2. 中国农业科学院 兰州兽医研究所 家畜疫病病原微生物学 口蹄疫流行病学国家重点实验室, 兰州 730046
2. State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology, National Foot and Mouth Disease Reference Laboratory, Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730046, China
口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)是一种单股正链RNA病毒,能引起牛、猪等多种偶蹄动物发生口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)[1]。临床主要表现为患病动物的口、唇和蹄等部位出现水泡或烂斑。发病率达100%,死亡率低(可引起幼畜较高的死亡率),但可造成动物生产能力下降,肉质受损,且严重影响种用价值。FMDV基因组包含5′非编码区(UTR)、一个完整的开放阅读框(ORF)和一个带有Poly(A)尾巴的3′UTR。ORF编码一个多聚蛋白,随后被切割成至少13个蛋白,例如VP1、VP2、VP3、VP4、先导蛋白酶(Lpro)、2A、2B、3A、3B1、3B2、3B3、3Cpro和3Dpro[2-3]。病毒衣壳是由VP1、VP2、VP3和VP4四个结构蛋白各60个分子构成,其中VP1、VP2和VP3作为病毒衣壳的亚单位,主要构成病毒衣壳的外表面。VP4与RNA紧密连接,与FMDV衣壳的内部结构有关,VP0是VP2和VP4的前体蛋白,其结构中,VP4位于VP2氨基末端的延伸部位。前期研究表明FMDV蛋白可以调控干扰素的产生,例如,Lpro能抑制poly(I:C)诱导IFN-λ1的启动子活性;3Cpro通过影响IRF-3/7的活性来拮抗IFN-α1/β的启动子激活[4]。VP1与宿主蛋白可溶性耐药相关钙结合蛋白(soluble resistance-related calcium-binding protein, Sorcin)发生互作抑制Ⅰ型干扰素的产生[5]。VP3通过降解VISA抑制IFN-β的活性[4]。那么是否有宿主蛋白与FMDV蛋白互作通过天然免疫途径调控FMDV增殖?本研究发现宿主蛋白PCBP2能与FMDV VP0互作,并通过天然免疫途经调节FMDV增殖。
天然免疫在保护宿主不被病原体入侵中起到关键性作用。Ⅰ型干扰素中IFN-α和IFN-β是先天抗病毒应答的核心成员。主要有两类模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)识别病原相关分子模式(pathogens-associated molecular patterns, PAMPs),分别为Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)和RIG-Ⅰ样受体(RIG-Ⅰ like receptors, RLRs)[6-8]。RIG-Ⅰ和黑色素瘤分化相关基因5(melanoma differentiation-associated protein, MDA5)作为胞质传感器,能检测到细胞质中RNA病毒(例如仙台病毒SeV和新城疫病毒NDV等)[9]。在RLRs介导的抗病毒应答过程中,入侵细胞内的病毒分子主要被RIG-Ⅰ和MDA5识别,并招募下游位于线粒体的接头蛋白VISA(也称作IPS-1、CARDIF和MAVS)[10]来激活下游通路[11]。随后,VISA通过激活蛋白激酶TBK1磷酸化修饰转录因子IRF3,使其形成二聚体,进入细胞核中[12-13]。活化的转录因子IRF3入核后结合到IFNB1基因启动子的干扰素刺激反应元件ISRE位点,诱导IFNs和多种ISGs因子的产生,并在其他效应因子的协同下发挥抗病毒功能。
多聚胞嘧啶结合蛋白2[poly(rC) binding protein 2, PCBP2]是一种在人类和小鼠中广泛表达的宿主蛋白,不仅参与RNA的复制和翻译[14],也参与到蛋白之间的相互作用[15-17]。有研究报道PCBP2能与VISA特异性结合,进而抑制细胞中RIG-Ⅰ通路的抗病毒感染应答;过表达PCBP2可特异性引起VISA蛋白的降解从而抑制IFN-β的产生[18]。尽管PCBP2通过特异性降解VISA来抑制RIG-Ⅰ通路的抗病毒免疫反应,抑制细胞中IFN-β启动子活性,进而增强病毒在细胞中的活性[18],但是PCBP2与FMDV蛋白通过天然免疫来调控FMDV增殖的机制还不清楚。作者利用免疫共沉淀试验、GST pull-down试验、双荧光素酶报告系统试验和Western blot试验对此进行了研究。
