马的毛色是根据覆盖马全身的短毛以及鬃毛、鬣毛、尾毛和距毛的颜色来综合评定^[1]。马的毛色是马品种鉴定的重要参考之一，如荷兰的弗里斯兰马，其纯种马极少具有除黑毛以外的其他杂色毛，在进行血统登记时仅允许前额有小星。另外马的毛色还与马的用途、营养健康状况、性格及行为有关^[2]。在现代马场马术用马交易中，毛色较好的马匹其价格也相应会高不少。当马作为宠物和游乐场用马，特殊的毛色更能够得到消费者的喜爱，从而给马主带来更好的效益。马的毛色形成主要与酪氨酸源性色素有关，其代表是黑色素及其衍生物^[3]。黑色素主要包括真黑色素和褐黑色素两大类，黑色素的种类和含量不同，动物毛发的颜色也会不同，真黑色素和褐黑色素比例决定了毛色的深浅程度^[4]。多种基因调控黑色素的产生，外界环境对黑色素的产生也具有明显影响^[5]。黑色素皮质素受体1(melanocortin 1 receptor，MC1R)基因是控制黑色素形成的主要基因之一^[6]。MC1R在哺乳动物中由E位点(extension locus)编码，是黑色素皮质受体(melanocortin receptors，MCRs)家族成员之一。MC1R只有一个编码区，是编码G蛋白耦合受体中最小的，是具有7个跨膜结构域的蛋白质^[7]。马MC1R基因位于3号染色体，全长1 721 bp，外显子长954 bp，编码317个氨基酸。

本研究采用DNA测序和PCR-RFLP方法对马的MC1R基因多态位点进行检测，并进行毛色相关性分析，为马毛色育种提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验动物

本研究从山东青岛、广西柳州和南宁共6个马场，随机采集10种毛色(分别为黑毛、骝毛、栗毛、白毛、青毛、黑毛白花、骝毛白花、栗毛白花、斑毛、沙毛)涉及15个品种共132匹马颈静脉血，血样于-80 ℃条件下保存。

所采集样本中单色毛共有88匹马，复色共有44匹马，比例较大的4种毛色依次是骝毛(48匹)、栗毛(28匹)、青毛(24匹)和骝白花毛(13匹)(表 1)。

1.2 主要器材及试剂

医用一次性真空抗凝(EDTA)采血管购于江苏宇力医疗器械有限公司；Ex Taq Ⅰ购于NEB(北京)有限公司；金牌Mix(green)PCR预混液购于北京擎科生物科技有限公司；全血基因组DNA提取试剂盒购于北京艾德莱生物科技有限公司。

1.3 试验方法 1.3.1 全血基因组DNA的提取

按照全血基因组DNA提取试剂盒试验说明提取马全血基因组DNA，并溶于DNA溶解液中，用紫外分光光度仪检测全部样本DNA溶液纯度(OD_{260 nm}/OD_{280 nm}=1.8~2.0)和浓度，测得样本均能够满足试验要求，－4 ℃保存备用。

1.3.2 引物的设计与合成

根据GenBank公布的家马MC1R基因序列(GenBank登录号：AF288357.1)，设计两对引物扩增MC1R序列，Primer 1引物扩增片段包含现有文献报道的c.C248T和c.G250A突变位点，Primer 2引物扩增片段包含MC1R的完整外显子。引物Primer 1和Primer 2均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见表 2。

1.3.3 PCR扩增、PCR-RFLP及测序

Primer 1 PCR反应体系(50 μL)：45 μL金牌Mix，Primer 1上、下游引物各2 μL，DNA模板1 μL。反应条件：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性15 s，67 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，35个循环；最后72 ℃延伸3 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，电压120 V，时间为30 min，凝胶成像仪拍照。将PCR扩增产物送至昆明擎科生物科技有限公司进行测序。采用DNASTAR.Laser-gene v7.1软件的SeqMan工具对测序结果进行拼接，BLAST比对，并分析其多态性。

