表 1(Table 1)
图 1(Figure 1)
山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化过程中内参基因的表达稳定性分析
引用本文
许晴, 林森, 朱江江, 王永, 林亚秋. 山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化过程中内参基因的表达稳定性分析[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(5): 907-918.
XU Qing,
LIN Sen,
ZHU Jiang-jiang,
WANG Yong,
LIN Ya-qiu.
The Expression Stability Analysis of Reference Genes in the Process of Goat Intramuscular Preadipocytes Differentiation in Goat[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2018, 49(5): 907-918.
山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化过程中内参基因的表达稳定性分析
1. 西南民族大学生命科学与技术学院, 成都 610041;
2. 青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室, 成都 610041
2. 青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室, 成都 610041
摘要：旨在通过比较9个内参基因在山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化不同时期的表达水平进而最终确定适合山羊肌内前体脂肪细胞分化调控研究最佳的内参基因。本研究利用胶原酶消化法获得山羊肌内前体脂肪细胞，并以分别诱导0、1、2、3、5和6 d的细胞为研究对象，利用荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR，qPCR）技术和geNorm、NormFinder和BestKeeper程序来检测和分析9个候选内参基因（GAPDH、PPIA、18S rRNA、PPIB、UXT、RPLP0、ACTB、EIF3K和TBP）表达的稳定性，并以KLF3和KLF12的实际表达水平进行校正分析。geNorm和NormFinder程序分析表明，UXT稳定性相对最好；而BestKeeper程序分析发现，PPIB表达相对最平稳；3种软件分析结果均表明，同时使用UXT和PPIB可以准确校正在山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化不同时期目标基因的表达；通过对KLF3和KLF12表达量的分析发现，选用筛选结果中最稳定（UXT和PPIB、UXT）和最不稳定（EIF3K和18S rRNA）的内参基因进行归一化分析结果有差异。在山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化过程中，UXT基因是适合于山羊肌内前体脂肪细胞的成脂诱导分化研究最稳定有效的内参基因，同时使用UXT和PPIB作为内参基因能够获得更加精确的目标基因表达结果，这为后续山羊前体脂肪细胞分化调控相关基因的功能研究奠定了基础。
关键词：山羊 肌内前体脂肪细胞 内参基因 实时荧光定量PCR
The Expression Stability Analysis of Reference Genes in the Process of Goat Intramuscular Preadipocytes Differentiation in Goat
1. College of Life Science and Technology, Southwest Minzu University, Chengdu 610041, China;
2. Key Laboratory of Sichuan Province for Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Exploitation, Chengdu 610041, China
2. Key Laboratory of Sichuan Province for Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Exploitation, Chengdu 610041, China
Abstract: The aim of this study was to determine the most suitable reference genes in different periods of goat intramuscular preadipocytes differentiation in goat by comparing the expression levels of 9 candidate reference genes. The intramuscular preadipocytes of goat were obtained by collagenase digestion technique. The adipocytes induced for 0, 1, 2, 3, 5 and 6 d were used in this study. The expression levels of the 9 candidate reference genes (GAPDH, PPIA, 18S rRNA, PPIB, UXT, RPLP0, ACTB, EIF3K and TBP) were detected by real-time quantitative PCR (qPCR), and the expression stability was evaluated by geNorm, NormFinder and BestKeeper programs, individually. Meanwhile, the suitability of the selected reference genes for normalization was further assessed by the expression of KLF3 and KLF12. The results showed that UXT was identified as the most suitable reference gene by both geNorm and NormFinder analysis, while the PPIB was identified as the most suitable reference gene by BestKeeper analysis. The combined use of UXT and PPIB as the reference genes resulted in the optimal selection for normalization of analyzed genes in different periods of intramuscular preadipocytes differentiation in goat based on the analysis of geNorm, NormFinder and BestKeeper; Furthermore, the expression levels of KLF3 and KLF12 normalized by the most stable reference genes (UXT and PPIB, UXT) were significantly different from that normalized by the least stable ones (EIF3K, 18S rRNA). In conclusion, the expression of UXT was the most stable and it was the most suitable reference genes during the differentiation of goat intramuscular preadipocyte in goat, meanwhile the combined use of UXT and PPIB was found to lead to a more accurate result for target genes normalization. These results provided a foundation for functional research of genes related to preadipocytes differentiation in goats.
