癌症是世界上最常见的人类四大死亡原因之一，据国家癌症中心数据显示，近年来中国每年新发癌症病例达429万例，死亡281万例，癌症的防治已成为我国重要公共卫生问题[1]。P53是人类最重要的肿瘤抑制基因，它能够响应细胞内外众多的信号刺激, 通过抑制细胞生长、诱导细胞凋亡、促进DNA损伤修复等过程抑制肿瘤的发生发展[2-3]。P53基因突变几乎在每种类型的肿瘤患者中都会存在，超过一半的肿瘤患者携带有P53的突变位点[4]，其中248、249、273密码子为肝癌、肺癌、乳腺癌和直肠癌等肿瘤患者最常见的突变位点[5-7]。
针对P53基因，科研人员已研制了包括敲除、不同突变位点敲入的数量众多的小鼠模型，且大部分转基因小鼠获得了某一种或数种类型的肿瘤表型[8-9]。猪由于在解剖结构、生理代谢和疾病特征上都与人高度相似，因此被认为是开展人类医学研究理想的动物模型。在家猪领域，针对P53基因点突变转基因模型的研究报道较少。Sieren等[10]研制了携带P53-R167H(对应于人的R175H)位点的克隆猪，获得了淋巴瘤、骨瘤和肾脏瘤表型。Schook等[11]构建了携带有P53-R167H、KRAS-G12D和Loxp序列的转基因猪，并通过表达Cre酶的腺病毒在不同部位获得肿瘤表型。另一项研究中，科研人员也是将P53-R167H和KRAS-G12D导入猪中，获得了肉瘤表型[12]。上述研制的模型猪采用的均是传统的转基因技术，其研制的效率往往较低，且存在外源基因随机插入的问题。最近几年，现代基因组编辑技术发展迅猛，其中特别是CRISPR/Cas9技术，因操作简单、效率高的特点[13]，其应用呈现出井喷的态势[14-18]。在家猪领域，CRISPR/Cas9技术也有长足的发展，取得了丰硕的成果[19-20]。
当前，在猪活体和细胞水平均未见针对P53某个肿瘤相关位点进行编辑的报道。本研究针对猪P53的R241、R242和R266(对应于人的R248、R249和R273)位点，拟利用CRISPR/Cas9技术在PFF细胞中同步编辑成肿瘤相关位点241W、242S和266H，为下一步研制P53基因编辑肿瘤模型猪奠定基础。
1 材料与方法本研究于2017-2018年在江西农业大学省部共建猪遗传改良与养殖技术国家重点实验室完成。
1.1 试验材料及主要试剂 1.1.1 细胞系和质粒大白猪PFF细胞系由江西农业大学省部共建猪遗传改良与养殖技术国家重点实验室建立并保存；PX459 V2.0载体购自Addgene质粒库(# 62988)。
1.1.2 主要试剂Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；反转录和RT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司；大抽质粒试剂盒、DNA提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购自德国QIAGEN公司；T4连接酶和限制性内切酶Bbs I购自美国NEB公司；电转染试剂盒购自德国Lonza公司；细胞培养相关耗材购自美国Corning公司；细胞裂解液胰酶(Trypsin-EDTA solution)、磷酸盐缓冲液(PBS)、高糖DMEM(11995-065)、双抗、胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；Western blotting试剂盒购自上海碧云天公司；Western blotting一抗和二抗购自Abcam公司；DNA连接酶IV抑制剂SCR7购自美国Xcessbio公司；嘌呤霉素购自日本Sigma公司；CCK8试剂盒购自日本同仁化学研究所(Dojindo)。
1.2 试验方法 1.2.1 P53基因打靶载体的构建与引物合成针对猪P53基因(Gene ID: 397276)R241、R242(位于外显子7)和R266(位于外显子8)密码子区域(图 1)，利用在线网站(http://crispr.mit.edu)分别设计sgRNA，选择评分最高的sgRNA序列。sgRNA1序列为：5′-gcatggggggcatgaaccgg-3′，sgRNA2序列为：5′-tctgtgcggcggtctctccc- 3′。利用Bbs I酶切PX459 V2.0质粒后，将两条sgRNAs分别装载入PX459 V2.0载体中，具体步骤详见杨强等[21]的研究。连接产物转化于Trans 5α感受态细胞，经氨苄抗性平板筛选、菌落PCR及测序，最后利用大抽质粒试剂盒提取打靶质粒DNA。