抗生素作为治疗细菌感染性疾病的主要药物，在畜牧养殖生产上做出了巨大的贡献，然而，抗生素大规模、高剂量的使用也产生了诸多安全性问题，例如畜禽内源性感染和二重感染，耐药性菌株的产生和动物机体免疫力下降。欧盟于2006年1月1日起已全面禁止畜牧行业中抗生素生长促进剂的使用，我国对抗生素使用的要求也日益严格。
对仔猪而言，由于其肠道发育还不健全, 皮下脂肪少, 体温调节能力差，代谢机能旺盛，极易受到营养及外部环境等诸多因素的影响，产生以腹泻、生长停滞等为标志的“仔猪早期断奶综合征”。而断奶应激还会导致仔猪肠道菌群的紊乱，乳酸菌等有益菌数量的减少，大肠杆菌等病原菌数量的上升，因此如何在限用甚至禁用抗生素后维持断奶仔猪肠道稳态，提高断奶仔猪的免疫功能和抗应激能力成为目前重要研究课题。
丁酸梭菌(Clostridium butyricum)又名酪酸菌，是我国农业部于2009年7月批准的新一代微生物饲料添加剂。研究报道，丁酸梭菌能改善动物肠道微生态环境，增强机体免疫功能，尤其对治疗由肠道菌群紊乱引起的炎症、急慢性腹泻、肠应激综合征等疾病效果显著[1-3]。其主要代谢产物丁酸被认为是大肠上皮细胞的主要供能物质[4]，在维持动物肠道健康和机体能量代谢过程中发挥重要作用[5-12]，但目前关于丁酸梭菌对断奶仔猪生长性能、抗氧化能力、免疫功能影响的报道较少。因此，本试验通过在仔猪日粮中添加不同浓度的丁酸梭菌来探讨其对断奶仔猪生长性能、抗氧化能力和免疫功能的影响，为丁酸梭菌在动物生产中的应用提供依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料丁酸梭菌制剂由浙江惠嘉生物科技有限公司提供，有效活菌数为5×109 CFU·g-1。
1.2 试验动物与饲养管理选用180头初始体重为(8.07±0.84)kg的杜×长×大三元杂交仔猪，公母各半，按照完全随机区组分为5组，每组6个重复，每个重复6头猪。试验分为阴性对照组，饲喂不含抗生素的基础日粮；抗生素组，在基础日粮中添加75 mg·kg-1金霉素；丁酸梭菌组，分别在基础日粮中添加0.02‰、0.02%、0.1%的丁酸梭菌制剂，使得日粮中丁酸梭菌有效活菌数分别为1.0×108CFU·kg-1、1.0×109 CFU·kg-1、5.0×109 CFU·kg-1。日粮参考NRC(2012)[13]和中国饲料成分与营养价值进行配制，其基础日粮组成及营养水平见表 1。试验仔猪分栏饲养，饲养于1.5 m×2.1 m的圈内，漏缝喷塑地板，不锈钢可调式料槽，乳头式饮水器。粉料饲喂，自由采食和饮水。
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表 1 基础日粮组成和营养水平 Table 1 Composition and nutrient levels of basal diet |
试验开始后第0、14和28天早晨对每头仔猪进行逐一称重，数据用于计算平均日增重(average daily gain，ADG)；以重复(圈)为单位记录耗料量，试验第14、28天结料称重，数据用于计算平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)；以重复(圈)为单位，计算ADFI与ADG比值，结果表示为饲料转化率(feed conversion ratio，FCR)。每圈具体的计算公式：
| $ \ \ \ \ 平均日增重\left( \text{g} \right)=\left( 平均末重-平均初始重 \right)/\\ 天数；\\ \ \ \ \ 平均日采食量\left( \text{g} \right)=\left( 总投料量-剩料量 \right)/\left( 天\\ 数\times 当圈头数 \right)；\\ \ \ \ \ 饲料转化率=平均日采食量/平均日增重。\\ $ |
