猪的骨率是中等遗传力性状,可直接影响净肉率,进而影响猪的经济价值。在基因组范围内筛选并深入研究基因组中重要的骨率相关变异,对更快更精确地进行猪的肉质性状分子育种具有重要的理论和实践意义。由于骨率测定比较困难,目前对大群体进行骨率主效基因挖掘的研究相对较少。Andersson-Eklund等[1]在对由野猪和大白猪构建的杂交群体进行研究时,将后腿骨率相关基因定位在了4号染色体88 cM处。Zhang等[2]对包含骨重和骨率在内的22个胴体性状进行了QTL定位,结果未定位到骨率相关座位。覃立立等[3]对长白和蓝塘猪构建的杂交群体进行了6个SNPs的关联分析,最终找到了1个与骨率显著相关的位点。除上述研究之外,猪骨率相关基因的鉴定研究,尤其是基因组范围内对骨率主效基因的挖掘研究基本未见。
研究表明,作为基因组覆盖范围最广的变异之一,拷贝数变异(copy number variations, CNVs)对多种性状都发挥了重要功能,是解释SNP效应之外“丢失的遗传”的最可能变异之一[4]。目前,家养动物上CNV的全基因组关联分析(genome-wied association study,GWAS)研究并不多。Luo等[5]应用鸡SNPs芯片对一个近交系的鸡群进行CNV的GWAS研究,结果发现了鸡马克氏病抗性相关的CNV。Karyadi等[6]在对犬类脚趾鳞状细胞癌的GWAS研究中发现,KIT(v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene homolog)基质基因KITL中存在与脚趾鳞状细胞癌相关的CNVs。刘晨龙等[7]对16个中国地方狗品种的研究中发现了162个与嗅觉活动及感知相关的CNVs。此外,Xu等[8-9]分别利用荷斯坦奶牛和安格斯牛SNPs芯片数据进行GWAS关联研究,发现了与牛奶产量以及牛肠胃线虫抗性相关的CNVs。Durán Aguilar等[10]对乳体细胞评分和拷贝数变异进行关联研究,发现有24个拷贝数变异与乳体细胞评分相关。Zhou等[11]对荷斯坦奶牛饲料利用效率、乳品质以及母牛繁殖力等10个性状进行拷贝数变异关联研究,结果共找到57个与以上性状相关的拷贝数变异。Fowler等[12]应用猪的60K Beadchip SNPs芯片对杜洛克、大白、皮特兰3个猪种进行了背膘性状的GWAS和CNV检测,结果在7号染色体上找到一个与背膘厚性状相关的CNV区域。Wang等[13]利用大白×民猪资源群体鉴定出多个与肉质相关的拷贝数变异。Long等[14]在杜洛克猪中发现了一个位于14号染色体上的CNV与疝气相关。Hay等[15]在660头猪中鉴定出多个与猪蓝耳病相关的拷贝数变异。
本研究拟利用基因组范围内的CNV标记对骨率相关变异进行全基因组关联分析,以期能鉴定到影响猪骨率的主效基因和因果突变位点,为猪的骨率育种提供研究基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料及表型测定试验所用大白猪均来自中国农业科学院北京畜牧兽医研究所昌平种猪场构建的大白猪×民猪F2代资源群体,共计498头F2代个体。F2世代母猪正常饲养,公猪在出生后全部被阉割。整个群体均饲养在中国农业科学院北京畜牧兽医研究所种猪场,饲养条件、饲喂方式和饲料等均始终保持一致。所有F2代个体均饲养至(240±7)日龄时屠宰,并记录宰前活体重。胴体分割之后进行骨肉分离,各部分骨重之和与胴体重的比值即为骨率。
1.2 组织DNA提取及测序采集来自F2代498个个体的耳组织,采用常规的酚仿法提取DNA。用NANODROP 1000测定DNA的浓度与质量(Thermo Scientific, USA),质检合格的样品放于-20 ℃冰箱保存备用。利用Illumina Hi-seq2500进行双末端测序,测序深度为5~7X。
