雌激素(estrogen)是一种主要由卵巢与胎盘合成与分泌的甾体激素，依赖于ERα、ERβ、GPR30三种受体，参与了包括生殖在内的许多重要生命活动的调控，如免疫、内分泌、心血管、消化等[1-4]。研究发现在中枢[5-6]和外周神经系统[7-8]均有ER表达，并在抑制神经炎性反应及神经退化[9]、促进神经轴突再生[10]、影响神经递质释放[11]、神经保护[12]等方面发挥作用。此外，流行病学调查研究发现女性患肠易激综合征、慢性盆腔痛、间质性膀胱炎等慢性痛疾病的发病率明显高于男性[13-14]。大鼠直肠扩张痛与雌激素密切关联[15]；应用雌激素可抑制卵巢摘除鼠对疼痛的应答反应，产生镇痛作用[16]；雌激素疗法可抑制药物引发的听觉障碍[17]，雄性金鱼睾酮可转化为雌激素通过ERβ受体快速调节视觉处理过程[18]。以上结果表明，雌激素在许多感觉的调节中均具有一定的作用。细胞内Ca2+是广泛存在的第二信使，在神经系统发生、神经元存活、神经递质释放、轴突生长等方面发挥重要作用[19-22]。而背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)是初级感觉神经元胞体聚集的膨大处，研究DRG神经元受体及电生理变化对阐明感觉传导机制具有重要意义。研究发现ER分布于雌性成年大鼠[23]、鸡胚[24]DRG神经元中。大鼠DRG神经元有GPR30反应阳性产物[25]。而在仔兔DRG中尚未有关于ER分布及雌激素对神经元[Ca2+]i影响的研究报道，本试验拟利用细胞免疫荧光染色技术观察原代培养仔兔DRG中ER的分布；利用激光共聚焦显微镜Ca2+成像技术监测不同浓度17β-E2(1、10、100、1 000 nmol·L-1)作用下，体外培养72 h DRG神经元细胞质Ca2+荧光强度的变化，观察雌激素对DRG神经元[Ca2+]i影响，为进一步研究雌激素对感觉传导的神经内分泌调节机制奠定基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 实验动物父母一代购于杨凌玉兔养殖场，在定时定量喂食、自由饮水、温湿度适宜等符合动物福利的环境下适应性饲养一周之后，自繁，随机取0~2 d内的新生仔兔，体重35~50 g。
1.1.2 主要试剂Neurobasal®-A培养基，B-27®-Supplement，购自Gibco公司；L-谷氨酰胺，胰酶，Triton X-100，DAPI染色剂，DAKO抗荧光猝灭封片剂，购自Sigma公司；胎牛血清购自Hyclone公司；β-tubulin Ⅲ单克隆抗体，购自碧云天；驴血清封闭液，小鼠抗ERα单克隆抗体，小鼠抗ERβ单克隆抗体，山羊抗GPR30单克隆抗体，购自Abcam公司；IFKine红色标记驴抗小鼠IgG二抗，Alexa-Flour488偶联的驴抗山羊IgG二抗，购自Jackson公司。17β-E2购于Abcam公司。
1.1.3 17β-E2溶液配制称取0.027 2 g 17β-E2，溶于1 mL DMSO中，配制成100 mmol·L-1的母液。用之前去离子水倍比稀释，工作液浓度分别为1、10、100和1 000 nmol·L-1。
1.2 方法 1.2.1 DRG神经元原代培养与鉴定参照本实验室仔兔DRG神经元原代培养方法[26]，快速分离出仔兔DRG后，充分剪碎；胰酶37 ℃恒温消化20~25 min，期间定时晃动，观察组织消化情况；含10%胎牛血清的Neurobasal®-A培养液终止消化，1 000 r·min-1，离心5 min，弃上清；基础Neurobasal®-A培养液重悬，计算细胞密度，继续离心，弃上清；调整细胞密度至5×105个·mL-1，按需接种至含有被多聚赖氨酸包被玻片的24孔板和激光共聚焦培养皿中；于5% CO2，37 ℃恒温培养箱中孵育，24 h时更换2% B-27 Neurobasal®-A培养液，之后每隔3 d轮流更换基础培养液和2% B-27培养液；镜检，拍照。
神经元爬片随机分两组，第一组参照神经元鉴定基本步骤进行β-tubulin Ⅲ单克隆抗体(稀释倍数为1:300)鉴定；第二组作对照将β-tubulin Ⅲ单克隆抗体更换为PBS。