从试验期开始，每天早晨8:00点，下午15:00点，观察仔猪的腹泻状况，及时记录。仔猪是否腹泻主要以观察动物个体行为状态(如，尾部沾染湿粪便、拉稀、肛门红肿和脱水等外在表征)与圈舍漏粪板上的稀便痕迹为主。具体计算公式：
| $ \ \ \ \ 每圈腹泻率\left( \text{%} \right)=\sum{\left( 腹泻仔猪数\times 腹泻天\\ 数 \right)/} \left( 圈总猪数\times 总天数 \right)。\\ $ |
试验期间，为了判断奶仔猪腹泻的严重程度，每天进行粪便评分。粪便评分标准参照Pierce等[14]所使用的方法，即：1=硬便；2=轻微软便；3=部分成型的软便；4=松散，半液体的粪便；5=水样黏液型粪便。
1.6 血清免疫功能和抗氧化能力的测定试验第28天早晨从每个重复中各选1头健康、体重接近平均水平的仔猪进行前腔静脉采血5~7 mL，室温静置2 h，4 ℃下3 000 r·min-1离心15 min，取上清液分装于1.5 mL Eppendorf管中，置于-20 ℃低温冰箱中保存。依照相应商品试剂盒(北京华英生物技术研究所，北京，中国)的说明测定血清中免疫球蛋白A、免疫球蛋白G、免疫球蛋白M、肿瘤坏死因子-α、白介素-1β、白介素-4、白介素-6、超氧化物歧化酶活性、总抗氧化能力、谷胱甘肽过氧化物酶活性和丙二醛的含量。
1.7 数据分析数据采用SPSS 23.0统计软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，并且对不同丁酸梭菌添加量的3组结果进行线性和二次模型的分析。P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。
2 结果 2.1 丁酸梭菌对断奶仔猪生长性能的影响如表 2所示，本试验中各处理组猪的生长性能均较好，平均日增重约430 g。1~14 d、15~28 d以及1~28 d日粮中添加不同浓度的丁酸梭菌对断奶仔猪平均日增重、平均日采食量和耗料增重比均无显著影响(P＞0.05)。
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表 2 丁酸梭菌对断奶仔猪生长性能的影响 Table 2 Effects of Clostridium butyricum on growth performance of weaned piglets |
如表 3所示，各处理之间断奶仔猪的腹泻率差异不显著(P＞0.05)。1~14 d和1~28 d不同添加剂量丁酸梭菌处理组的腹泻率随添加剂量的上升呈线性显著增加(P＜0.05)。15~28 d和1~28 d各处理之间断奶仔猪粪便评分差异显著(P＜0.05)。
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表 3 丁酸梭菌对断奶仔猪腹泻的影响(n=36) Table 3 Effects of Clostridium butyricum on diarrhea of weaned piglets(n=36) |
丁酸梭菌对断奶仔猪血清抗氧化特征指标的影响如表 4所示。与基础日粮组相比，日粮中添加5.0×109 CFU·kg-1的丁酸梭菌可以显著提高断奶仔猪血清中谷胱甘肽过氧化物酶的含量和总抗氧化能力(P＜0.05)，达到和抗生素组相近的水平。与基础日粮组相比，日粮中添加1×109 CFU·kg-1和5.0×109 CFU·kg-1的丁酸梭菌均显著提高断奶仔猪血清中总超氧化物歧化酶的含量(P＜0.05)；并且断奶仔猪血清中的总超氧化物歧化酶水平随丁酸梭菌添加量的增加呈线性显著提高(P＜0.05)。相比于基础日粮组，丁酸梭菌处理组断奶仔猪血清中MDA的含量无显著变化(P＞0.05)。