菌落PCR反应体系：10× buffer (Mg2+plus) 2.5 μL，25 mmol·L-1 Mg2+ 0.5 μL，10 mmol·L-1dNTP(TaKaRa) 0.5 μL，5× Q-solution(QIAGEN) 5 μL，10 μmol·L-1上游和下游引物各1 μL，5 U·μL-1 r-Taq酶(TaKaRa)0.5 μL，1 μL模板，超纯水13 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；(94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s(-0.5 ℃/循环)，72 ℃ 30 s)26个循环；(94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min)14个循环；72 ℃ 10 min。表 1中T1和T2引物分别用于检测sgRNA1和sgRNA2序列是否与PX459 V2.0质粒正确连接；T3引物用于检测打靶后筛选的单克隆细胞；其它引物用于RT-PCR分析。
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“----”表示SSODN；“*”表示要编辑的位点；“…”表示sgRNAs "----"represent the SSODN; "*" represent the edited mutations; "…"represent the sgRNAs 图 1 sgRNA和SSODN设计示意图 Fig. 1 Schematic diagram showing sgRNA and SSODN |
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表 1 载体构建、打靶验证和RT-PCR引物 Table 1 Primers used for validation of vector construction, targeting and RT-PCR |
通过Integrated DNA Technologies公司(IDT，USA)合成单链寡核苷酸(single-stranded oligodeoxynucleotides，SSODN)1和SSODN2。两条SSODNs的长度均为120 bp，其中SSODN1中将R241改成241W、R242改成242S，SSODN2中将R266改成266H；3个位点均处于SSODN的靠中间位置(图 1)。
1.2.3 细胞转染、筛选及单克隆鉴定复苏原代大白猪PFF细胞，培养液为含10% FBS和1%双抗的高糖DMEM。待细胞汇合度达85%以上时，胰酶消化后收集离心。将PX459-sgRNA1质粒和PX459-sgRNA2质粒各25 μg、SSODN1和SSODN2各15 μg共同电转于收集后的PFF细胞中。电转仪为BTX ECL2000；电转条件：200 V，1 ms，3 pulses，1 repeat。电转后，将细胞接种至10 cm培养皿中，并加入SCR7至终浓度为1 μmol·L-1。培养6 h后更换新的培养液，继续培养30 h后，加入嘌呤霉素至终浓度为3.5 μg·mL-1进行细胞筛选。筛选48 h后收集细胞，利用有限稀释法，按不同的稀释倍数将细胞传代至10 cm培养皿中，培养6~8 d(第4天换液1次)后收集细胞单克隆于24孔板中。待24孔板中细胞的汇合度达95%以上时加入胰酶消化，每孔取出约1/4细胞用于提取基因组DNA，剩余约3/4的细胞置于6孔板中继续培养，长满后收集冻存。PCR检测目标区域的编辑情况(引物对为T3)，PCR扩增体系和反应条件与菌落PCR相一致(详见1.2.1)。将PCR扩增得到的目的片段进行DNA测序，利用SeqMan软件与野生型序列比对，分析单克隆细胞中P53基因的编辑情况。
1.2.4 脱靶效应分析利用在线软件(http://crispr.mit.edu/)设计出sgRNA序列的同时，还针对该sgRNA序列在整个基因组的同源性提供潜在的脱靶位点(off-target sites, OTS)，并按脱靶可能性的高低给予评分。本试验对sgRNA1和sgRNA2分别选择潜在脱靶可能性最高的前10个位点设计引物(表 2)，随机选择2个P53缺失型细胞和2个双位点编辑型细胞，PCR扩增后与野生型细胞扩增样本一起送公司测序，PCR反应体系和扩增循环与“1.2.1”相同，测序结果利用SeqMan软件比对分析。
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表 2 20个潜在脱靶位点检测引物 Table 2 Primers for the detection of 20 potential off-target sites |