1 材料与方法 1.1 材料pcDNA3.1/myc-HisA载体由本实验室保存。pcDNA3.1-myc-PCBP2质粒、HA-PCBP2质粒和带Flag标签的且被克隆在PCAGGS载体上的各口蹄疫蛋白质粒,均由本实验室构建保存,且测序鉴定为正确。双荧光素酶报告系统所需质粒,仙台病毒(Sendai virus, SeV)以及带HA标签的VISA质粒由武汉大学舒红兵院士馈赠。鼠抗Flag、HA、Myc单克隆抗体购于Sigma公司。兔抗VISA多克隆抗体购自BETHYL公司。兔抗GST多克隆抗体和鼠抗β-actin单克隆抗体购自Thermo公司。HRP标记的山羊抗鼠IgG二抗和抗兔IgG二抗均购自Santa Cruz公司。人源胚胎肾细胞系HEK293T用含10%灭活胎牛血清(FBS, Gibco)的DMEM培养基(Gibco)在37 ℃、5%CO2温箱中培养。
1.2 免疫共沉淀和蛋白印迹HEK293T细胞培养在10 cm培养皿中,待生长为90%左右的单层细胞时,将FMDV VP0、VP2、L、2B、2C、3A、3C和3D分别与PCBP2质粒共同转染HEK293T细胞。24 h后弃掉培养基,加入NP-40裂解液[50 mmol·L-1 Tris (pH 8.0), 150 mmol·L-1 NaCl, 5 mmol·L-1 EDTA, 1%NP-40, 2 mg·mL-1 aprotinin, 2 mg·mL-1 leupeptin, 1 mmol·L-1 phenylmethanesulfonyl fluoride],冰上孵育30 min并收集液体,12 000 r·min-1离心10 min。取适量上清加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液,煮沸10 min后离心,进行Western blot试验;将剩余上清平分,加入IgG抗体和Flag或HA抗体,再加入G蛋白琼脂糖珠(Sigma),用裂解液补至1 mL,4 ℃旋转摇床孵育3 h。用裂解液清洗树脂3次,SDS-PAGE裂解煮沸,进行Western blot。
Western blot试验方法,将质粒转入培养好的细胞,24 h后收样并处理,煮沸10 min后12 000 r·min-1离心10 min。将处理好的样品加入蛋白胶孔,跑至底部,用浸泡过甲醇的PVDF膜转膜。将转好的膜用5%的脱脂奶粉封闭30 min,之后加入一抗4 ℃摇床过夜,回收抗体,洗三次,加入二抗,洗三次,随后曝光。
1.3 双荧光素酶报告试验将HEK293T细胞培养于24孔板,待细胞生长至70%左右,将IFN-β-Luc/ISRE-Luc报告质粒、PRL-TK内参质粒以及PCBP2三种质粒共同转入细胞,用空载体确保每一个孔接收相同的质粒。24 h后用SeV(100 HAU·mL-1)进行接毒试验,12 h后处理细胞,用双荧光素酶报告基因试剂盒(Promega)照其说明书进行试验。
1.4 GST pull-down试验首先取80 μL GST树脂于EP管中,10% BSA封闭,于4 ℃旋转摇床孵育4~6 h。然后加入TIF buffer(1.0 mmol·L-1 MgCl2, 20 mmol·L-1 Tris (pH 8.0), 0.1% Nonidet P-40, 150 mmol·L-1 NaCl, 10% glycerol, 0.1 mmol·L-1 DTT)清洗树脂六次。在封闭好的树脂中分别加入纯化的GST和GST融合蛋白,用TIF buffer补液,于4 ℃旋转摇床孵育2.5 h后清洗树脂,然后在树脂中加入表达有目的质粒的HEK293T细胞裂解液,于4 ℃旋转摇床孵育4~6 h,清洗树脂,加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液,煮沸处理,进行Western blot试验。
1.5 数据分析使用单因素方差分析法进行统计学分析(数据为三次独立试验的平均值)。差异显著性用“*”表示(*. P < 0.05,**. P < 0.01,***. P < 0.001)
2 结果 2.1 鉴定与PCBP2发生互作的FMDV蛋白为了验证PCBP2与哪些口蹄疫病毒蛋白有相互作用,将FMDV VP0、VP2、L、2B、2C、3A、3C和3D分别与PCBP2表达质粒共同转染,免疫共沉淀试验显示PCBP2与FMDV的VP2、2B、L、VP0、2C和3D有相互作用(图 1a、b)。进一步用GST pull-down试验证实PCBP2与FMDV的VP0、VP2、2B、2C和3D有相互作用(图 1c、d)。
为了探究猪源PCBP2是否对Ⅰ型干扰素通路有影响,首先将HEK293T细胞铺于24孔细胞板,每组样品设置4个重复,16 h后将重组质粒Myc-PCBP2、100 ng IFN-β-Luc/ISRE-Luc报告质粒、20 ng PRL-TK内参质粒三种质粒共同转染HEK293T细胞,用相应空载体确保每一个孔细胞接收相同质粒,24 h后用SeV刺激4个重复中的2个重复,剩下2个重复不做接毒处理,12 h后收集样品进行双荧光素酶报告系统检测。结果表明,猪源PCBP2抑制IFN-β和ISRE的活性(图 2a、b)。