1.3 全基因组CNV检测、分型及骨率相关基因组关联分析利用Wang等[16]编写的CNVcaller软件进行所有个体CNV检测及分型,在分型时,CNVcaller是应用聚类的方法,对所有个体的CNV进行聚类,仿照SNP的分类方法每个CNV区域不超过3种基因型,每个样品标为1.2.3代表该样品所属的基因型聚类。利用TASSEL软件(V5.0)[17]中的混合线性模型(mixed-linear model, MLM),将年和性别作为固定效应,胴体重作为协变量进行基因组关联分析。关联分析模型公式:y=μ+Xb+cw+Za+e。其中,y为性状表型值,μ为群体均值,b为固定效应向量,w为体重协变量,a为随机加性遗传效应向量,c为体重的回归系数,X和Z 是对应固定效应和随机效应的关联矩阵,e为残差。基因组水平显著所选阈值为-lg(0.05/N),其中N为质控后CNV总数。
1.4 全基因组关联CNV内部基因RNA-seq验证采集3头75日龄左右大白猪后腿骨软骨组织样品,采用诺禾致源公司(北京)标准流程进行RNA建库测序,对基因组范围内显著关联的CNV区域周围(1 Mb距离内)的转录本进行定量分析。
1.5 猪骨率显著相关CNVs数据分析将骨率显著相关CNVs区域在Ensembl网站(http://asia.ensembl.org/index.html)上进行位置比对,找到CNVs区域覆盖的所有基因,在GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索其功能,对其内部基因进行功能注释。
2 结果 2.1 猪骨率性状表型分布在498头大白猪×民猪资源群体F2代个体中,(240±7)日龄屠宰体重平均值为109.78 kg。胴体重(左侧)平均值为40.38 kg:最大值为61.2 kg,最小值为21.00 kg,标准差为6.36 kg,变异系数为15.75%。骨率平均值为9.78%,最大值为17.62%,最小值为6.25%,标准差为1.80%,变异系数为18.40%。
2.2 猪基因组拷贝数变异检测及猪骨率基因组关联分析在F2代群体中,共检测到3 027个CNVs(表 1),其中,共有1 251个为缺失,987个为多拷贝,789个为缺失和多拷贝均存在。拷贝数数目在常染色体上的分布相对均匀,与染色体长度基本呈对应关系。CNV总平均长度为15 070 bp,但4、5、15和16号染色体上拷贝数长度偏短。
骨率性状GWAS结果见表 2,GWAS的曼哈顿图见图 1。从表 2中可以看出,同骨率性状显著关联的CNVs共有4个,均位于7号染色体,长度最长为119 200 bp,最短为5 200 bp。
4个区域及其附近转录本表达量结果显示,在CNV1/CNV3覆盖区域内没有检测到相关转录本的表达,仅在CNV2与CNV4内各检测到2个转录本(表 3),对比此CNV外部附近转录本,其表达量明显升高,说明在此时期,基因的表达丰度很高。
2.4 猪骨率相关CNVs覆盖区域的基因功能注释对4个CNVs区域中的基因进行注释(表 2),CNV1与CNV3均位于基因间隔区域,未覆盖任何基因,但是CNV3位于miRNA-133b及miRNA-206附近。CNV2共覆盖6个基因与1个5S_rRNA,本区域基因大部分功能未知。已知功能基因主要与猪主要组织相容性复合体(SLA)相关。CNV4覆盖了骨的骨髓相关分化标记(myeloid associated differentiation marker,MYADM)基因。
3 讨论梁国明等[18]对长(长白)×大(大白)×通(通城猪)和大×长×通群体的胴体性状进行比较时发现,我国地方品种和国外品种相比,猪的骨率,尤其是后腿骨率差异明显。本研究中,虽然F0代个体没有表型数据,但是F2代群体的骨率变异达到了10.11%,说明本群体骨率表型存在较强的分离,但由于F2代群体也会带来标记间的瞬时连锁不平衡,本群体可能造成定位的高假阳性。CNV由于片段较长,多态性高,可以降低这个假阳性。