利用Trizol法提取3种不同类型细胞(野生型、纯合子缺失型和双位点纯合子编辑型)的总RNA，利用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。以β-actin为内参基因，针对编辑和野生型细胞中P53、MDM2、FAS、WIP1、BAX、P21和DD1α基因开展RT-PCR检测(引物见表 1)。RT-PCR反应体系：SYBR Ⅱ 5 μL，Rox I 0.2 μL，上下游引物各0.2 μL，cDNA模板1 μL(约50 ng)，超纯水3.4 μL。反应条件：94 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。mRNA相对表达量计算采用Livak和Schmittgen[22]的2-ΔΔCt法，利用ABI公司7900 HT Fast Real-Time PCR System实时荧光定量PCR仪开展定量分析。
1.2.6 蛋白提取和Western blotting检测选取2个纯合子缺失型和1个野生型细胞，利用RIPA+PMSF裂解后，通过BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量，加入5 ×蛋白上样缓冲液，煮沸10 min，取40 μg总蛋白用于SDS-PAGE电泳(80 V，20 min后120 V，1.5 h)，电泳后转膜(200 mA，70 min)，PVDF膜于含5%脱脂奶粉的TBST、4 ℃封闭过夜，然后用TBST洗膜3次，针对不同的基因分别加入1:1 000稀释的一抗，室温下孵育3 h；用TBST洗膜3次，之后加入1:10 000稀释的二抗，在室温条件下孵育2 h后用TBST洗膜3次。最后用超敏ECL化学发光显色，使用SYNGENE(Bio-Rad, Μniversal Hood Ⅱ, ΜSA)成像系统扫描分析。采取Image J软件分析条带的积分光密度值。
1.2.7 CCK-8法检测细胞增殖能力将相同代数的编辑细胞和未经打靶试验的野生型细胞，在6孔板中传代后制备细胞悬液，经计数后接种到4个96孔板中培养，每孔的细胞数量为1 000个，37 ℃培养箱中分别培养6、12、24和36 h。本试验设置3个组(每组3个样本)：野生型、纯合子缺失型和双位点纯合子编辑型(241W/242S)；不含细胞的培养液作为空白对照。依据CCK-8试剂盒说明书处理细胞后(每个样本设置3个重复)，最后用全自动酶标仪(TECAN，infinite M200 PRO)测定吸光度。
1.2.8 统计分析采用t-test分析RT-PCR和CCK-8试验数据，P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著；采用GraphPad Prism 5软件作图。
2 结果 2.1 PFF细胞P53基因编辑效率分析本试验共筛选到107个单克隆细胞，经PCR检测、测序分析后发现，分别有4个为两个位点(R241和R242)纯合子和杂合子编辑型(编辑成241W和242S，图 2A)，1个为R266位点编辑型(编辑成266H)、63个纯合子缺失型、11个序列倒置型、11个纯合子点插入型、3个杂合子缺失型(或混合克隆)和10个野生型，未获得3个位点同时被编辑的细胞(表 3)。在63个纯合子缺失型细胞中，10个发生在sgRNA1区域(图 2B)，9个发生在sgRNA2区域(图 2C)，44个为两条sgRNAs之间的大片段缺失(图 2D)；在11个点插入细胞克隆中(4个细胞克隆在sgRNA1和sgRNA2区域同时存在点插入)，7个发生于sgRNA1区域(图 2B)，8个发生于sgRNA2区域(图 2C)。
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A. 241/242位点测序图；B. sgRNA1区域敲除或敲入情况；C. sgRNA2区域敲除或敲入情况；D. sgRNA1与sgRNA2之间的大片段缺失；E.序列倒置。WT.野生型；HZ.杂合子；HO.纯合子。---.碱基缺失；…….省略的序列信息。括号里的数字表示克隆数量。4个单克隆同时包含sgRNA1和sgRNA2区域的点插入 A. Sequence map of 241/242 sites; B. Knockout and knock-in events of sgRNA1 region; C. Knockout and knock-in events of sgRNA2 region; D. Large fragment deletion between sgRNA1 and sgRNA2; E. Sequence inversion. WT. Wild type; HZ. Heterozygote; HO. Homozygote.---. Base deletion; …….Abbreviated sequence information. Digits in brackets indicate the number of clones. Four single clones harbor insertion of point mutations in both sgRNA1 and sgRNA2 regions 图 2 单克隆细胞P53基因编辑位点序列分析结果 Fig. 2 Sequence analysis of P53 editing sites in monoclonal cells |