Primer 2 PCR反应体系B(25 μL)：22 μL金牌Mix，Primer 2上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL。反应条件：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性15 s，68 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，35个循环；最后72 ℃延伸3 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，电压为120 V，时间为30 min，凝胶成像仪拍照。

RFLP:利用限制性内切酶Taq Ⅰ消化Primer 2的PCR扩增产物，酶切体系：PCR产物5 μL，内切酶Taq Ⅰ 0.5 μL，buffer 2 μL，ddH₂O 12.5 μL，65 ℃ 30 min。酶切产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，电压140 V，时间20 min，凝胶成像仪拍照。

1.3.4 试验数据分析

应用Excel、SPSS分别对试验数据进行基因型及等位基因频率、X²和P值计算，根据Hardy-Weinberg定律假设：基因型CC个体数量为n1，频率为P1；基因型Cc个体数量为n2，频率为P2；基因型cc个体数量为n3，频率为P3。等位基因C频率为p，等位基因c频率为q。p²+q²+2pq=1。那么，X²=$\sum {\frac{{{{\left( {A - T} \right)}^2}}}{T} = \frac{{{{\left( {n1 - m1} \right)}^2}}}{{m1}} + \frac{{{{\left( {n2 - m2} \right)}^2}}}{{m2}} + \frac{{{{\left( {n3 - m3} \right)}^2}}}{{m3}}} $，其中，X²为卡方值，A为试验样本频率，T为预期频率。n1、n2和n3分别表示试验中各基因型频率，m1、m2和m3分别为各基因型的预期频率。

从NCBI GenBank数据库中得到公开数据，登录号为驴KJ126713，斑马JF718957，普氏野马JF718951，家马AF288357，亚洲貘JF718949，苏门答腊犀牛JF718943，牛BTU39469，印度水牛KR869113，骆驼KU179868，羊驼EU220010，山羊FM212940，绵羊KF198511，野猪AY916521，家猪KF242528，家兔FN658679，大猩猩AY205088，智人AY225228。应用软件MEGA 5用相邻连接方法(NJ，neighbor joining)建立MC1R系统发育树。

本研究所用主要分析软件和网站：PCR引物设计软件为Oligo 6；同源性分析软件为DNAstar；凝胶成像图像处理软件为Image Lab；预测蛋白结构三维图像网站为https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/；蛋白结构三维图像分析处理软件为PyMOL；蛋白结构预测网站为https://swissmodel.expasy.org/, http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/，https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html，https://web.expasy.org/protscale/。

2 结果 2.1 马MC1R基因CDS扩增与测序分析

使用Primer1引物扩增试验样本的MC1R基因序列，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物(图 1)，结果显示，1 200~2 000 bp之间有一条清晰的特异性条带，与预期扩增片段长度(1 247 bp)一致，符合后续试验的要求。

对132匹马MC1R基因的PCR扩增产物进行双向测序分析发现，马MC1R基因CDS存在两处错义突变c.C248T和c.G250A，一处同义突变c.G102A。其中c.C248T由TCC突变为TTC，造成第83位氨基酸由极性亲水丝氨酸变为非极性疏水苯丙氨酸，该突变导致MC1R基因出现EE、Ee和ee 3种基因型(图 2 A、2B和2C)。错义突变c.G250A由GAC突变为AAC，其位点由天冬氨酸变为天冬酰胺，该突变导致出现MC1R基因型ee^a，测序峰图结果见图 2D。图 2E为c.102野生型测序峰图，图 2F为同义突变c.G102A的测序峰图。