Key words:
goat
intramuscular preadipocytes
reference gene
real-time quantitative PCR
肌内脂肪(Intramuscular fat，IMF)是影响肉质嫩度和风味的重要因素[1]，是肉用畜禽重要经济性状之一。IMF沉积受多种因素调控，其中主要是由脂肪细胞数目的增加和体积的增大造成的。因此，为了阐明山羊肌内脂肪沉积的分子机理，需以体外培养的前体脂肪细胞为研究对象，利用分子生物学和细胞生物学等技术手段来构建其分子调控网络。为了确保研究的准确性，必须选择可靠有效的内参基因校正，才能得到真实可靠的目标基因表达变化情况。研究表明，同一内参基因在不同物种[2]、不同细胞[3-4]、同一物种不同组织[5]以及不同试验处理[6]等条件下其表达稳定性不同，所以内参不合适会导致数据分析时结果出现差异，对有效内参基因的筛选是保证科学研究准确性的重要前提。
目前虽然在反刍动物上关于内参基因筛选的研究报道较多，但尚未见在山羊肌内前体脂肪细胞分化过程中的内参基因的筛选报道，而且已有的报道都多集中于不同组织、不同发育阶段和不同病理状态下。比如，陈利等[5]指出，在山羊同一时期不同组织中次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Hypoxanthine phosphoribosyl transferase 1，HPRT1)表达相对最稳定，且最佳内参组合为HPRT1和RNA聚合酶2(RNA polymerase Ⅱ，RP2)，在不同发育时期的骨骼肌中酪氨酸3-单氧化酶(Tyrosine 3-monooxygenase，YWHAZ)表达相对最稳定，其次是β-肌动蛋白(Beta-actin，ACTIN)；Y.Zhang等[7]指出，TATA盒结合蛋白(TATA box-binding protein，TBP)在山羊肝中表达相对稳定，而在肌肉中表达较稳定基因则为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)；张晓东[8]指出，波尔山羊各个组织相对最优内参基因是18S核糖体RNA(18S ribosome RNA，18S rRNA)，为更精确校正试验数据可选择18S rRNA和TBP二者；W.R.Vorachek等[9]发现，GADPH和YWHAZ是适合患腐蹄病绵羊中性粒细胞相对最好的一对内参基因，但健康绵羊中性粒细胞最稳定的内参基因为琥珀酸脱氢酶亚基A(Succinate dehydrogenase complex subunit A，SDHA)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH)；而在湖羊小肠黏膜的内参基因筛选试验中却表明，被普遍使用的内参基因GAPDH和18S不适合，ACTB和磷酸甘油酸激酶1(Phosphoglycerate kinase 1，PGK1)为该研究的最佳选择[10]；M. Jedrzejczak等[11]发现，在牛乳腺上皮细胞中泛表达转录子(Ubiquitously expressed transcript，UXT)和GAPDH展现出较强的稳定性；在热应激和激素处理下，UXT、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthine phosphoribosyl-transferase，HPRT)和核糖体蛋白S23(Ribosomal protein S23，RPS23)是牛黑素细胞较稳定的内参基因[12]。基于上述报道发现，内参基因稳定性具有品种、组织和细胞等特异性，推测山羊肌内前体脂肪细胞的成脂诱导分化具有自己特异稳定表达的内参基因。
因此，本研究以简州大耳山羊体外培养的肌内前体脂肪细胞为研究对象，利用qPCR分别检测诱导分化0、1、2、3、5和6 d的细胞中GAPDH、肽酰脯氨基顺反异构酶A(Peptidylproyl isomerase A，PPIA)、18S rRNA、肽酰脯氨基顺反异构酶B(Peptidylproyl isomerase B，PPIB)、UXT、核糖体磷蛋白大亚基P0(Pibosomal protein lateral stalk subunit P0，RPLP0)、ACTB、真核翻译起始因子3K(Eukaryotic translation initiation factor 3K，EIF3K)和TBP候选内参基因的表达水平[2, 7, 9, 13]，然后分别采用geNorm、NormFinder和BestKeeper程序进行分析，综合比较3种程序分析结果，并对Krupple样转录因子3(Krupple-like factor，KLF3)和Krupple样转录因子12(Krupple-like factor，KLF12)的表达水平进行校正分析，进而确定在山羊前体脂肪细胞诱导分化过程中最优内参基因及最优内参基因组合，为山羊肌内脂肪沉积分子机理的研究提供重要的基础数据。
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 山羊肌内前体脂肪细胞的获得及诱导分化本试验所用原代肌内脂肪细胞为前期试验分离和纯化[14]，置于液氮中保存备用。取出低温保存的原代肌内脂肪细胞，进行细胞复苏及传代培养，传至F3代时加入诱导分化液(100 μmol·L-1油酸)进行诱导分化，并分别在第0、1、2、3、5和6天收集细胞。
1.1.2 主要试剂培养基(DMEM/F12)和胰蛋白酶购自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)购自Gemini公司；油酸购自Sigma公司；TRIzol和SYBR® Premix Ex Taq TM (2×)购自TaKaRa公司，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit购自Thermo公司。