1.2.2 原代培养DRG神经元中ER分布培养72 h神经元爬片随机分4组，每组3张。
第一组进行ERα免疫荧光染色，步骤：37 ℃ PBS漂洗5 min，4 ℃ 4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗3次，5 min·次-1；0.3% Triton X-100，室温孵育10 min，PBS漂洗3次，5 min·次-1；5%血清室温封闭1 h；弃血清，加入小鼠抗ERα单克隆抗体(稀释倍数为1:200)，4 ℃过夜；次日室温复温30 min，PBS漂洗3次，5 min·次-1；以下步骤开始避光操作，加入IFKine红色标记驴抗小鼠IgG二抗(稀释倍数为1:400)，室温孵育2 h，PBS漂洗3次，5 min·次-1；DAPI(浓度4 μg·mL-1)染核，室温20 min，PBS漂洗3次，5 min·次-1；DAKO封片；荧光显微镜下随机选取视野进行拍照，记录图像信息。
第二组进行ERβ免疫荧光染色，除更换一抗为小鼠抗ERβ单克隆抗体(稀释倍数为1:200)外其余步骤同第一组。
第三组进行GPR30免疫荧光染色，除更换一抗为山羊抗GPR30单克隆抗体(稀释倍数为1:200)，二抗为Alexa-Flour488偶联的驴抗山羊IgG二抗外其余步骤同第一组。
第四组为空白对照组，除更换一抗为PBS外，其余步骤同第一组。
1.2.3 17β-E2对DRG神经元[Ca2+]i的影响 1.2.3.1荧光探针Fluo-3/AM负载：按“1.2.1”中所述方法制备DRG神经元培养体系，取72 h DRG神经元的激光共聚焦培养皿，37 ℃ HBSS清洗，每皿1 mL浓度为4 μmol·L-1的Fluo-3/AM避光孵育40 min，HBSS清洗3次，避光待测。
1.2.3.2激光共聚焦显微镜Ca2+测定：取待测细胞，随机分为5组，每组3皿。
第一组监测1 nmol·L-1 17β-E2对DRG神经元Ca2+荧光强度影响。取待测皿置于激光共聚焦显微镜载物台上，随机选取视野，物镜20×，打开面扫描系统，设置扫描参数：激发波长488 nm，扫描速度8.0 us·Pixel-1，时间间隔5 s，像素1 024×1 024，监测120 s后，加入1 nmol·L-1 17β-E2继续检测5 min，记录Ca2+荧光强度信息，保存。用Andor IQ3软件进行分析，收集数据。给药前所得基线平均Ca2+荧光强度记为F0，给药后的Ca2+荧光强度峰值记为F，DRG神经元内游离Ca2+荧光强度相对变化率用FΔ=(F-F0)/ F0表示，FΔ即反应神经元细胞内[Ca2+]i变化。
第二、三、四组分别监测10、100、1 000 nmol·L-1 17β-E2对DRG神经元Ca2+荧光强度影响，除监测120 s加入的17β-E2更换为相应浓度外，其余步骤同第一组。
第五组作为对照组，更换120 s时加入的17β-E2为0.01% DMSO，其余步骤同第一组。
1.2.4 统计学分析17β-E2作用后DRG神经元FΔ的差异性用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA，LSD)检验，以a=0.05为检验标准，P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有极显著性意义(文中数据用“x±s”表示)。
2 结果 2.1 体外培养DRG神经元鉴定体外培养DRG神经元玻片经细胞免疫荧光染色法染色后，无背景色。β-tubulin Ⅲ阳性反应细胞呈现红色荧光，如图 1所示阳性反应神经元大小不一，细胞体呈现圆形或椭圆形红色荧光，细胞质荧光较强(图 1a)；细胞核较大，荧光较弱或无荧光(图 1b)；神经元突起荧光中等，呈阳性(图 1c)。少量胶质细胞无红色荧光反应，只见较小的蓝色细胞核(图 1d)。利用该培养体系可成功获得DRG神经元。统计发现，在该培养体系中72 h时神经元突起之间便相互交织，建立起神经纤维网络，且只有少量胶质细胞生长在神经元下面，神经元的纯化率达90%以上。因此，本试验中选用体外培养72 h的DRG神经元作为研究对象。