进一步将不同剂量Myc-PCBP2(0、0.3、0.6、1.2 μg)与100 ng IFN-β-Luc/ISRE-Luc报告质粒、20 ng PRL-TK内参质粒以及HA-VISA(0、2.5 ng)质粒共同转染HEK293T细胞,24 h后进行双荧光素酶报告系统检测。结果表明,猪源PCBP2抑制VISA诱导的IFN-β和ISRE的活性(图 2c、d)。
2.3 FMDV蛋白2C、3D、VP0、2B增加了猪源PCBP2对IFN-β启动子活性的抑制作用为了探索哪些FMDV蛋白影响PCBP2负调控VISA介导的细胞信号通路。将FMDV蛋白L、VP2、2C、3D、VP0、2B(均100 ng)分别与Myc-PCBP2(500 ng)、100 ng IFN-β-Luc报告质粒、20 ng PRL-TK内参质粒以及2.5 ng HA-VISA质粒共同转染HEK293T细胞,双荧光素酶报告系统试验证明,2C、3D、VP0、2B蛋白促进PCBP2对IFN-β的抑制作用(图 3)。
为了验证哪些FMDV蛋白促进PCBP2降解VISA,将FMDV 2C、3D、VP0和2B蛋白(600 ng)分别与猪源PCBP2(1 μg)、VISA(800 ng)共转染,Western blot试验显示FMDV VP0和3D促进PCBP2特异性降解外源VISA(图 4a~d)。进一步试验表明,只有VP0促进PCBP2对内源VISA的特异性降解(图 4e、f)。
口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种急性、接触性传染的动物疫病,是国家乃至全球经济贸易的最大羁绊。由于FMDV广泛的宿主范围,高效的变异频率[19-20],从而有利于FMDV逃避宿主免疫监视,建立持续性感染[21]。宿主细胞作为FMDV生命活动载体,在其生活周期中,发现有多种宿主细胞蛋白参与其中。由于FMDV是一种RNA病毒,这些细胞蛋白里有一部分是RNA结合蛋白(RNA binding protein, RBP),例如多聚嘧啶结合蛋白(PTB)[22]、La自身抗原(La autoantigen)[23]、核糖体40S亚基(40S ribosomal subunit)[24]、突触结合胞质RNA相互作用蛋白(NSAP1)[25-26]以及核不均一核糖核蛋白(hnRNP)[27]等,而PCBP2细胞蛋白是属于特异性结合RNA胞嘧啶富集片段的HnRNP[28-30]。已有研究报道PCBP2能够调控细胞的免疫应答反应[18],促进FMDV的增殖[31],那么阐明PCBP2在FMDV引起免疫抑制中的分子机制,则有利于对FMD进行有效的防控提供科学依据。本文首先验证出与PCBP2发生互作的FMDV蛋白(VP2、2B、VP0、2C、3D)。接着阐明PCBP2负调控细胞的免疫应答。将互作蛋白分别与PCBP2共转染,双荧光素酶报告试验初步证实2C、3D、VP0和2B进一步抑制IFN-β的产生。据文献报告,PCBP2能够通过E3泛素连接酶AIP4泛素化降解VISA,以达到对细胞免疫应答的负调控作用[32],随后将2C、3D、VP0和2B分别与PCBP2共转染,Western blot试验检测内、外源VISA的降解情况。结果表明,VP0和PCBP2共转染能增加VISA的降解,从而减少免疫应答中IFN-β的产生,增强FMDV在宿主细胞中的活性。前言中提到VP3也能降解VISA,抑制IFN-β的产生,但VP3是通过影响VISA的RNA水平达到降解VISA蛋白的目的,抑制细胞的免疫应答;而VP0对VISA转录水平的影响将在后续试验中进行,目前推测VP0可能通过泛素化途径直接或间接降解VISA,以达到对IFN-β启动子活性的抑制,促进FMDV的增殖,这些猜想还需要进一步验证。对于VP0、PCBP2和VISA三者之间的具体关系,也需要我们继续深入研究下去。
4 结论PCBP2能够与FMDV蛋白VP0、VP2、2B、2C和3D发生相互作用,且负调控Ⅰ型干扰素产生的信号通路,同时PCBP2能特异性降解VISA并呈剂量依赖效应;双荧光素酶报告试验证实VP0、2B、2C和3D蛋白可以促进PCBP2对IFN-β启动子活性的抑制作用,其中只有VP0蛋白能协助PCBP2进一步引起VISA的特异性降解。由此可知,PCBP2通过与FMDV VP0蛋白相互作用,引起通路蛋白VISA的进一步降解,导致宿主细胞中IFN-β分泌减少,从而保护FMDV在细胞中的繁殖和生长。
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