2. 重庆市高校兽医科学工程研究中心中兽药创新研发实验室, 重庆 402460
2. Chinese Veterinary Herbal Drugs Innovation Research Lab, University Veterinary Science Engineering Research Center in Chongqing, Chongqing 402460, China
术芩是根据中兽医理论和临床辨证论治原则，选用白术、黄芩、黄芪、茯苓等组成的自拟中药复方。前期研究表明术芩颗粒对冬季仔猪腹泻有明显的治疗作用和增强免疫功能的作用[1-2]。术芩复方中的白术、黄芪、茯苓等主要活性物质为多糖类物质[3-5]。多糖是具有多种生物活性的天然大分子物质，广泛存在于中药材中，是中药材中发挥独特疗效的重要物质基础[4]，被称为天然的免疫调节剂[5]。
脾是重要的外周免疫器官，是淋巴细胞定居的场所。自噬参与淋巴细胞的发育、固有免疫和适应性免疫应答途径。自噬(autophagy)，也称为自我吞噬(self-eating)，在1962年由Ashford和Porter[6]首先提出，他们将所观察到的细胞中存在的自食现象称为自噬。自噬在维持细胞自我稳态、促进细胞生存、生长、发育以及抵御外来病原微生物等方面起着重要作用[7-9]。自噬是细胞内一种动态降解的过程，适当的自噬可促进各种应激下的细胞存活[10]。然而，过度或持续的自噬可以降低细胞活力并引发凋亡介导的细胞死亡[11]。为探讨术芩增强免疫功能的机制，本试验从术芩复方原药材中提取其多糖，探讨其对环磷酰胺致免疫低下小鼠脾淋巴细胞自噬的影响，从现代医学角度寻找术芩总多糖通过调控自噬进而调节机体免疫功能的客观依据，进一步探索复方术芩总多糖调节仔猪冬季腹泻的机制，为复方术芩应用于临床奠定基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料昆明系小鼠，体重(20±2) g，健康，雌雄各半，购自西南大学荣昌校区实验动物中心；复方术芩，由白术(4份)、黄芩(3份)、茯苓(3份)、黄芪(4.5份)、煨木香(2.5份)、广藿香(2.5份)、干姜(2份)、甘草(1.5份)组成(中国专利号或专利申请号：201310344433.4)[2]，购自四川千金中药饮片有限公司，批号：160201；RPMI-1640培养基，购自Gibco公司，批号：8111185；Cell Counting Kit-8 (CCK-8试剂盒)，购自Beyotime碧云天生物技术研究所，批号：11E24C60；ExCell澳洲胎牛血清，购自依科赛生物科技有限公司，批号：FBS11701；LC3B (D11) XP® Rabbit mAb，Beclin-1 (D40C5) Rabbit mAb，购自Cell Signaling Technology公司；Ficoll-PaqueTM PREMIUM 1.084 sterile solution，购自GE Healthcare公司，批号：10240034；3-MA，购自Med Chem Express(MCE)，批号：23260。
术芩总多糖(polysaccharides from ZhuQin Formula，ZQp)，苯酚硫酸法测定糖含量为91.42%：由西南大学荣昌校区中兽药创新实验室提取并鉴定[12]。
1.2 主要仪器设备Automated Cell Counter(BIO-RAD TC20TM)；Bio-Rad Model 680 Microplate Reader(美国Bio-Rad Laboratories，Inc)；3111型隔水式二氧化碳培养箱(Thermo Electron Laboratories，USA)；4300化学发光拍摄器(上海勤翔)；Universal Hood Ⅱ凝胶成像系统(美国Bio-Rad Laboratories，Inc)；AKTA FPLC蛋白纯化系统(瑞典法玛西亚公司)；Trans-Blot SD蛋白半干转印系统(美国Bio-Rad Laboratories，Inc)等。
1.3 试验方法 1.3.1 术芩总多糖的提取[13-14]按比例称取所需药材共100 g，粉粹后加石油醚，加热回流1 h，回流提取2次后离心，弃上清，挥干石油醚；加入80%乙醇回流提取2 h，提取2次后过滤；挥尽乙醇，用沸水回流提取2次，每次2 h。过滤，合并上清液，浓缩至100 mL。醇沉2次，加无水乙醇至醇含量达80%，4 ℃冰箱过夜，过滤，蒸馏水溶解沉淀。加savage试剂除蛋白，除5次以上至几乎无蛋白。离心，蒸馏水溶解沉淀，再次醇沉后过滤。依次将沉淀用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤3次，30 ℃干燥，得多糖。
