utilization Key Laboratory of Sichuan Province, Chengdu 610041, China
牦牛是活动于我国青藏高原上的特有物种，可以为牧民提供生产及生活所必需的多种资源，具有极高的经济价值。然而牦牛性成熟晚，繁殖周期长，繁殖能力低下，因此改善牦牛的生育能力对提高牦牛的生产性能，改善牧民的生活水平以及促进高原畜牧业的发展具有重要的经济和社会价值[1-2]。
近年来，越来越多的研究表明，小RNA在真核细胞生物中扮演着重要的角色。piRNA(PIWI-interacting RNAs)是一类长度在24~32个核苷酸的小RNA，因其能与PIWI蛋白家族成员结合而得名[3-5]。piRNA主要来源于基因组序列上3个区域：富含基因重复序列的基因间区、长链非编码RNA和mRNA的3′-UTR区[6]。基因间区上的piRNA通常成簇分布，称为piRNA簇(piRNA cluster)[7]，piRNA簇中有些只能单向转录，产生和簇上一条DNA序列互补的piRNA；有些簇则可以双向转录，同时产生和簇上两条DNA序列互补的正义和反义piRNA[8]。初级piRNA一般来源于对应转座子的反义链，并且5′端通常带有尿嘧啶(U)，随后初级piRNA与PIWI家族成员之一AUB结合，并与AGO3共同作用，启动“乒乓循环(ping-pong cycle)”；在这一过程中互补的靶序列会被分解，生成次级piRNA(secondary piRNA)，随后次级piRNA的5′端将与和AUB结合的初级piRNA形成互补配对的10个核苷酸，并且倾向于在其5′端的第10位核苷酸上带有腺嘌呤(A)[9-11]。小鼠染色体上的piRNA分布极不均匀，主要分布在2、5、4、17号染色体上[5, 12-13]。piRNA在调控转座子转座、基因表达及染色体修饰等方面均发挥了重要作用[14-17]，而其在生殖系统中发挥的作用尤为关键，研究表明，在果蝇、线虫、斑马鱼及小鼠中突变PIWI 均会导致生殖细胞的发育被破坏，进而导致物种不育[18-20]。
精子发生的正常进行是哺乳动物维持其种群繁衍的基本条件。精子发生从胚胎期精原干细胞的分化开始至精子的形成，是涉及到细胞分化、基因表达及染色体动态变化的复杂生物学过程[21]。研究表明，与piRNA结合的多个PIWI蛋白家族成员高表达于雄性生殖细胞，例如，在小鼠睾丸中，Piwil2(piwi-like RNA-mediated gene silencing 2, Mili)和Piwil4(piwi-like RNA-mediated gene silencing 4, Miwi2)均在胚胎期生殖细胞中开始表达，前者的表达在细线期和偶线期中断，而后恢复并一直持续到圆形精细胞阶段，后者的表达在出生后几天即消失，而Piwil1(piwi-like RNA-mediated gene silencing 1, Miwi)的表达从出生后几天开始一直持续至精子形成[22]。以上结果表明，piRNA很可能在雄性哺乳动物出生前后，即从精原干细胞向各级生精细胞分化的过程中发挥了重要作用。迄今为止，对于出生前后牦牛睾丸发育过程中的piRNA种类、特征及其发挥的作用仍然不清楚。
本研究对胚胎期(4~5个月胎牛)、幼年期(1岁)及青年期(3岁)牦牛睾丸组织中的piRNA进行高通量测序及分析，同时为进一步研究piRNA在不同年龄牦牛睾丸中的表达规律，对3个阶段牦牛睾丸中PIWI家族基因的表达进行了检测。本研究为深入探讨piRNA对牦牛睾丸发育及精子发生的调控机制，及提高雄性牦牛群体的繁育能力提供了一定的理论基础和科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物与样品采集动物样本采自成都市青白江屠宰场，选择健康雄性牦牛，根据年龄将其划分为胚胎期(4~5个月)、幼年期(1岁)及青年期(3岁)，每组各两头。动物经颈部放血处死剖腹后，先用DEPC水浸泡的无菌剪刀将双侧睾丸及其周边组织完整取下，再移除附睾及脂肪垫，将睾丸组织剪成约1 cm×1 cm×0.5 cm的小块，迅速放入含有RNA保护剂(RNA laterTM)的离心管中，并立即投入液氮罐中，在1 h内运回实验室，-80 ℃冰箱中保存。来源于同一年龄段的两个动物组织样本视为生物学重复。