2.2 MC1R基因c.C248T位点的PCR-RFLP分型验证

测序分析发现，MC1R基因在外显子发生的c.C248T突变产生了Taq Ⅰ酶切位点，因此可依据酶切试验对马MC1R基因的c.C248T位点的基因分型进行验证。设计特异性引物Primer 2扩增获得试验样本的MC1R基因片段，通过2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果显示，700~900 bp之间有一条清晰的特异性条带，与预期扩增片段(740 bp)长度一致。对PCR产物进行Taq Ⅰ酶切，通过2%琼脂糖凝胶电泳得到3种基因型(图 3)。本试验结果显示，样本中EE基因型有31个，Ee基因型有66个，ee基因型有35个，与CDS测序结果不一致，经分析发现，在出现c.G250A后，不再构成Taq Ⅰ酶切位点，因此17、82和102号3匹马样本DNA的PCR扩增片段在PCR-RFLP试验中不能全部被Taq Ⅰ酶切开(图 4)。

2.3 马MC1R基因多态性与毛色相关性分析

根据测序统计132匹样本基因型与毛色比例，Ee基因型的样本数量最多，有63匹，基因型EE和ee的样本数量相差不大，分别为31和35匹。骝毛马、黑毛马和骝白花毛马的基因型为EE和Ee两种。青毛马、白毛马在EE、Ee和ee 3种基因型中都有分布。栗毛马和栗白花毛马只有ee基因型；黑白花毛马只有EE基因型；沙毛马只有Ee基因型。另外，基因型ee^a包括2匹栗毛马和1匹青毛马。由此可知，在生产中若想获得栗毛马，其父母必须均携带MC1R等位基因e；如果其父母均不是栗毛且从未生产过栗毛后代，则需要对其基因型进行鉴定，而两匹栗毛马的后代在不发生基因突变的情况下一定是栗毛马。为进一步比较分析，我们下载增加了Rieder等^[8]和Wagner和Reissmann^[9]、李蓓和芒来^[10]等研究者公开发表的与本研究相关的数据后进行整合统计分析(表 3)。通过对MC1R基因外显子c.C248T位点产生的基因型和等位基因频率的分析，X²适合性检验结果表明，黑毛和骝毛马的基因型分布差异极显著(P < 0.01)，在遗传上出现了Hardy-Weinberg不平衡，E为优势等位基因；在栗色马中未检测到E等位基因，e为优势等位基因；青毛马的该位点处于Hardy-Weinberg平衡；其他毛色数据量较小，未做进一步分析；各毛色合计分析，在遗传上处于Hardy-Weinberg平衡，且等位基因频率相当。

2.4 马MC1R基因蛋白结构预测与分析 2.4.1 马MC1R基因蛋白二级结构预测

通过在线网站预测马MC1R基因编码蛋白的氨基酸亲、疏水性和二级结构等蛋白基本信息，根据预测结果绘制得到马MC1R蛋白二维结构图，发现马的MC1R基因编码蛋白突变位点主要位于第2个跨膜结构域，靠近细胞膜内侧(图 5)。

2.4.2 马MC1R基因c.C248T突变结构预测分析

通过软件处理预测同源模型后得到MC1R蛋白α螺旋细节图(图 6)，因MC1R基因外显子发生c.C248T错义突变导致MC1R第83位氨基酸由极性亲水氨基酸变为非极性疏水氨基酸(pro.S83F)，疏水作用力发生改变；发生突变后，与第83位氨基酸有氢键作用的氨基酸数量和位置发生变化，其与周边氨基酸之间作用的氢键减少一个，即该处突变导致其与第三跨膜区的第127位氨基酸丝氨酸之间的氢键消失，致使与其作用的氢键只分布在本跨膜区。由此可以推测，该处突变可能导致第一跨膜区与第三跨膜区距离发生变化，影响MC1R蛋白整体结构，从而使MC1R蛋白功能受到影响；另外，该处蛋白α螺旋结构维持力量的减弱，可能致使α螺旋结构较之前松散，处于该突变之前的α螺旋结构位置改变，有可能部分突出细胞膜进入细胞内，从而引起MC1R蛋白功能发生变化。