覃立立等[3]在对猪骨相关ESTs的SNPs关联分析中发现,定位在4q21-23的E53和定位在9p21附近处的E82两个SNPs的不同基因型在骨率上的差异均达到显著水平(P < 0.05),可作为影响猪骨率的重要位点。陈思佳等[19]采用PCR-SSCP方法对位于4号染色体46 731 359~46 767 427 bp位置的线粒体2,4-双烯酰辅酶A还原酶1(DECR1)基因第5外显子的多态性位点与骨率性状的关联性进行了研究,发现GG基因型个体的骨率显著高于CC型个体。Xiong等[20]对猪肌醇磷酸酶(SKIP)基因与骨骼肌发育的关联研究发现,SKIP基因的A17G突变与骨率相关。与以往单基因或者个别位点研究不同,本研究是从全基因组角度研究的重要结构变异——拷贝数变异对骨率的影响,因此未检测到已有研究的结果。
本研究在进行拷贝数检测时应用了CNVcaller软件,本软件的优势在于,其算法克服了在组装质量和结构复杂程度参差不齐的基因组检测CNV时运行时间和错误率增加的问题,可直接用于动植物各种性状的GWAS和QTL分析。由于本研究的测定个体胴体重分布差异较大,因此在进行GWAS分析时,本研究选用了MLM方法,将胴体重作为协变量。在对测定年份和性别进行分析时,本研究发现,不同年份间骨率相差不大,但性别对骨率影响显著,公母个体骨率均值分别为9.90%与9.66%。为更有效剖分可遗传的效应,本研究以测定年和性别作为固定效应。研究同样发现,胴体重与骨率的表型相关为0.432,为中高相关,所以本研究选取了胴体重作为协变量。
本研究共在7号染色体上获得了4个与骨率显著相关的区域,其中两个区域位于基因的间隔区域,RNA-seq结果也显示,两个区域上下游1 Mb范围内均无转录本,二者结果相互印证,但其可能的作用机制尚未可知。
已有研究显示,猪在75日龄左右会有骨骼生长高峰出现,因此,为研究骨率显著相关CNV是否影响其覆盖基因的表达,本研究选取了3头75日龄大白猪的腿软骨进行了基因表达量的分析。研究结果显示,除CNV2外,其它CNVs中基本上无转录本检测出来,产生此种情况的原因可能是CNV1及CNV3没有覆盖任何基因,也可能由于基因表达有其时空特性,CNV1、CNV3、CNV4在此时期并没有表达,其变异与软骨的生长无关。
CNV2区域内基因大部分与主要组织相容性复合体(SLA)相关,已有研究显示,SLA是一个大家族,其参与了多种生物学过程,在骨髓中的表达量也很高[21-22]。Imaeda等[23]的研究表明,SLA-2家族对杜洛克猪的肉质、生长等多个性状有显著作用。Zhang等[24]的研究表明,SLA-11对大白猪的产仔数有一定帮助。朱璟等[25]对苏太猪SLA-DQA多态性研究显示,其可以影响多个经济性状。在本研究中,拷贝数变异区域内的基因(包括SLA)为多拷贝,各转录本的表达丰度很高,推测所检测区域CNV通过剂量效应影响了其内部基因的表达,直接参与软骨生长的过程。
本研究发现的另一显著相关的拷贝数变异CNV4内有个骨髓相关分化标记基因(MYADM),本基因具有多功能性,据报道其与多个性状发育相关。其首先在人的骨髓中被发现,研究显示,其在胚胎期的表达量较高[26],在小鼠胚胎中,其与细胞的迁移与扩散相关[27]。对羊的研究发现,类MYADM重复序列,与红细胞性状及羔羊断奶重显著相关,显示其可能是通过拷贝数来影响性状[28]。在牛上的研究显示,MYADM存在多个拷贝[29]。在人上的研究显示,MYADM不仅与腿骨的发育异常相关,还与人的畸形足早期足骨发育相关[30-31]。在本研究中,MYADM也被检测出有多个拷贝,但是其在骨骼发育高峰期并不表达,推测其在胚胎分化期会像人一样表达量很高,参与骨骼分化的启动。由于没有胚胎期个体RNA-seq数据,其作用机制有待进一步研究。
4 结论本研究通过全基因组关联分析,成功鉴定出影响猪骨率性状的4个CNVs。通过对4个CNVs的分析,确定CNV2和CNV4为影响骨率性状的主效CNV,通过对4个CNVs在75日龄猪后腿软骨中表达量的分析,初步推测,CNV2通过影响其内部基因的表达量影响骨率,CNV4可能在胚胎发育期起调控作用并最终影响骨率。本试验结果为今后骨率性状调控机理的研究奠定了理论基础,为骨率性状的育种提供了参考。
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