1.2 试验方法 1.2.1 总RNA提取和cDNA的合成按照TRIzol试剂盒的使用说明提取F3代山羊肌内脂肪细胞总RNA，利用1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测RNA样品的质量、浓度以及A260 nm/A280 nm值(该值为1.9~2.1的RNA样品才可用于后续试验)。使用Thermo公司反转录试剂盒，取以1 μg总RNA为模板进行反转录，将获得的cDNA置于-20 ℃保存。
1.2.2 荧光定量PCR引物设计及标准曲线构建本研究选取GAPDH、PPIA、18S rRNA、PPIB、UXT、RPLP0、ACTB、EIF3K和TBP等9个基因作为候选内参基因，利用Primer Premier 5.0软件，根据GenBank上9个基因在山羊中的序列设计荧光定量PCR引物(表 1)，引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。将cDNA模板按5倍进行稀释，选取5-1~5-4稀释倍数样品进行qPCR，借助Excel软件以样品浓度的对数为横坐标，Ct值为纵坐标绘制标准曲线，根据E=10(-1/slope)-1计算扩增效率，其中slope为标准曲线斜率。
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表 1 荧光定量PCR引物 Table 1 Primers for real-time quantitative PCR(qPCR) |
qPCR反应总体系为20 μL：cDNA 1 μL，Sense primer(10 μmol·L-1) 1 μL，Antisense primer(10 μmol·L-1)1 μL，SYBR® Premix Ex Taq TM (2×) PCR 10 μL，补充ddH2O至20 μL。反应在荧光定量聚合酶链反应检测系统(BIO-RAD，美国)中进行。qPCR反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，Tm(表 1)退火20 s，72 ℃延伸15 s，40个循环；65~95 ℃熔解20 s，每0.5 ℃读取1次荧光。每个时间点肌内脂肪细胞样品设3个重复，每个样品进行3次技术重复，阴性对照设置3个无cDNA模板的样本。
1.2.4 内参基因验证分别以KLF3和KLF12作为目标基因，设计并合成特异引物(表 1)，利用qPCR技术检测其在山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化过程中的表达量，分别用已筛选出的最稳定内参基因组合和2个最不稳定内参基因校正KLF3和KLF12的表达，比较在不同内参基因校正时该基因的表达变化情况。反应体系和反应条件同1.2.3。
1.2.5 数据分析候选内参基因相对表达量数据分析，某一候选内参基因各样本Ct值减去该基因在诱导分化0 d时最小Ct值，得到ΔCt，以2-ΔCt值作为该基因的相对表达量数值，再利用GraphPad Prism 5软件绘制候选内参基因相对表达量图谱；分别采用geNorm[15]、NormFinder[16]和BestKeeper[17]程序对各内参基因的表达稳定性进行分析；目标基因相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。geNorm和NormFinder程序导入每个候选内参基因的相对定量数据，采用2-ΔCt法计算相对定量数据，其中ΔCt为各样本Ct值与其对应最小Ct值之差，ΔCt≥0，计算得到各内参基因的平均表达稳定度并进行评价，同时利用geNorm程序做配对变异分析Vn/n+1结果图。BestKeeper程序导入qPCR所获得的Ct 值，根据标准差(SD)和变异系数(CV)评价内参基因的稳定性。
2 结果 2.1 内参基因引物的扩增效率及特异性对GAPDH、PPIA、18S rRNA、PPIB、UXT、RPLP0、ACTB、EIF3K和TBP等9个候选内参基因扩增样品进行质量检测，均无引物二聚体，且特异性较好，说明9对引物均能高特异性地扩增目的片段。同时由表 2可知，经5倍稀释梯度所得内参基因标准曲线的线性关系良好，扩增效率为66.5%~ 111.3%，决定系数(R2)为0.981 9~0.999 8，表明引物满足qPCR的扩增条件，得出的结果准确可靠。
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表 2 内参基因标准曲线方程、决定系数R2和扩增效率 Table 2 The equation, R-square (R2) of standard curves and amplification efficiency for the reference genes |
利用qPCR检测GAPDH、PPIA、18S rRNA、PPIB、UXT、RPLP0、ACTB、EIF3K和TBP等9个候选内参基因在山羊肌内前体脂肪细胞不同诱导分化时期的相对表达量。结果显示，9个基因在诱导分化不同时期相对表达量并非恒定，其中UXT、PPIA和PPIB在不同时期相对表达量趋势基本一致，而18S rRNA和ACTB波动最大(图 1)。
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图 1 候选内参基因在山羊肌内前体脂肪细胞分化过程中的相对表达量 Figure 1 The relative expression levels of candidate reference genes in different differentiation periods of goat intramuscular preadipocytes |