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A. β-tubulin Ⅲ免疫荧光染色(200×)；B. β-tubulin Ⅲ免疫荧光染色与DAPI染核(200×)；a. DRG神经元细胞质；b. DRG神经元细胞核；c.神经突起；d.胶质细胞核 A. β-tubulin Ⅲ immunofluorescence staining(200×); B. Double staining of β-tubulin Ⅲ with DAPI(200×); a. Neurocytoplasm of DRG; b. Nucleus of DRG; c. Neurite; d. Nucleus of glial neuron 图 1 体外培养72 h DRG神经元β-tubulin Ⅲ免疫荧光染色 Figure 1 β-tubulinⅢ immunofluorescence staining of 72 h DRG neurons was cultured in vitro |
对照组免疫荧光结果显示，仔兔DRG原代培养体系中未见阳性反应物质，只见蓝色细胞核(图 2D)。在试验组，ERα、ERβ免疫反应中，亮红色荧光为强阳性，红色荧光为中等阳性，浅红色荧光为弱阳性(图 2A、B)；GPR30免疫反应中，亮绿色为强阳性，绿色荧光为中等阳性，浅绿色为弱阳性(图 2C)。表明，ER免疫荧光染色在仔兔DRG原代培养体系中具有特异性。
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A. ERα在体外培养72 h DRG神经元中的分布；B. ERβ在体外培养72 h DRG神经元中的分布；C. GPR30在体外培养72 h DRG神经元中的分布；D.空白对照组；a.神经元；b.神经元细胞质；c.神经元细胞核；d.神经突起；e.神经胶质细胞 A. Immunofluorescence staining in DRG neurons of ERα; B. Immunofluorescence staining in DRG neurons of ERβ; C. Immunofluorescence staining in DRG neurons of GPR30; D. Control group; a. Neuron; b. Neurocytoplasm; c. Nucleus of neuron; d. Neurite; e. Glial neuron 图 2 三种ER在体外培养72 h DRG神经元中的分布(200×) Figure 2 Three kinds of ER immunofluorescence staining in DRG neurons which cultured 72 h in vitro (200×) |
ERα免疫荧光结果显示，在原代培养仔兔DRG神经元中，45.61%的DRG神经元呈红色或深红色荧光，为ERα阳性反应神经元(图 2A，a)，胞体直径在17.29~42.41 μm，为中小型神经元。其中，31.58%神经元胞体呈红色荧光，为中等阳性；14.04%神经元胞体呈深红色荧光，为强阳性。神经元细胞核红色荧光最亮，为强阳性(图 2A，c)；神经元细胞膜、细胞质呈红色荧光，为中等阳性(图 2A，b)；可见极个别神经突起呈浅红色荧光，为弱阳性反应(图 2A，d)；未见ERα阳性反应的神经胶质细胞，为阴性反应。
2.2.2 ERβ在原代培养仔兔DRG神经元中的分布ERβ免疫荧光结果显示，在原代培养仔兔DRG神经元中，32.39%的DRG神经元呈红色或深红色荧光，为ERβ阳性反应神经元(图 2B，a)。其中，19.72%神经元胞体呈红色荧光，为中等阳性，包括91.30%的胞体直径在17.30~40.87 μm的中小型神经元和8.70%的胞体直径在52.88~53.80 μm的大型神经元；12.68%神经元胞体呈深红色，为强阳性，包括77.78%的胞体直径在18.24~38.32 μm的中小型神经元和22.22%的胞体直径在51.88~52.62 μm的大型神经元。ERβ免疫反应物分布部位与ERα的相似，神经元细胞核为强阳性(图 2B，c)；神经元细胞膜、细胞质为中等阳性(图 2B，b)；可见极个别神经突起呈弱阳性反应(图 2B，d)；神经胶质细胞为阴性。