1.2 主要试剂及仪器RNA laterTM购自Invitrogen公司，货号AM7020；Trizol购自Invitrogen公司, 货号15596026；PrimeScriptTM RT Reagent Kit反转录试剂盒购自TaKaRa公司，货号RR037A；Real-time PCR Master(ROX)(Real-time PCR 2×mix)购自Roche公司，货号04913914001；分光光度计购自Implen公司，型号NanoPhotometer-N60；荧光定量仪购自Life Technologies公司，型号Qubit2.0；生物分析仪购自安捷伦公司，型号Agilent 2100；荧光定量PCR仪购自Life Technologies公司，型号ViiA7。
1.3 Small RNA(sRNA)文库构建、质检与测序按照Trizol法[3]分别提取上述6个样本中的总mRNA，利用0.1%琼脂糖凝胶电泳确定样品中RNA完整性及排除DNA污染，利用NanoPhotometer分光光度计检测RNA纯度(OD260 nm/OD280 nm及OD260 nm/OD230 nm比值)，使用Qubit2.0荧光定量仪对RNA浓度进行精确定量，通过Agilent 2100生物分析仪精确检测RNA完整性，然后对6个测序样本分别进行cDNA文库构建。文库构建的起始RNA总量为3 μg，文库构建参考文献[3, 23]所述方法进行，RNA被连接到3′及5′末端的接头后被反转录成cDNA并进行PCR扩增，用8%的聚丙烯酰胺凝胶对PCR产物进行电泳纯化，对长度在140~160 bp (small非编码RNA加上3′及5′末端接头序列的长度)的DNA片段进行回收，利用Illumina Hiseq 2500平台进行测序。
1.4 piRNA测序数据分析首先对原始数据(raw reads)进行过滤，主要包括去除带接头(adapter)的reads、去除含无法确定碱基信息的reads、去除5′末端接头序列污染的reads、去除不含3′末端接头及荧光标记的reads、去除含有poly A/T/G/C以及低质量reads(Qphred ≤20的碱基数占整个read长度的30%以上的reads)，得到待分析数据(clean reads)。然后将待分析数据与Rfam数据库(ftp://selab.janelia.org/pub/Rfam)进行比对，按照特定的顺序(已知的miRNAs>rRNAs>tRNAs>snRNAs>snoRNAs>重复序列>基因区>新miRNAs)对每一条sRNA进行唯一的注释。其中piRNA来源于重复序列或未被注释的sRNA, 大小在24~32 nt之间，鉴于piRNABank (http://irnabank.ibab.ac.in)数据库中仅收录了人、小鼠、大鼠、果蝇、斑马鱼及鸭嘴兽6个物种的piRNA，故采用k-mer[24]算法鉴定牦牛睾丸中piRNA序列，对各样品未知piRNA的数量、碱基偏好性、染色体密度及来源进行分析，通过GO功能富集分析对piRNA来源的基因进行功能预测，用TPM值(transcript per million, 每百万条reads的转录本)来表示piRNA及piRNA cluster的表达水平(TPM=reads (sRNA) /total reads ×106)。
1.5 总RNA提取、反转录及荧光定量PCR按照Trizol法[3]提取不同发育阶段牦牛睾丸组织总RNA，依照反转录试剂盒PrimeScriptTM RT Reagent Kit说明书所述方法反转录合成cDNA，根据GenBank报道的牦牛(Bos mutus)PIWIL1(GenBank登录号：XM_005889573.2, 下同)、PIWIL2(XM_005895316.2)、PIWIL3(XM_005889850.1)及PIWIL4(XM_005890045.2)的mRNA序列，利用Primer5设计引物。荧光定量PCR反应体系为10 μL: Real-time PCR 2×mix 5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.25 μL，睾丸组织cDNA 2 μL，ddH2O 2.5 μL。PCR反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 31 s, 共40个循环，重复3次。所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，选择GAPDH为内参基因。引物序列见表 1。