利用geNorm程序计算在山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化不同时期候选内参基因的平均表达稳定值(M)，M值越小表明内参基因稳定性越好。结果，GAPDH、PPIA、18S rRNA、PPIB、UXT、RPLP0、ACTB、EIF3K和TBP的M值依次为0.730、0.619、1.149、0.534、0.530、0.626、0.803、0.731和0.637，其中18S rRNA的表达水平变化相对最剧烈。依次去除最不稳定基因后结果显示，UXT和PPIB表达最稳定(图 2)，且M=0.240 2。内参基因的配对差异值Vn/n+1分析结果显示(图 3)，V2/3 < 0.15，说明在山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化过程中，使用2个内参基因(UXT和PPIB)即可达到准确校正目标基因表达的目的，无需引入更多内参基因。
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图 2 利用geNorm程序分析候选内参基因的平均表达稳定度 Figure 2 The average expression stability values of candidate reference genes by geNorm program |
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图 3 利用geNorm程序分析候选内参基因的配对变异系数 Figure 3 The pairwise variations of candidate reference genes by geNorm program |
利用NormFinder程序对GAPDH、PPIA、18S rRNA、PPIB、UXT、RPLP0、ACTB、EIF3K和TBP等9个候选内参基因稳定值(S)进行计算及分析，结果指出(表 3)，与其他候选内参及因相比UXT基因具有最小的S值(S=0.109)，表明该基因在山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化不同时期表达相对最稳定，其次表达较稳定的基因为PPIB和RPLP0，18S rRNA表达最不稳定(S=0.505)。同时NormFinder程序提供两个内参基因同时使用的最佳组合为UXT和PPIB基因，稳定值为0.106。
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表 3 利用NormFinder程序分析候选内参基因的稳定值 Table 3 The stability values of candidate reference genes by NormFinder program |
利用BestKeeper程序分析获得各基因相关系数、标准差和变异系数(表 4)，根据前人判定原则[18]可知，9个候选内参基因中，PPIB基因表达最稳定，其次为UXT和PPIA，18S rRNA表达最不稳定。由表 5可知，GAPDH与ACTB和PPIB与UXT的相关系数最大，根据GAPDH、ACTB、PPIB和UXT基因各自的稳定性，最终确定同时使用两个内参基因的最佳组合为PPIB和UXT。
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表 4 利用BestKeeper程序分析候选内参基因的表达稳定性 Table 4 The expression stability of candidate reference genes by BestKeeper program |
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表 5 利用BestKeeper程序分析候选内参基因间的相关系数 Table 5 The correlation coefficients among candidate reference genes by BestKeeper program |
为综合3个程序的分析结果，对诱导分化不同时间段的候选内参基因稳定性等级进行了平均值计算，9个候选内参基因GAPDH、ACTB、EIF3K、PPIA、PPIB、UXT、TBP、RPLP0和18S rRNA的稳定性等级排序的平均等级为6.0、6.3、7.3、3.6、1.7、1.3、4.6、5.0和9.0(表 6)。由此可见，在诱导分化过程中UXT基因的表达稳定性相对最好，其次为PPIB基因，而18S rRNA表达水平最不稳定。综合考虑3个程序对基因稳定性及配对分析可得，UXT和PPIB为最佳内参组合以校正目标基因表达量。
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表 6 利用3种程序分析候选内参基因的稳定性等级排序 Table 6 Overall stability ranks of candidate reference genes by 3 programs |
为了进一步探索应用最稳定和最不稳定内参基因进行校正时是否存在差异，分别以UXT和PPIB的几何平均数、UXT、EIF3K和18S rRNA为内参基因，分析LKF3和KLF12在山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化过程中的表达情况。结果显示(图 4)，在山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化过程中，以UXT和PPIB的几何平均数和UXT为校正因子时，KLF3的表达模式相同，均呈降低(0~3 d)后升高(5 d)再降低(6 d)的趋势；以EIF3K为校正因子时，大致趋势与前者相同，但在2和3 d时表达量下调(分别下调0.76和0.70倍)；而以18S rRNA为校正因子时，KLF3的表达量呈逐渐下降趋势。KLF12出现相同变化，以UXT和PPIB的几何平均数、UXT和EIF3K为校正因子时表达模式相同，但EIF3K校正时KLF12表达量下调，而18S rRNA为校正因子时KLF12表达模式发生变化，峰值出现在分化1 d的肌内脂肪细胞(上调1.34倍)。