苯酚硫酸法测定术芩总多糖含量为91.42%。所提取的术芩总多糖呈淡灰白色的粉末。
1.3.2 小鼠脾淋巴细胞的分离培养[15-16]参考文献方法分离空白组小鼠、环磷酰胺致免疫低下模型组小鼠[12]淋巴细胞，用含10%FBS和2%庆大霉素的RPMI-1640完全培养基调节细胞密度为3×106个·mL-1，分别培养空白组小鼠脾淋巴细胞(简称空白组，kb)、环磷酰胺造模组小鼠脾淋巴细胞(简称模型组，M)备用。
1.3.3 细胞增殖的最佳条件采用十倍稀释法配制9个浓度组：浓度1(104μg·mL-1)、浓度2(103μg·mL-1)、浓度3(102μg·mL-1)、浓度4(10 μg·mL-1)、浓度5(1 μg·mL-1)、浓度6(10-1μg·mL-1)、浓度7(10-2μg·mL-1)、浓度8(10-3μg·mL-1)、浓度9(10-4μg·mL-1)。取不同浓度的术芩总多糖(ZQp)各100 μL加入96孔板中，后加入空白组小鼠脾淋巴细胞3×106个·mL-1，100 μL·孔-1，置37 ℃ 5% CO2培养箱内培养12、24、48 h，CCK-8法测定术芩总多糖使小鼠脾淋巴细胞增殖的最适浓度及时间。
1.3.4 测定免疫低下小鼠脾淋巴细胞的增殖试验分为空白组(kb)、环磷酰胺免疫低下模型组(M)、模型+术芩总多糖组(术芩总多糖终质量浓度为10-1μg·mL-1，M+ZQp)，置37 ℃，5% CO2培养箱内培养12 h，终止培养前4 h，加入CCK-8溶液10 μL，继续培养4 h。培养结束后在酶标仪上于450 nm波长处读出每孔吸光度(A)。
1.3.5 术芩总多糖+ConA对细胞增殖的影响为了比较术芩总多糖、术芩总多糖+ConA对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响，试验分为空白组(kb)、术芩总多糖组(术芩总多糖终质量浓度为10-1μg·mL-1，ZQp)、ConA组(ConA终质量浓度为10 μg·mL-1，ConA)、术芩总多糖+ConA组(终质量浓度分别为10-1、10 μg·mL-1，ZQp+ConA)，加入96孔板中，3×106个·mL-1，100 μL·孔-1，置37 ℃，5% CO2培养箱内培养12、24、48 h，终止培养前4 h，加入CCK-8溶液10 μL，继续培养4 h。培养结束后在酶标仪上于450 nm波长处读每孔吸光度(A)。
1.3.6 小鼠脾淋巴细胞Beclin1、LC3BⅡ/Ⅰ蛋白测定将小鼠脾淋巴细胞培养于6孔板中，以RPMI-1640完全培养基调整细胞数为5×105个·孔-1，每孔终体积为2 mL·孔-1，分为空白组(kb)、3-MA组(3-MA终浓度为10 mmol·L-1)、术芩总多糖+3-MA组(终质量浓度分别为10-1μg·mL-1、10 mmol·L-1，ZQp+3-MA)，置37 ℃，5%CO2培养箱中培养12 h后；参照文献[17-19]，收集细胞，用PBS洗涤细胞2次后，加入预冷的细胞裂解液200 μL后，于4 ℃，12 000 r·min-1离心20 min，取其上清，定量，Loading Buffer与样品充分混匀，煮沸10 min；SDS-PAGE蛋白电泳及转印(10%分离胶、5%浓缩胶)：80 V恒压，20 min电泳浓缩胶；然后将电压调至120 V继续电泳，至loading buffer全部电泳出PAGE胶；300 mA恒流转印35~40 min，封闭，一抗4 ℃过夜；洗膜5次；二抗室温孵育1 h，洗膜5次；加入ECL发光液；拍照，用ImageJ2x分析灰度值。
1.3.7 测定免疫低下小鼠脾淋巴细胞Beclin1、LC3BⅡ/Ⅰ蛋白将小鼠脾淋巴细胞培养于6孔板中，分别为空白组(kb)、模型组、模型+术芩总多糖组(术芩总多糖终浓度为10-1μg·mL-1，M+ZQp)，细胞数为5×105个·孔-1，每孔终体积为2 mL·孔-1，置37 ℃，5%CO2培养箱中培养；根据以上试验结果，培养12 h收集细胞。Western blot检测细胞内Beclin1、LC3BⅡ/Ⅰ蛋白的表达，方法同上。