2.2.3 GPR30在原代培养仔兔DRG神经元中的分布GPR30免疫荧光结果显示，在原代培养仔兔DRG神经元中，39.82%的DRG神经元呈绿色或深绿色荧光，为GPR30阳性反应神经元(图 2C，a)，胞体直径在19.93~39.79 μm，为中小型神经元。其中22.12%神经元胞体呈绿色荧光，为中等阳性；17.70%神经元胞体呈深绿色荧光，为强阳性。神经元细胞膜、细胞质呈亮绿色或绿色荧光，为强阳性或中等阳性(图 2C，b)；神经元细胞核呈浅绿色荧光或空泡状，为弱阳性或阴性(图 2C，c)；神经元之间由呈浅绿色荧光的神经突起联系，为GPR30弱阳性(图 2C，d)；可见个别GPR30弱阳性反应的神经胶质细胞，其细胞核为阴性反应(图 2C，e)。
如上所述，三种ER阳性反应产物均主要表达于神经元中，且在阳性反应神经元数量、大小类型、反应程度及分布部位的差异上均体现出ER在原代培养仔兔DRG神经元分布的“异质性”。
2.3 17β-E2对DRG神经元[Ca2+]i的影响 2.3.1 DRG神经元对17β-E2反应分类未加入17β-E2时细胞内Ca2+荧光强度呈现在一定范围的微弱浮动，当加入17β-E2时细胞群内Ca2+荧光强度变化呈现三种不同反应，即：(1)加入17β-E2后荧光强度突然增亮，为Ca2+荧光变化兴奋型，兴奋型细胞又根据荧光变化强弱分为强兴奋型(图 3a)和弱兴奋型(图 3b)，两者Ca2+相对荧光强度曲线图分别为图 4B、C；(2)加入17β-E2后荧光强度无显著变化，为Ca2+荧光变化不敏感型(图 3c)，Ca2+相对荧光强度曲线如图 4 A；(3)加入17β-E2后荧光强度突然减弱，为Ca2+荧光变化抑制型(图 3d)，Ca2+相对荧光强度曲线如图 4D。
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A.17β-E2加入前扫描所得DRG神经元Ca2+荧光强度；B.17β-E2加入后扫描所得DRG神经元Ca2+荧光强度；a.强兴奋型神经元；b.弱兴奋型神经元；c.不敏感型神经元；d.抑制性神经元 A. The DRG neurons Ca2+ fluorescence intensity was obtained before addition 17β-E2; B. The DRG neurons Ca2+ fluorescence intensity was obtained after addition 17β-E2; a. Strongly excited neurons; b. Weakly excited neurons; c. Insensitive neurons; d. Inhibitory neuron 图 3 17β-E2加入前后扫描所得DRG神经元Ca2+荧光强度 Figure 3 The DRG neurons Ca2+ fluorescence intensity was obtained before and after addition 17β-E2 |
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A.不敏感型；B.弱兴奋型；C.强兴奋型；D.抑制型 A. Insensitive type; B. Weakly excited type; C. Strongly excited type; D. Inhibitory type 图 4 17β-E2作用后DRG神经元Ca2+相对荧光强度曲线类型 Figure 4 The types of relative curve of Ca2+ fluorescence intensity of neurons were caused by 17β-E2 |