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A和C表示分别以UXT & PPIB、18S rRNA和EIF3K为内参基因时，KLF3和KLF12在山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化过程中的相对表达水平；B和D表示分别以UXT & PPIB和UXT为内参基因时，KLF3和KLF12在山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化过程中的相对表达水平 A and C represent the expression levels of KLF3 and KLF12 genes in different differentiation periods of goat intramuscular preadipocytes when UXT & PPIB, 18S rRNA and EIF3K were used as reference genes; B and D represent the expression levels of KLF3 and KLF12 genes in different differentiation periods of goat intramuscular preadipocytes when UXT & PPIB and UXT were used as reference genes 图 4 不同内参基因校正下KLF3和KLF12在山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化过程中的表达水平 Figure 4 The expression levels of KLF3 and KLF12 genes normalized by different reference genes in different differentiation periods of goat intramuscular preadipocytes |
qPCR技术是检测基因表达水平最常用的手段，而内参基因的选择直接影响了其结果的准确性。但大量的研究证明，这些内参基因是在特定条件下稳定表达，内参基因的盲目选择会导致定量结果不真实[19]。例如在蛋鸡不同组织中核糖体蛋白S2(Ribosomal protein S2，RPS2)和ACTB基因表达相对更稳定[20]；而TBP、核糖体蛋白L4(Ribosomal protein L4，RPL4)基因则是在猪肌肉组织中相对稳定表达的内参基因[21]；李迪等[22]在校正鳜鱼qPCR结果时发现，β-2-微球蛋白(Beta-2 microglobulin，B2M)和核糖体蛋白L13a(Ribosomal protein L13a，RPL13a)表达相对最稳定；在关于绵羊的研究中发现，GAPDH、SDHA和ACTB适合于大脑、G6PDH、ACTB和YWHAZ适合于小脑，而SDHA、核糖体蛋白L19(Ribosomal protein L19，RPL19)和GAPDH适合于肠系膜淋巴结中校正目标基因表达[23]。因此具有针对性的筛选内参基因具有重要意义。本试验利用qPCR技术检测山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化过程中内参基因的相对表达发现(图 1)，UXT、PPIB和PPIA表达相对稳定，18S rRNA和ACTB变化最大。因此为了进一步确定最优内参基因，本研究分别利用geNorm、NormFinder和BestKeeper程序对9个候选内参基因稳定性进行分析。
研究者多用geNorm、NormFinder和BestKeeper等程序来专门评价内参基因的稳定性。J. Vandesompele等[15]于2002年编写了geNorm程序，该程序可用于任何试验条件下筛选最适内参基因，并选出最优内参基因组合以校正目标基因表达。geNorm程序根据各内参基因相对表达量计算稳定值M以及配对变异Vn/n+1值，M值越小则内参基因表达越稳定，Vn/n+1值小于0.15时最适内参基因个数为n，反之则为n+1。C.L.Andersen等[16]于2004年编写了NormFinder程序，运行该程序所得稳定值S是通过计算各内参基因相对表达量而获得，该值越小内参基因稳定性越好；同年M.W.Pfaffl等[17]编写了BestKeeper程序，该程序不仅可以分析内参基因的表达稳定性，而且还可以对目标基因表达量进行分析，输入qPCR原始数据，运行得到内参基因间相关系数、变异系数和标准差。本研究结果经分析发现，3种程序分析结果并不相同，geNorm和NormFinder程序分析显示UXT表达相对最稳定，而BestKeeper程序分析发现PPIB表达更稳定，3个程序分析结果均表明，使用UXT和PPIB基因即可准确校正在山羊肌内前体脂肪细胞分化不同时期目标基因的表达水平；且在本试验条件下最不稳定的内参基因均为18S rRNA。