1.3.8 统计分析用SPSS20.0统计软件，对所有数据进行显著性检验，并进行分析比较，数据以平均值±标准差(x±s)表示，用Image J2X分析蛋白的表达，均以GraphPad作图。
2 结果 2.1 细胞增殖的最佳条件试验结果显示，质量浓度为1、10-1 μg·mL-1的术芩总多糖(ZQp)作用小鼠脾淋巴细胞12 h，细胞的增殖能力增强，与空白组(kb)相比，差异显著或极显著(P＜0.05或P＜0.01)；各剂量浓度术芩总多糖(ZQp)作用于小鼠脾淋巴细胞24、48 h，细胞增殖能力与空白组(kb)相比，无显著性差异(P＞0.05)，详见图 1。
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与空白对照组比，*.差异显著(0.01≤P＜0.05)；**.差异极显著(P＜0.01) Compared with blank control group, *. Significant difference (0.01≤P < 0.05);**. Extremely significant difference (P < 0.01) 图 1 术芩总多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖的最佳条件 Figure 1 The best conditions of ZQp on the proliferation of spleen lymphocytes in mice |
模型组(M)脾淋巴细胞增殖能力降低，与空白组(kb)相比，差异极显著(P＜0.01)；加入术芩总多糖(ZQp)后，细胞的增殖能力增强，与模型组(M)比，差异极显著(P＜0.01)，详见图 2。
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kb.空白组；M.环磷酰胺免疫低下模型组；M+ZQp.模型+术芩总多糖组(100 ng·mL-1ZQp作用12 h); 相同字母表示组间差异不显著(P＞0.05)，不同小写字母表示组间差异显著(P＜0.05)，不同大写字母表示组间差异极显著(P＜0.01)。下图同 kb.Blank control; M.Cyclophosphamide induced immuno-compromised model group; M+ZQp.Model+ZQp group(100 ng·mL-1ZQp cultured for 12 h); Same letters means not significant difference between treatments (P > 0.05), different lowercase letters means significant difference (P < 0.05), different capital letters means very significant difference between treatments (P < 0.01). The same as below 图 2 术芩总多糖对免疫低下小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 Figure 2 Effect of ZQp on the proliferation of spleen lymphocytes in immunocompromised mice |
质量浓度为10 μg·mL-1的ConA作用于小鼠脾淋巴细胞12 h，细胞增殖能力增强，但与空白组(kb)相比，差异不显著(P＞0.05)；浓度为10-1 μg·mL-1的术芩总多糖(ZQp)作用于小鼠脾淋巴细胞12 h，细胞增殖能力增强，与空白组(kb)比，差异显著(P＜0.05)；ConA+术芩总多糖(ZQp)作用于小鼠脾淋巴细胞12 h，细胞增殖能力增强，与空白组(kb)比，差异显著(P＜0.05)。ConA+术芩总多糖(ZQp)作用小鼠脾淋巴细胞24 h，细胞增殖能力增强，与ZQp组、ConA组相比，差异极显著(P＜0.01)。ConA+术芩总多糖(ZQp)作用小鼠脾淋巴细胞48 h，细胞增殖能力增强，与ZQp组相比，差异极显著(P＜0.01)，与ConA组相比，差异不显著(P＞0.05)，详见图 3。