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表 3 单克隆细胞编辑情况统计 Table 3 Statistics of editing events in monoclonal cells |
针对sgRNA1和sgRNA2各10个潜在脱靶位点的检测表明，在随机选择的4个编辑型细胞中，均未检测到脱靶位点。
2.3 RT-PCR检测P53信号通路中重要基因的表达针对P53基因及其信号通路中6个重要基因的RT-PCR结果表明，在纯合子缺失型细胞中P53基因的表达量几乎为零(图 3A)；在纯合子缺失型和双位点编辑型细胞中FAS、BAX、MDM2和P21基因的表达量极显著降低(P < 0.01或P < 0.001，图 3B)。
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A.纯合子缺失型细胞P53基因的RT-PCR结果；B.编辑型细胞P53信号通路重要基因的表达量。WT.野生型；KO.纯合子缺失型；241W242S.双位点纯合子编辑型。*.差异显著(P < 0.05)；**.差异极显著(P < 0.01)；***.差异极显著(P < 0.001)。下同 A. RT-PCR results of P53 gene in cells carrying homozygous deletion; B. Expression levels of vital genes in P53 signaling pathway in gene editing cells. WT. Wild-type; KO. Homozygous deletion; 241W242S. Homozygous modification of two sites. *.Significant difference(P < 0.05);**. Highly significant difference (P < 0.01); ***. Highly significant difference (P < 0.001).The same as below 图 3 RT-PCR检测结果 Fig. 3 Results of RT-PCR |
Western blotting结果表明(图 4)，在P53纯合子缺失型细胞中，未检测到P53和P21蛋白的表达，在野生型细胞中，P21蛋白的表达量较弱；对于MDM2蛋白，经Image J软件分析条带的积分光密度值(IOD)，两个纯合子缺失型细胞中的IOD值(表达量)分别比野生型细胞下降30.8%和56.9%。
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KO.纯合子缺失型细胞；WT.野生型细胞 KO. Homozygous deletion cells; WT. Wild-type cells 图 4 Western blotting结果 Fig. 4 Western blotting results |
CCK-8试验检测结果表明，在6 h时间点，纯合子缺失型细胞的增殖能力显著高于野生型细胞(P < 0.05)；在其它3个时间点，纯合子缺失型和双位点编辑型细胞的增殖能力显著(P < 0.05，12 h)和极显著(P < 0.01，24 h；P < 0.001，36 h)地高于野生型细胞(图 5)。
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图 5 编辑型与野生型细胞的增殖能力比较分析 Fig. 5 Comparative analysis of cell proliferation capacity among gene edited and WT cells |