为了最终确定适合于山羊肌内前体脂肪细胞成脂诱导分化的最适内参基因，本试验综合分析了9个候选基因的稳定等级排名发现，在山羊肌内前体脂肪细胞分化不同时期UXT基因表达水平相对最稳定，最不稳定基因为18S rRNA，并且应用UXT和PPIB组合作为内参基因校正目标基因表达更准确。UXT是PFD(α-class prefoldin)蛋白家族成员之一[24]，是在动物研究中受不同物种、组织、试验环境影响差异较小的内参基因之一。M. Bonnet等[2]研究发现，UXT基因在牛和山羊的乳腺、肝和脂肪组织中表达相对最稳定。UXT基因表达的稳定性不受日粮[25]和泌乳周期[26]影响，适合作为围产期、泌乳期奶牛乳腺组织的内参基因。在关于牦牛乳体细胞的研究中发现，核糖体蛋白S9(Ribosomal protein S9，RPS9)、蛋白磷酸酶1调控亚基11(Protein phosphatase 1 regulatory subunit 11，PPP1R11)、UXT和线粒体核糖体蛋白L39(Mitochondrial ribosomal protein L39，MRPL39)为稳定表达的内参基因[6]。本研究发现，UXT是山羊肌内前体脂肪细胞分化不同时期表达相对最稳定的基因，为UXT基因作为一种较为普遍使用的内参基因提供了佐证，但也有研究提出，UXT并不适合作为荷斯坦奶牛乳体细胞的内参基因[27]，所以每一物种不同细胞或者组织内稳定表达的内参基因都需要通过试验来进行验证。PPIB是肽酰脯氨基顺反异构酶(Peptidylproyl isomerase，PPI)家族的成员，与PPIA高度同源，在体内分布广泛，与自身免疫性疾病密切相关[28-29]。PPIB基因与ACTB和GAPDH相比，更适合作为人外周血液的内参基因[30]。本团队的前期研究发现，PPIB和羟甲基胆素合酶(Hydroxymethyl-bilane synthase，HMBS)是成都麻羊和简州大耳山羊不同部位肌肉组织中相对最稳定的内参基因[18]。这些研究结果为其他物种、细胞及试验条件下以PPIB作为候选内参基因提供了参考。
为了确定本试验筛选得到的适合研究山羊肌内前体脂肪细胞分化过程的内参基因及组合，需要以特定的目标基因来进行验证。KLF3和KLF12是KLF转录因子家族成员，转录调控是脂肪细胞分化的最重要调控方式，本实验室前期转录组测序数据表明，KLF3和KLF12可能参与山羊肌内前体脂肪细胞分化过程，因此本试验选择二者作为目标基因来验证所筛选内参基因的准确性。结果表明，将UXT和PPIB的几何平均数、UXT和EIF3K基因用于归一化分析时，KLF3和KLF12的表达模式未发生变化，相对于UXT和PPIB而言EIF3K作为内参时目标基因的表达量降低。以18S rRNA作为内参基因，KLF3和KLF12的表达模式均发生变化。因此，当选用不同内参基因进行归一化分析时，KLF3和KLF12的表达模式有很大差异，说明需要准确的筛选内参基因以得到正确的目标基因的表达变化，并不能盲目的选用常用内参基因18S rRNA进行分析。近年来也有一些研究报道了18S rRNA在一些物种、组织和试验条件下不适合作为内参基因。比如W.Z.Zhu等[18]发现，18S rRNA是山羊背最长肌和股二头肌表达最不稳定的内参基因；此外，18S rRNA在山羊小肠组织中也不能稳定表达[7]，在山羊不同日龄及不同部位的小肠黏膜中的表达同样不稳定[10]。在关于新西兰白兔[31]等内参筛选中也得到了相似的结果。因此，本研究结果表明，UXT和PPIB组合为最适合研究山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化过程的内参基因，这为后续阐明山羊IMF沉积分子机理数据的准确性提供了重要的基础。
4 结论本研究成功筛选出山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化不同时期的内参基因，最佳选择为UXT，而18S rRNA稳定性相对较差，不适合作为相关研究的内参基因。同时使用2个内参对目标基因进行校正的最适内参组合为UXT和PPIB，该研究结果为检测山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化过程中目标基因的表达提供了内参依据。
参考文献
| [1] | WOOD J D, ENSER M, FISHER A V, et al. Fat deposition, fatty acid composition and meat quality:A review[J]. Meat Sci, 2008, 78(4): 343–358. DOI: 10.1016/j.meatsci.2007.07.019 |
| [2] | BONNET M, BERNARD L, BES S, et al. Selection of reference genes for quantitative real-time PCR normalisation in adipose tissue, muscle, liver and mammary gland from ruminants[J]. Animal, 2013, 7(8): 1344–1353. DOI: 10.1017/S1751731113000475 |
| [3] | SUGDEN K, PARIANTE C M, MCGUFFIN P, et al. Housekeeping gene expression is affected by antidepressant treatment in a mouse fibroblast cell line[J]. J Psychopharmacol, 2010, 24(8): 1253–1259. DOI: 10.1177/0269881108099690 |
| [4] | RADONIĆ A, THULKE S, MACKAY I M, et al. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 313(4): 856–862. DOI: 10.1016/j.bbrc.2003.11.177 |
| [5] |
陈利, 赵薇, 占思远, 等. 山羊不同组织及不同发育时期骨骼肌内参基因的表达稳定性分析[J]. 畜牧兽医学报, 2014, 45(8): 1228–1236.