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表 4 丁酸梭菌对断奶仔猪血清抗氧化能力的影响 Table 4 Effects of Clostridium butyricum on serum antioxidant capacity of weaned piglets |
如表 5所示，各处理组随着丁酸梭菌添加量的增加仔猪血清IgG的含量有上升的趋势(P＜0.10)。与基础日粮组相比，日粮中添加5.0×109 CFU·kg-1的丁酸梭菌可以显著降低仔猪血清中TNF-α(P＜0.05)和IL-6(P＜0.01)的含量，显著提高血清中IL-4含量(P＜0.01)，并且断奶仔猪血清中的IL-4含量随丁酸梭菌添加量的增加呈线性显著提高(P＜0.05)。各处理组仔猪血清中白细胞介素-1β含量无显著差异(P＞0.05)。
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表 5 丁酸梭菌对断奶仔猪血清免疫指标的影响 Table 5 Effects of Clostridium butyricum on serum immune parameters of weaned piglets |
目前，丁酸梭菌对动物生长性能和腹泻率的影响已有一些报道。王保正等[15]报道，在哺乳仔猪饲料中添加丁酸梭菌，可显著提高仔猪断奶时料重比，提高育成率及断奶后的生长性能。Liao等[1]研究表明，添加不同剂量的丁酸梭菌能显著提高1~21日龄肉鸡的平均日增重，达到抗生素组水平。Zhao等[16]发现，饲料中添加丁酸梭菌不仅可以显著提高肉鸡平均日增重和平均日采食量，还可加速肉鸡脂肪沉积。然而，Zhang等[17]、Amerah等[18]报道，日粮中添加丁酸梭菌制剂对动物生长性能的提高无显著影响。
在本试验中，1~14 d，与基础日粮组相比，日粮中添加1.0×108CFU·kg-1、1.0×109 CFU·kg-1和5.0×109 CFU·kg-1丁酸梭菌的试验组，其平均日增重分别提高了3.8%、4.0%和6.6%；15~28 d，各组平均日增重没有明显差异，但采用丁酸梭菌替代抗生素后，可以减轻仔猪肝代谢抗生素的负担，有利于仔猪后期生长优势的体现。
仔猪断奶时肠道形态结构尚不完整，肠道细胞分殖、成熟程度尚不完善，因此，仔猪对饲料的消化和营养的吸收过程中容易产生生理性或病理性的障碍。而丁酸梭菌在动物肠道内产生对宿主健康具有重要生理意义的多种代谢产物，包括蛋白酶、淀粉酶、乙酸、丁酸等[19-21]。且丁酸是肠道上皮细胞首选能源底物，对维持动物肠道结构的完整性和促进肠道细胞增殖与成熟起到重要的作用[22]。丁酸还可以促进胰腺分泌、增强空肠刷状缘酶活性，刺激胰高血糖素样肽-2的生成，从而提高肠道对营养物质的消化吸收[23-24]。在试验后期，断奶仔猪肠道形态结构已发育成型，肠道微生物群落已定植完全并稳定，因此，丁酸梭菌的添加对其生长性能无明显影响。
3.2 日粮添加丁酸梭菌对断奶仔猪腹泻率的影响胡远亮[25]发现，在断奶仔猪日粮中添加0.5× 108~ 5.0×108 CFU·kg-1丁酸梭菌可显著降低其腹泻率。在本试验中，日粮中添加1.0×108 CFU·kg-1丁酸梭菌与阴性对照组相比，腹泻率在1~14 d、15~28 d分别下降了45%、54%；在1~14 d、1~28 d仔猪腹泻率随着丁酸梭菌添加量的增加呈线性显著上升。分析原因可能是试验早期断奶仔猪肠道微生物群落尚未稳定，菌群种类和丰度均处于不断演化的过程，大量摄入外源性丁酸梭菌对其肠道原有微生物群落产生冲击，从而引发仔猪腹泻率显著上升。而在试验后期，15~28 d，仔猪肠道微生物群落已稳定，因此腹泻率下降，且各处理差异不显著。