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表 1 荧光定量PCR引物序列 Table 1 Primer sequences for real-time quantitative PCR |
利用DESeq R软件(版本：1.8.3)对两个比较组合之间(每个组两个生物学重复)的piRNA及piRNA cluster进行差异表达分析, 利用Benjamini-Hochberg法对P值进行校验。采用one-way ANOVA (Tukey’s multiple comparison test)对各年龄段间未知piRNA数目及荧光定量PCR的数据进行统计，统计结果以“mean±SEM”的方式表示，P < 0.05被认为具有显著性差异。
2 结果 2.1 不同阶段牦牛睾丸中未知piRNA数目统计3个阶段牦牛睾丸中未知piRNA数目统计结果见表 2，幼年期(659 366±10 414)及青年期(618 693±31 972)睾丸中piRNA的数量显著多于胎牛阶段(14 264±2 035)(P < 0.01)，而幼年期与青年期睾丸间piRNA的数量并无显著差异(P>0.05)。
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表 2 不同阶段牦牛睾丸中未知piRNA数目统计 Table 2 Number of unknown piRNA in yak testis at different stages |
piRNA长度一般在26~32 nt，且同miRNA一样，5′端具有很明显的尿嘧啶(U)偏好性[10]，图 1A显示了不同长度piRNA的首位碱基偏好性，与文献报道一致[10]，不同长度的piRNA首位均表现出明显的U偏好性；图 1B所示为piRNA序列每个位点的碱基偏好性，除首位外，第6、9、11、13、16、19、21、31及32位也具有明显的U偏好性，此外第2位具有鸟嘌呤(G)偏好性，第3和第5位具有腺嘌呤(A)偏好性。
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A. piRNA首位碱基偏好性示意图；B. piRNA每个位点的碱基偏好性示意图 A. The base preference of first site of different length piRNA; B. Base preference for each site of piRNA sequence 图 1 不同长度piRNA碱基偏好性分析 Fig. 1 The base preference of different length piRNA |
将得到的piRNA依次与基因组比对，探索其在基因组上的分布，如图 2所示，牦牛睾丸中piRNA的13.44%来自基因间区的重复序列，21.40%来自基因区，65.15%来自其他区域，新发现的piRNA中13.58%来自基因间区的重复序列，7.35%来自基因区，79.08%来自其他区域，由此可见，大部分的piRNA均来自基因组中除基因间区和基因区之外的其他区域。
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A.总piRNA来源分布；B.未知piRNA来源分布 A. Total piRNA source distribution; B. Unknown piRNA source distribution 图 2 piRNA来源分布示意图 Fig. 2 Schematic diagram of piRNA source distribution |
对piRNA来源基因进行GO富集分析，分别从生物过程(biological process)、细胞组分(cellular component)和分子功能(molecular function)及其子条目上富集的基因个数的分布情况进行分析，如图 3所示，piRNA来源基因的数目在生物学过程、细胞组分和分子功能上排在首位的分别为代谢过程(metabolic process)、细胞(cell)和结合(binding)。