CHEN L, ZHAO W, ZHAN S Y, et al. The expression stability analysis of reference genes in the different tissues and skeletal muscle of different development periods in goat[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2014, 45(8): 1228–1236. (in Chinese) |
| [6] | BAI W L, YIN R H, ZHAO S J, et al. Technical note:Selection of suitable reference genes for studying gene expression in milk somatic cell of yak (Bos grunniens) during the lactation cycle[J]. J Dairy Sci, 2014, 97(2): 902–910. DOI: 10.3168/jds.2012-6437 |
| [7] | ZHANG Y, ZHANG X D, LIU X, et al. Reference gene screening for analyzing gene expression across goat tissue[J]. Asian-Australas J Anim Sci, 2013, 26(12): 1665–1671. DOI: 10.5713/ajas.2013.13199 |
| [8] |
张晓东. 山羊卵巢microRNA的鉴定及生物学功能分析[D]. 合肥: 安徽农业大学, 2013.
ZHANG X D. Identification and biological role analysis of microRNA in goat ovaries[D]. Hefei: Anhiu Agricultural University, 2013. (in Chinese) http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10364-1014148045.htm |
| [9] | VORACHEK W R, HUGEJILETU, BOBE G, et al. Reference gene selection for quantitative PCR studies in sheep neutrophils[J]. Int J Mol Sci, 2013, 14(6): 11484–11495. DOI: 10.3390/ijms140611484 |
| [10] |
马志远, 翁秀秀, 李飞, 等. 湖羊小肠黏膜内参基因筛选[J]. 动物营养学报, 2015, 27(11): 3478–3484.
MA Z Y, WENG X X, LI F, et al. Selection of reference genes in small intestinal mucosa of Hu Lambs[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2015, 27(11): 3478–3484. DOI: 10.3969/j.issn.1006-267x.2015.11.019 (in Chinese) |
| [11] | JEDRZEJCZAK M, SZATKOWSKA I. Bovine mammary epithelial cell cultures for the study of mammary gland functions[J]. in vitro Cell Dev Biol Anim, 2014, 50(5): 389–398. DOI: 10.1007/s11626-013-9711-4 |
| [12] | CHOUDHARY R, KUMAR S, SINGH S V, et al. Validation of putative reference genes for gene expression studies in heat stressed and α-MSH treated melanocyte cells of Bos indicus using real-time quantitative PCR[J]. Mol Cell Probes, 2016, 30(3): 161–167. DOI: 10.1016/j.mcp.2016.03.002 |
| [13] | GUO Y, PENNELL M L, PEARL D K, et al. The choice of reference gene affects statistical efficiency in quantitative PCR data analysis[J]. Biotechniques, 2013, 55(4): 207–209. |
| [14] |
李倩, 林亚秋, 朱江江, 等. 山羊FGF 21基因克隆及其在肌内脂肪细胞中的表达模式研究[J]. 畜牧兽医学报, 2017, 48(1): 31–38.
LI Q, LIN Y Q, ZHU J J, et al. Cloning of goat FGF 21 gene and its expression pattern in intramuscular adipocyte[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2017, 48(1): 31–38. (in Chinese) |
| [15] | VANDESOMPELE J, DE P K, PATTYN F, et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes[J]. Genome Biol, 2002, 3(7): research0034. |
| [16] | ANDERSEN C L, JENSEN J L, ØRNTODT T F. Normalization of real-time quantitative reverse transcription PCR data:a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets[J]. Cancer Res, 2004, 64(15): 5245–5250. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-04-0496 |
| [17] | PFAFFL M W, TICHOPAD A, PRGOMET C, et al. Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity:Bestkeeper-Excel-based tool using pair-wise correlations[J]. Biotechnol Lett, 2004, 26(6): 509–515. DOI: 10.1023/B:BILE.0000019559.84305.47 |
| [18] | ZHU W Z, LIN Y Q, LIAO H H, et al. Selection of reference genes for gene expression studies related to intramuscular fat deposition in Capra hircus skeletal muscle[J]. PLoS One, 2015, 10(3): e0121280. DOI: 10.1371/journal.pone.0121280 |
| [19] | KLENKE S, RENCKHOFF K, ENGLER A, et al. Easy-to-use strategy for reference gene selection in quantitative real-time PCR experiments[J]. Naunyn Schmiedeberg's Arch Pharmacol, 2016, 389(12): 1353–1366. DOI: 10.1007/s00210-016-1305-8 |
| [20] |
张蓉, 施晓丽, 陈朝桂, 等. 实时荧光定量PCR研究蛋鸡组织基因表达的内参基因筛选[J]. 中国畜牧兽医, 2017, 44(8): 2226–2233.