基因组编辑技术主要利用同源介导修复(homology-directed repair，HDR)和非同源末端连接(non-homologous ending-joining，NHEJ)机制修复DNA。在两种修复机制中，NHEJ的效率远高于HDR[23-24]。SSODN在CRISPR/Cas9技术中常用作修复模板，其被证明可大幅提高HDR的效率[25-26]。本试验利用两条短的SSODN(均为120 bp)拟将P53基因中相隔约400 bp的3个氨基酸位点同时编辑成与肿瘤发生相关的位点。在收集到的107个单克隆细胞中，有8个克隆的R241/R242位点成功编辑成了241W/242S(其中纯合子和杂合子分别有4个)(图 2A，表 3)；未获得3个位点同时被编辑的单克隆细胞，也仅获得一个R266位点被编辑为266H的单克隆细胞(表 3)。分析其原因，可能是两条sgRNAs的打靶效率不一致或两条SSODNs的HDR效率显著不同所造成的。在本试验刚开展时，从公司订购的SSODN的长度一般不超过120 bp，而这3个位点相距位置大约为400 bp，因此本试验通过两条SSODNs携带241W、242S(位于SSODN1)和266H(位于SSODN2)突变位点，拟通过这两条SSODNs在某些细胞中同时发生HDR修复以同步编辑3个位点，但未能获得成功。随着长SSODN(long SSODN)合成技术的发展[25]，目前可通过long SSODN同时携带3个突变，以实现3个位点的同步编辑。
本试验所采用的CRISPR/Cas9技术体系表现出很高的编辑效率。在筛选到的107个单克隆细胞中，仅有10个为野生型，且在编辑型细胞中，大部分为纯合子编辑型(表 3)。本试验在电转后使细胞恢复36 h，然后在培养液中加入嘌呤霉素(终浓度为3.5 μg·mL-1)筛选48 h，再通过稀释法分离单克隆细胞。由于PX459 V2.0质粒带有嘌呤霉素抗性基因，因此药筛48 h可以将大量未电转入PX459 V2.0质粒的细胞杀死，从而大幅度提高单克隆细胞的编辑效率。虽然本试验的编辑效率很高，但大部分(88个克隆)依然是通过NHEJ修复，属于HDR修复的仅有9个克隆(4个为杂合子)。究其原因，可能是由于在较近的位置同时采用2条sgRNAs，使NHEJ修复效率更占上风。在人基因组中，结构性变异如基因倒置等较普遍存在[27-28]。在本试验中，通过相邻区域两条sgRNAs的指引性切割，获得了11个(10.28%)序列倒置的单克隆细胞；其中7个单克隆细胞的序列精准倒置，另有5个单克隆细胞在序列倒置的同时出现了少数几个碱基的丢失(图 2E)。CRISPR/Cas9技术的脱靶问题是大家所关注的。本试验随机选择4个编辑型细胞，针对sgRNA1和sgRNA2的评分最靠前的10个OTS进行检测，均未检测到脱靶的发生。当然，仅仅检测10个OTS，无法准确地判定脱靶的发生情况。随着全基因组测序(whole genome sequencing，WGS)成本的降低，基于WGS已建立了多种全基因组水平检测脱靶位点的技术，如数字基因组测序(digenome sequencing)等[29]，可以较全面地检测脱靶的发生情况。
在哺乳动物生命体中，P53基因的调控网络颇为复杂，参与其中的基因数量多达数百个[30-31]，其中包括MDM2、FAS、BAX、P21、WIP1和DD1α等重要的功能基因[30, 32-33]。本试验针对获得的P53基因编辑细胞，利用RT-PCR和Western blotting检测了P53和6个调控网络中的重要功能基因(MDM2、FAS、BAX、P21、WIP1和DD1α)的表达情况。结果表明，纯合子敲除型细胞中，未检测到P53蛋白的表达(图 4)，几乎未检测到P53 mRNA的表达(图 3A)，说明成功的敲除了该基因。针对其它6个基因的RT-PCR结果显示，纯合子缺失型和双位点编辑型细胞中FAS、BAX、MDM2和P21基因的表达量极显著降低(P < 0.01或P < 0.001，图 3B)。针对纯合子敲除型细胞中MDM2和P21基因的Western blotting检测显示，未检测到P21蛋白的表达(野生型细胞的表达量也较低)，MDM2的表达量明显下降(图 4)。由于未订购到合适的抗体，本试验未能获得FAS、BAX、WIP1和DD1α蛋白的表达结果。CCK-8检测数据也表明，编辑型细胞的增殖能力显著(P < 0.05)或极显著(P < 0.01或P < 0.001)高于野生型细胞。这些结果表明，编辑P53基因后改变了其信号通路中部分重要功能基因的表达、并显著影响了细胞的增殖。本试验所获得的基因编辑细胞系可用于普通体细胞(非肿瘤细胞)的P53基因调控网络研究；所获得的双位点编辑细胞系为下一步研制P53点编辑模型猪提供了重要素材。
4 结论本试验利用CRISPR/Cas9技术将PFF细胞中P53基因的两个野生型位点编辑成与人肿瘤发生相关的位点，P53基因被编辑后显著影响了其信号通路中部分重要功能基因的表达；本试验为下一步研制P53点编辑模型猪奠定了重要的基础。
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