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A、B及C分别为生物过程、细胞组分及分子功能中富集基因数目最多的前5个条目 A, B and C represent the top 5 items with the highest number of enriched genes in biological process, cellular component, and molecular function, respectively 图 3 piRNA来源基因的GO功能富集分析 Fig. 3 Gene Ontology enrichment analysis of piRNA source genes |
研究表明，piRNA在染色体上一般成簇分布，长度在20~100 kb左右，piRNA簇的密度为40~4 000个·100 Mb-1。piRNA cluster先经过转录形成一条长的单链前体，再进一步经过加工处理，形成26~32 nt左右的成熟piRNA[7-8]。如图 4所示，牦牛睾丸中piRNA cluster在不同染色体上的分布并不均匀，在前25号染色体中，18号染色体上的piRNA cluster密度最高，21号染色体的密度最低。
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图 4 piRNA cluster在牦牛睾丸前25条染色体上的分布密度 Fig. 4 The distribution density of piRNA cluster on the first 25 chromosomes of yak testis |
对3个发育阶段的6个样本中的piRNA cluster进行表达分析，如图 5所示，不同发育阶段牦牛睾丸中piRNA cluster的表达丰度有很大差异，胎牛睾丸中超过60%的cluster均处于低丰度(0~0.1 TPM)，而1和3岁龄牦牛睾丸组织中超过70%的cluster均处于高丰度(>15 TPM)。
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图 5 piRNA cluster表达水平分析 Fig. 5 Analysis of piRNA cluster expression level |
鉴于胚胎期(4~5个月)未知piRNA的数量和piRNA cluster的数量显著低于其他两个阶段(1和3岁龄)，本研究进一步分析了PIWI家族基因(PIWIL1、PIWIL2、PIWIL3及PIWIL4)在3个阶段牦牛睾丸中的表达，如图 6所示，其中PIWIL1在幼年和青年期牦牛睾丸中的表达均极显著高于胎牛期(P < 0.001)，而PIWIL4在幼年期及青年期牦牛睾丸中的表达均显著低于胎牛期(P < 0.05)，这两个基因在幼年期及青年期牦牛睾丸间的表达均无明显差异，PIWIL2和PIWIL3在3个阶段牦牛睾丸中的表达均无明显差异。
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胎牛中mRNA的表达水平被定为1。*. P < 0.05；***. P < 0.001 The mRNA levels in fetal testis were arbitrarily set to 1. *. P < 0.05; ***. P < 0.001 图 6 3个阶段牦牛睾丸中PIWI家族基因mRNA的表达分析 Fig. 6 mRNA expression analysis of the PIWI gene family in testis of yak at 3 stages |
piRNA是一类能够与PIWI蛋白家族成员结合的、长度为24~32 nt，并且在生殖细胞中高表达的小RNA[3-5]，被认为与雄性动物的生殖能力密切相关。在多个模式动物如果蝇、线虫、斑马鱼及小鼠中对PIWI 家族基因突变均会导致其雄性不育[18-20]。近年来, 已有研究对一些禽畜如鸡、绵羊、蒙古马等睾丸发育过程中的piRNA及piRNA簇进行鉴定和分析[3, 25-26]，但这些研究主要集中在胚后发育阶段，对参与胚胎期睾丸发育的piRNA及piRNA簇的种类、特征及功能仍然知之甚少。
与人、蒙古马和鸡等物种类似[3, 10, 25]，牦牛睾丸中不同长度的piRNA首位均表现出明显的U偏好性。在鸡和蒙古马睾丸piRNA形成过程中，倾向于在其5′端的第10位核苷酸上带有腺嘌呤(A)[3, 25]，这与piRNA形成的“乒乓机制”有关[7]，而牦牛睾丸中不同位点piRNA碱基偏好性的分析结果表明，第10位核苷酸上并未明显存在A的偏好性，反而在第3及第5位核苷酸上存在A的偏好性，而第2位核苷酸上存在G的偏好性，这提示在牦牛睾丸中piRNA的加工可能存在新的机制。