3.3 丁酸梭菌对断奶仔猪血清抗氧化能力的影响正常生理状态下，动物体内自由基的生成和抗氧化防御系统处于动态平衡中，当动物处于病理或应激状态时，机体会大量产生羟基自由基等对机体有害的氧化物。谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物酶在机体清理过氧化物，减少羟基自由基形成的过程中发挥重要作用。血清中总抗氧化能力是衡量机体抗氧化能力的综合指标，丙二醛含量的高低显示了机体中自由基介导的脂质过氧化程度。目前已有研究报道，丁酸梭菌不仅可以代谢产生丁酸和氢气，更会产生超氧化物歧化酶、还原型辅酶Ⅰ、Ⅱ过氧化物酶，帮助机体清除羟自由基和活性氧，起到抗氧化的作用[26-29]。
贾聪慧等[30]报道，日粮添加丁酸梭菌可显著增强肉鸡血清中谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性，且随日龄增加，丁酸梭菌的促进作用比抗生素更加明显和稳定。Liao等[1]研究表明，添加丁酸梭菌对21日龄肉鸡血清超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活力没有显著影响，但显著增加了还原型谷胱甘肽、谷胱甘肽S-转移酶的活性。
本试验中，与基础日粮组相比，日粮添加5.0×109 CFU·kg-1丁酸梭菌试验组显著提高了断奶仔猪血清中谷胱甘肽过氧化物酶的含量和总抗氧化能力。日粮添加1.0×109 CFU·kg-1和5.0×109 CFU·kg-1丁酸梭菌可显著增加断奶仔猪血清中超氧化物歧化酶的含量，并且超氧化物歧化酶的含量随丁酸梭菌添加量的增加呈线性显著上升。
3.4 丁酸梭菌对断奶仔猪血清免疫指标的影响免疫球蛋白是动物机体内免疫系统的重要组成部分，其中IgG是免疫球蛋白的主要成分，约占血清中免疫球蛋白总浓度的75%[31]。本试验中，仔猪饲喂添加丁酸梭菌的日粮后，其血清IgG的含量有上升的趋势，而血清中IgA、IgM的含量未发生显著变化。Yang等[32]研究表明，日粮添加2×107CFU·kg-1和3×107CFU·kg-1的丁酸梭菌能显著提高14~42日龄岭南黄羽肉鸡血清中IgA、IgG的含量；并且血清中IgM含量也在21~42日龄时显著升高。贾聪慧等[30]研究发现，添加丁酸梭菌显著提高了肉鸡血清中IgA、IgG、IgM的含量，其中IgG含量的提高比例最高。
TNF-α是机体中一种重要的细胞因子，在表达黏附分子、成纤维增殖因子、凝血因子以及启动细胞毒性、凋亡和急性期反应等过程中发挥作用。IL-6是一种免疫调节细胞因子，在炎症反应中启动了细胞表面信号复合体发挥作用。IL-4是一种抗炎因子，通过刺激B细胞和T细胞发挥免疫抑制效应。另外，李玉鹏等[33]发现，日粮中丁酸梭菌的添加，降低了断奶仔猪血清中IL-1β的含量，提高了IL-10的含量。高权新[34]试验表明，丁酸梭菌显著提高了IL-10和热休克蛋白70的表达量，进而增强了肠道黏膜的免疫耐受力。在本试验中，与基础日粮组相比，日粮中添加5.0×109 CFU·kg-1的丁酸梭菌可以显著降低仔猪血清中TNF-α和IL-6含量(P＜0.05)，显著提高血清中IL-4含量(P＜0.05)，并且断奶仔猪血清IL-4含量随丁酸梭菌添加量的增加呈线性显著增加(P＜0.05)，结果表明，日粮中添加5.0×109 CFU·kg-1丁酸梭菌可以有效的增强仔猪机体的免疫力，从而降低炎症的发生。
4 结论本试验结果表明，日粮中添加1×109~ 5.0×109 CFU·kg-1丁酸梭菌可以提高断奶仔猪抗氧化能力和免疫功能，有助于提高仔猪断奶阶段的健康水平和抗应激能力。
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