统计发现，与对照组(0.005±0.002)相比，兴奋型(0.062±0.009)、抑制型细胞(0.039±0.007)FΔ差异极显著(P < 0.01)，不敏感型细胞(0.005±0.001)FΔ无显著性差异(见图 5A)。兴奋型细胞根据FΔ大小分为强兴奋型(0.195±0.118)和弱兴奋型(0.032±0.003)，两者FΔ具有极显著性差异(P < 0.01)(见图 5C)，该分类具有统计学意义。表现出17β-E2对不同DRG神经元Ca2+荧光强度产生不同影响。
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A.不同类型神经元FΔ差异性比较；B.不同浓度17β-E2引起的不同类型神经元比例分布；C.强兴奋型与弱兴奋型细胞FΔ差异性比较；D.不同浓度17β-E2引起的强兴奋型与弱兴奋型神经元在兴奋型神经元中比例变化。**. P < 0.01 A. Comparison the difference of FΔ of different types neurons; B. The proportion of different types of neurons caused by different concentrations of 17β-E2; C. Comparison the difference of FΔ between the strongly excited neurons and the weakly excited neurons; D. The proportion of strongly excited and weakly excited neurons in the excitatory neurons was observed in different concentrations of 17β-E2.**.P < 0.01 图 5 FΔ相关分析 Figure 5 Correlation analysis of FΔ |
按以上所述分类情况对试验组神经元内Ca2+荧光强度相对变化率进行统计发现，同一浓度中不同类型细胞所占比例差异极显著(P < 0.01)，但不同浓度组之间同种反应类型细胞所占比例无显著性差异，表现为兴奋型(19.28±0.70)%、不敏感型(77.17±1.48)%、抑制型(3.54±0.02)% (见图 5B)。其中，直接抑制型所占比例最少，不敏感型神经元最多。
此外，在兴奋型神经元中，强兴奋型与弱兴奋型所占比例如表 1：在17β-E2浓度为1 nmol·L-1时，强兴奋型神经元比例为29.41%，之后随着浓度增大强兴奋型神经元比例逐渐减低，至1 000 nmol·L-1时降低为5.56%。可发现随着17β-E2浓度的增大强兴奋型细胞所占比例逐渐下降，弱兴奋型所占比例逐渐增加(图 5D)。而如前所述兴奋型神经元总比例各浓度组之间无显著性变化。说明，随着17β-E2浓度的增大对强兴奋型DRG神经元内[Ca2+]i增大具有抑制作用，但又非完全抑制，只是抑制了细胞内[Ca2+]i增大的程度。
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表 1 同浓度17β-E2作用后兴奋型神经元中强兴奋型与弱兴奋型所占比例 Table 1 The proportion of strongly excited and weakly excited neurons in the excitatory neurons was observed in different concentrations of 17β-E2 |
如上所述，体外培养仔兔DRG神经元Ca2+对17β-E2呈现三种不同的反应类型，其中大部分为不敏感型神经元，直接抑制型神经元最少，强兴奋型神经元随17β-E2浓度增大对细胞内[Ca2+]i增大具有抑制作用。