2.4.3 马MC1R基因c.G250A突变结构预测分析

在马MC1R的CDS测序结果中发现，有3个样本在c.C248T的基础上，在第250 bp处发生错义突变，由GAC变为AAC，该突变导致MC1R第84位氨基酸由极性带负电荷的天冬氨酸变为极性不带电荷的天冬酰胺(pro.D84N)。通过PyMOL处理预测同源模型后得到MC1R蛋白α螺旋细节图(图 7)，在第84位氨基酸发生突变后，与其相作用的氨基酸位置发生变化，新增了3个氢键分别作用在第一跨膜区的第56位氨基酸和第7跨膜区的第294位氨基酸；另外，在发生突变后，离子键作用力也发生了改变，侧链由原来倾向于排列在蛋白质表层与水发生反应变为中性氨基酸，不带电荷。

2.4.4 马MC1R蛋白pro.S83F、pro.D84N突变结构综合预测分析

将MC1R蛋白野生型和pro.S83F、pro.D84N一起对比后发现，在出现pro.D84N后，第83、84位氨基酸与周围氨基酸作用的氢键数量增加，氨基酸之间作用力复杂，与只出现pro.S83F相比较，与第三跨膜区的第127位氨基酸丝氨酸之间的氢键又出现，并且还增加了与第一跨膜区和第7跨膜区之间的作用(图 8)。可以推测，该处突变在新增的3个氢键的作用力下，有可能会缩小pro.S83F对MC1R蛋白整体结构的影响。

2.5 MC1R基因系统发育树分析

MC1R在许多物种中有同源基因，从NCBI GenBank中选取17个哺乳物种的MC1R编码序列和试验测序所得的3种基因型EE(33号国产改良马)、基因型ee(112号西南马)和基因型ee^a(82号国产改良马)的MC1R序列进行比较，用相邻连接方法(NJ，neighbor joining)建立MC1R系统发生树(phylogenetic tree，图 9)。由图 11可发现，试验样本中基因型EE个体与家马、普氏野马相似性最高，而样本基因型为ee和ee^a则与之相似性低一些。

3 讨论

本试验采用PCR-RFLP和DNA克隆技术研究了马MC1R基因与毛色表型性状的相关性，结果显示，马MC1R基因CDS 248和250 bp两处发生非同义突变。在PCR-RFLP试验中，由于MC1R基因CDS 250 bp处发生非同义突变，造成该c.C248T酶切试验呈现假阴性结果，与Wagner和Reissmann^[9]的报道相符。对马MC1R多态性与马毛色表型做统计分析得出，黑毛和骝毛马具有EE和Ee两种基因型，栗毛马有ee和ee^a两种基因型，青毛马有EE、Ee、ee和ee^a 4种基因型。花马是在原有底色上出现了白色斑块^[11-12]，因而MC1R基因型与其底色相同。该结果对马的毛色分子育种提供了理论依据，对现代马的毛色定向繁育具有重要指导意义。

维持蛋白质三级结构的非共价作用力主要有氨基酸的疏水作用、离子键、氢键、范得华力^[13]。疏水作用力是蛋白与蛋白之间的主要作用力，影响蛋白之间的距离，在蛋白质分子的表面还往往有凹槽，这种地方多是配体或酶的底物结合的部位，通常就是疏水区。离子键是氨基酸侧链在生理pH条件下解离成带电荷的基团，与介质水分子发生电荷-偶极之间的相互作用，形成排列有序的水化层，从而稳定蛋白质的构象。蛋白质α螺旋则主要靠链内氢键作用力维持。在离子键与疏水作用力存在的情况下，范德华力作用相对较弱^[14]。因此，氢键和疏水作用对蛋白结构的影响较大。MC1R基因外显子248 bp处突变位点位于MC1R蛋白第二转运膜的功能区域，推测可能导致α螺旋结构和各跨膜区相对位置发生变化。从而影响到受体配对和转移等功能，使受体细胞内cAMP浓度降低，而cAMP能够激活酪氨酸激酶促成络氨酸酶的合成，该突变能够导致酪氨酸酶的合成减少，从而使更多的酪氨酸产物多巴醌(DQ)变为Cys-DOPA，即褐黑色素合成增多，真黑色素合成减少，从而形成栗色毛色表型^[15-18]。