在精子发生过程中，细胞的数量、种类、形态及结构均发生剧烈变化，这些过程与细胞代谢密切相关，对不同发育阶段牦牛睾丸中piRNA来源基因进行GO分析，结果显示，大量显著差异表达piRNA的来源基因与细胞内重要物质，如核酸及氨基酸的代谢有关，此外，在与精子发生功能进行关联分析时，绝大部分piRNA来源基因被发现与精子发生的晚期阶段相关，例如精子发生相关蛋白16 (spermatogenesis-associated protein 16，SPATA16)和阳离子通道精子相关蛋白2(cation channel, sperm associated 2，CATSPER2)，前者被发现参与精子顶体的形成和精卵识别有关，在人睾丸中突变会导致圆头精子症[27]，后者定位于精子鞭毛，与精子的运动相关[28]，piRNA来源基因功能的多样性提示其可能在牦牛睾丸精子发生的不同阶段均是不可替代的。
piRNA的来源主要有基因间区的重复序列、长链非编码RNA和mRNA的3′-UTR区域[6]，在绵羊和蒙古马睾丸中，来自基因间区重复序列的piRNA分别占11.81%和18.88%，来源于基因组未知区域的piRNA分别占87.65%和80.54%，而来源于基因区piRNA的数量仅有0.54%和0.58%[3, 26]。而不同发育阶段牦牛睾丸中的piRNA有13.44%来自基因间区的重复序列，21.40%来自基因区，65.15%来自其他区域，与蒙古马和绵羊类似的是，绝大部分piRNA均来自基因组区域之外的其他区域，蒙古马及绵羊中仅有不到1%的piRNA来源于基因区[3, 26]，而在牦牛睾丸中这一比例明显较高。有研究表明，在小鼠睾丸中来自基因区的piRNA与核酸代谢、锌离子结合和基因转录调控相关[29]，GO分析表明，牦牛睾丸piRNA来源基因的数目在生物学过程和分子功能上排在首位的分别为代谢过程和结合，这与文献报道相符，提示在牦牛睾丸中piRNA有可能通过调控细胞代谢和分子结合等方式调控精子发生。
文献报道，在牛胚胎期(4~5个月)睾丸中精原干细胞的含量十分丰富，随着个体出生，精原干细胞开始逐渐分化成其它生殖细胞，其自身数量显著减少[30]，对牦牛胚胎期(4~5个月)、幼年期(1岁)及青年期(3岁)睾丸测序得到的piRNA进行分析表明，幼年期及青年期睾丸中piRNA的数量远远大于胎牛阶段piRNA的数量，胎牛睾丸中超过60%的cluster均处于低丰度(0~0.1 TPM)，而胚后睾丸组织中超过70%的cluster均处于高丰度(>15 TPM)。这与鸡精子发生过程中不同生殖细胞内piRNA的表达模式类似，在鸡睾丸生殖细胞中，精原细胞及精子中新发现的piRNA数量远远大于精原干细胞中新发现的piRNA数量[25]，由此推测，piRNA在精原干细胞向各级生精细胞分化的过程中扮演了重要角色。
PIWI家族与piRNA的功能密切相关[3-5]。对PIWI 家族关键基因(PIWIL1、PIWI2、PIWI3及PIWI4)在3个阶段牦牛睾丸中的表达进行分析，结果表明，PIWIL1在幼年期及青年期牦牛睾丸中的表达显著高于胎牛期，而PIWIL4在幼年期及青年期牦牛睾丸中的表达显著低于胎牛期。在小鼠睾丸中，Piwil1的表达从出生后几天才开始，其表达一直持续至精子形成，而Piwil4的表达始于胚胎期生殖细胞，在出生后几天即消失[22]，推测牦牛睾丸中piRNA可能通过与不同的PIWI蛋白结合而在牦牛精子发生的不同阶段发挥作用。
4 结论本研究对胚胎期(4~5个月胎牛)、幼年期(1岁)及青年期(3岁)牦牛睾丸组织中的piRNA进行高通量测序及分析，并对PIWI 家族的4个基因(PIWIL1~PIWIL4)的表达进行了检测。结果表明，1和3岁龄牦牛睾丸piRNA的数量及表达丰度与胚胎期相比有显著差异，且牦牛睾丸中piRNA的结构、功能和来源与其他畜禽相比具有特异性，PIWIL1和PIWIL4在胚胎期及其他两个时期牦牛睾丸中的表达存在明显差异。本研究结果对进一步探究piRNA调控牦牛睾丸不同阶段，尤其是从胚胎至出生后阶段的发育机制，以及改善牦牛的生产繁殖性能提供了一定的理论基础。
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