3 讨论雌激素是一种甾体类激素，以雌二醇为主，主要由卵巢、胎盘等合成。此外，神经系统中也有少量的合成与分泌。研究发现，在中枢和外周神经，均有ER的分布，且具有影响神经发生、神经元存活、突触联系、神经递质释放等作用[10-12]。DRG是初级感觉神经元胞体聚集的膨大处，在躯体-内脏感觉信息的产生和传递中发挥重要作用。流行病学调查研究发现，女性肠易激综合征的痛感症状比男性更严重，生活质量严重下降[27]，绝经后雌激素水平下降会导致女性外阴触压敏感性降低[28]。以上结果表明，雌激素在部分感觉中发挥着不同程度的调节作用。Sohrabji等[29]利用原位杂交、Northern blot技术发现在卵巢摘除和正常大鼠DRG神经元中均有ER分布。Taleghany等[23]利用原位杂交、细胞免疫荧光染色、RT-PCR技术发现ERβ广泛分布于大鼠的DRG神经元中，而ERα多分布于小型神经元上，大型神经元上几乎没有。采用免疫组织化学技术发现在鸡胚DRG中随着孵化时间的增加ER在鸡胚DRG细胞质和细胞核中表达增多[24]。这表明，初级感觉神经元中存在接受雌激素作用的条件。本试验在原代培养仔兔DRG神经元中发现三种ER分布的神经元数量、神经元类型、表达强度、分布部位均体现出明显“异质性”。与以往的研究结果相似的是，本论文的结果表明，在原代培养仔兔DRG神经元中存在雌激素作用的物质基础。此外，ER在DRG神经元中分布的“异质性”可能为解释上述雌激素对部分感觉发挥着不同程度的调节作用提供了形态学基础。同时也提示，雌激素可通过影响部分初级感觉神经元的活动而实现对相应靶器官感觉活动的间接调节作用。
研究发现，在卵巢摘除鼠中雌激素可通过降低DRG神经元中P物质以及增加降钙素基因相关肽的分泌，抑制热觉、痛觉过敏[16]，表明雌激素可通过影响DRG神经元中神经肽的释放，而实现对靶器官感觉的间接调节作用？那么雌激素对靶器官感觉活动的影响除了此作用机制外，是否还存在其他的作用机制。作为细胞内第二信使，正常状态下细胞内[Ca2+]i较细胞外而言维持很低的稳态水平，当细胞受到外界刺激时，可引起[Ca2+]i急剧变化，从而发挥传递细胞外信号、调节细胞功能的作用。而DRG神经元受到外界刺激时，细胞内[Ca2+]i变化水平直接影响着疼痛阈值[22]。Lee等[30]利用全细胞膜片钳技术在鼠DRG神经元中发现雌激素可通过抑制高电压门控的钙通道引起神经元内[Ca2+]i降低，但雌激素在痛觉调节过程中表现出复杂的调节作用。如在小鼠中发现雌激素可显著减少芥子油介导的腹痛行为，产生止痛作用[31]。在ERα、ERβ基因敲除C57小鼠中，通过应用特异性受体激动剂发现ERα、ERβ参与疼痛的传递和调控过程，并且产生一定的镇痛作用[32]。雌激素疗法可抑制子宫内膜异位症模型鼠的痛感[33]。以上资料表明，雌激素可产生一定的止痛作用。但调查研究发现，女性患肠易激综合征、慢性盆腔痛、间质性膀胱炎等慢性痛疾病敏感性高于男性，且与雌激素有关[13-14]。而Lee等[30]研究结果报道了雌激素抑制高电压门控的Ca2+通道而降低细胞内[Ca2+]i不能用于充分解释这一复杂调节现象。本论文发现Ca2+通路是雌激素作用于少部分DRG神经元的机制之一，且有兴奋和抑制两种反应类型；此外，雌激素通过两种方式对DRG神经元Ca2+通路调节产生抑制作用，一是直接抑制少部分DRG神经元Ca2+通路效应，二是随雌激素浓度增大可减弱强兴奋型神经元[Ca2+]i升高激活的效应。前述结果提示，雌激素可能影响少部分DRG神经元Ca2+活动进而对相应靶器官感觉产生复杂的调节。与Lee等[30]研究结果不完全相同可能是由于使用不同的实验动物、细胞培养方法、刺激方案或监测技术等造成的。但本论文的结果中系统地体现了雌激素对DRG神经元Ca2+活动影响的复杂性，也许能够为解释雌激素对感觉的复杂调节作用提供电生理学基础。
4 结论三种ER在原代培养DRG神经元中均呈现强阳性、中等阳性、弱阳性、阴性的不同表达，其中ERα、ERβ在部分神经元细胞核中为强阳性或阳性，GPR30在部分神经元细胞质、细胞膜中为强阳性或阳性。提示DRG神经元具有接受雌激素作用的物质基础，其对不同神经元的作用不同。DRG神经元Ca2+通路对17β-E2呈现兴奋型、抑制型、不敏感型三种反应类型，且各浓度不同反应类型神经元比例未发生明显变化。但在兴奋型神经元中，随浓度增大抑制强兴奋型神经元[Ca2+]i增加。雌激素对DRG神经元Ca2+通路的复杂调节可能是雌激素在感觉中产生复杂调节作用的机制之一。
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