250 bp处突变位点使MC1R蛋白第83、84位氨基酸与周围氨基酸的作用力加强，增加了因248 bp处突变而消失的氢键，因此可能缩小了248 bp突变对MC1R蛋白结构的影响，因此推测，该基因型的马毛色可能比基因型ee的马毛色加深，这也同Wagner和Reissmann^[9]的推测一致。在本试验中，未对发生G250A突变样本个体的MC1R产生真黑素、褐黑素通路中相关产物表达量进行研究，无法证明此推测。但是样本中含有数个深栗色马基因样本，测序结果显示并无c.G250A突变。另外，本研究中的一例栗毛西南马基因型为ee，与党珍等^[19]研究发现的中国马品种中栗毛马基因型的试验结果不同。

根据GenBank公布的MC1R基因的多态位点进行统计，在现公布的2 257个多态位点中人类所占比例最多，其次是牛、羊和小鼠，马的则具有高度的保守性，只有2处多态位点。MC1R第二转运膜区为受体的关键区域，人、牛、小鼠、猫等哺乳动物的毛色扩展位点也位于此处^[20-23]。KIT、ASIP基因对毛色表型也有决定性作用^[24]，青毛马的毛色与STX17和KIT有关^[25-26]，PAX3、MITF与马的白色及白色面积、分布有关^[27]，TBX3对马褐毛和非褐毛的形成具有影响^[28]。另外，不同毛色马个体之间的遗传背景不同，马所处的生活环境也会影响基因型的表型度和外显率，可能导致相同的基因型可以产生不同的毛色表型。因此，马的品种、体重、性别、生活环境以及样本采集范围的局限性差异增加了相关分析的复杂性。

近年来，关于马的毛色与马其他性状相关性的研究不断深入，Hauswirth等^[29]发现，有飞溅白毛的马在听力、视觉上有缺陷。Stachurska等^[30]对多种毛色的纯血马及阿拉伯马进行了QTL研究，发现马的亮毛色与E位点有相关性，他还发现，在毛色与运动能力无显著关联的情况下，人们更喜欢繁育骝毛与栗毛马^[31]。2016年Jacobs等^[32]最新研究发现，毛色影响马的行为与性格。在马术运动日益发展的形势下，马的毛色与其性能及性格的相关性影响着马的育种观念，这方面的研究将越来越得到人们的重视并成为马毛色研究的新方向。

本研究中，基因型EE样本与家马、普氏野马相似性最高，而样本基因型为ee和ee^a则与之相似性低一些。

在进化过程中，马在第四纪更新世时期最先出现的毛色主要是骝色，到公元前5000年以后出现黑毛马，直到公元前2000年左右才出现了毛色更绚丽的栗毛、Tobiano和Sabino毛色的马，因此在进化史上，栗毛的112号和82马比基因型为EE的骝毛马在基因进化树上与家马、普氏野马都同源性低些。其次与样本同源性较高的是斑马和驴，在经典分类学上，马与斑马、驴组成马属动物，而驴与斑马关系更近些。马属动物与亚洲貘、苏门答腊犀牛共同组成奇蹄目，与系统发育树显示内容相吻合。

4 结论

本研究采用PCR-RFLP和DNA克隆技术研究了马MC1R基因与毛色表型性状的相关性，发现马MC1R基因外显子存在3个SNPs，c.G102A为同义突变，错义突变c.C248T产生等位基因e，错义突变c.G250A产生等位基因e^a。骝毛马、黑毛马和骝毛白花毛马均有基因型EE、Ee。青毛马、白毛马均有基因型EE、Ee、ee。栗毛马和栗毛白花马只有ee基因型；黑白花毛马只有EE基因型；沙毛马只有Ee基因型。黑毛和骝毛马中，E为优势等位基因；在栗色马中无E基因，e为优势等位基因基因。本研究结果表明，马MC1R多态位点产生的不同基因型与马的毛色存在相关性。本研究结果为应用基因型对马的毛色进行定向选择育种奠定了基础。