ZHANG R, SHI X L, CHEN C G, et al. Screening of reference genes for gene expression in layer hens tissues using real- time quantitative PCR[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2017, 44(8): 2226–2233. (in Chinese) |
| [21] |
齐波, 朱荣生, 王怀中, 等. 测定猪不同组织基因表达时RT-PCR内参基因的选择[J]. 家畜生态学报, 2017, 38(6): 8–12.
QI B, ZHU R S, WANG H Z, et al. Selection of reference genes of real-time quantitative PCRin the gene expression of different tissues in pig[J]. Acta Ecologiae Animalis Domastici, 2017, 38(6): 8–12. (in Chinese) |
| [22] |
李迪, 吴萍, 何美凤, 等. qRT-PCR分析鳜鱼内参基因的筛选[J]. 生命科学研究, 2016, 20(3): 214–217.
LI D, WU P, HE M F, et al. Screening of reference genes in siniperca chuatsi for qRT-PCR analysis[J]. Life Science Research, 2016, 20(3): 214–217. (in Chinese) |
| [23] | GARCIA-CRESPO D, JUSTE R A, HURTADO A. Selection of ovine housekeeping genes for normalisation by real-time RT-PCR; analysis of PrP gene expression and genetic susceptibility to scrapie[J]. BMC Vet Res, 2005, 1: 3. DOI: 10.1186/1746-6148-1-3 |
| [24] | ZHAO H W, WANG Q, ZHANG H T, et al. UXT is a novel centrosomal protein essential for cell viability[J]. Mol Biol Cell, 2005, 16(12): 5857–5865. DOI: 10.1091/mbc.e05-08-0705 |
| [25] |
秦彤, 王皓宇, 郝海生, 等. 日粮精粗比对围产期奶牛乳腺内参基因表达的影响[J]. 华北农学报, 2013, 28(4): 75–78.
QIN T, WANG H Y, HAO H S, et al. Reference gene expression in mammary tissue of periparturient cows is affected by dietary forage to concentrate ratio[J]. Acta Agriculture Boreali-Sinica, 2013, 28(4): 75–78. (in Chinese) |
| [26] | BIONAZ M, LOOR J J. Identification of reference genes for quantitative real-time PCR in the bovine mammary gland during the lactation cycle[J]. Physiol Genomics, 2007, 29(3): 312–319. DOI: 10.1152/physiolgenomics.00223.2006 |
| [27] | MUHAGHEGH-DOLATABADY M, HOSSAINY-DOLATABAD H H, ARIJLO E H, et al. Validation of reference genes for real time PCR normalization in milk somatic cells of holstein dairy cattle[J]. Iran J Appl Anim Sci, 2017, 7(2): 229–234. |
| [28] |
王慧, 付金栋, 刘京营, 等. 亲环素B、D在肝纤维化模型中的变化及其意义[J]. 中华肝脏病杂志, 2012, 20(9): 705–706.
WANG H, FU J D, LIU J X, et al. Study of Cyclophilin B and D in rat liver fibrosis models[J]. Chinese Journal of Hepatology, 2012, 20(9): 705–706. (in Chinese) |
| [29] |
乐飞, 李健文, 冯波, 等. PPIB蛋白对结肠癌成瘤的影响和低氧机制[J]. 外科理论与实践, 2015, 20(6): 505–509.
LE F, LI J W, FENG B, et al. Effect of PPIB on tumorigenesis in colon cancer and hypoxia-mediated mechanism[J]. Journal of Surgery Concepts & Practice, 2015, 20(6): 505–509. (in Chinese) |
| [30] | PACHOT A, BLOND J L, MOUGIN B, et al. Peptidylpropyl isomerase B (PPIB):a suitable reference gene for mRNA quantification in peripheral whole blood[J]. J Biotechnol, 2004, 114(1-2): 121–124. DOI: 10.1016/j.jbiotec.2004.07.001 |
| [31] |
陈瑞, 杨晓农, 曾婉秋, 等. 家兔不同发育阶段和组织中内参基因的稳定性分析[J]. 畜牧兽医学报, 2016, 47(3): 477–483.
CHEN R, YANG X N, ZENG W Q, et al. Expression stability analysis of reference genes in different development periods and tissues in oryctolagus cuniculus[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2016, 47(3): 477–483. (in Chinese) |