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图 3 术芩总多糖+ConA对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 Figure 3 The effect of ZQp+ConA on the proliferation of spleen lymphocytes in mice |
空白组小鼠脾淋巴细胞Beclin1蛋白的相对表达量为0.48±0.01，3-MA(自噬抑制剂)组小鼠脾淋巴细胞Beclin1蛋白的相对表达量降低，为0.14±0.00，与空白组相比，差异极显著(P＜0.01)；3-MA+术芩总多糖(ZQp)组小鼠脾淋巴细胞Beclin1蛋白的相对表达量升高，为0.16±0.00，与3-MA组比较，差异极显著(P＜0.01)，详见图 4。
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kb.空白组; 3-MA.自噬抑制剂组; 3-MA+ZQp.3-MA+术芩总多糖组 kb.Blank control; 3-MA.3-methyladenine(autophagy inhibitor)group; 3-MA+ZQp.3-MA+ZQp group 图 4 3-MA抑制时Beclin1蛋白的表达 Figure 4 Expression of Beclin1 protein in 3-MA inhibition |
空白组小鼠脾淋巴细胞LC3BⅡ/LC3BⅠ蛋白表达的相对比值为0.66±0.02，3-MA组小鼠脾淋巴细胞LC3BⅡ/LC3BⅠ蛋白表达的相对比值升高，为0.98±0.01，与空白组相比，差异极显著(P＜0.01)；3-MA+术芩总多糖(ZQp)组小鼠脾淋巴细胞LC3BⅡ/LC3BⅠ蛋白表达的相对比值降低，为0.94±0.01，与3-MA组比较，差异显著(0.01＜P＜0.05)，详见图 5。
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kb.空白组; 3-MA.自噬抑制剂组; 3-MA+ZQp.3-MA+术芩总多糖组 kb.Blank control; 3-MA.3-methyladenine(autophagy inhibitor)group; 3-MA+ZQp.3-MA+ZQp group 图 5 3-MA抑制时LC3BⅡ/Ⅰ蛋白的表达 Figure 5 Expression of LC3B Ⅱ/Ⅰ protein in 3-MA inhibition |
空白组小鼠脾淋巴细胞自噬相关蛋白Beclin1的相对表达量为0.48±0.01，环磷酰胺致免疫低下模型组小鼠脾淋巴细胞自噬相关蛋白Beclin1的相对表达量升高，为0.65±0.01，与空白组相比，差异极显著(P＜0.01)；M+术芩总多糖(ZQp)组小鼠脾淋巴细胞自噬相关蛋白Beclin1的相对表达量降低，为0.32±0.00，与模型组相比，差异极显著(P＜0.01)，详见图 6。
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kb.空白组；M.环磷酰胺免疫低下模型组；M+ZQp.模型+术芩总多糖组 kb.Blank control; M.Cyclophosphamide induced immunocompromised model group; M+ZQp.Model+ZQp group 图 6 免疫低下小鼠脾淋巴细胞Beclin1蛋白的表达 Figure 6 Expression of Beclin1 protein in splenic lymphocytes of immunocompromised mice |
空白组小鼠脾淋巴细胞自噬相关蛋白LC3BⅡ/Ⅰ的相对表达量为0.66±0.02，环磷酰胺免疫低下模型组小鼠脾淋巴细胞自噬相关蛋白LC3BⅡ/Ⅰ的相对表达量升高，为0.90±0.01，与空白组相比，差异极显著(P＜0.01)；M+术芩总多糖(ZQp)组小鼠脾淋巴细胞自噬相关蛋白LC3BⅡ/Ⅰ的相对表达量降低，为0.55±0.03，与模型组相比，差异极显著(P＜0.01)，详见图 7。
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kb.空白组；M.环磷酰胺免疫低下模型组；M+ZQp.模型+术芩总多糖组 kb.Blank control; M.Cyclophosphamide induced immunocompromised model group; M+ZQp.Model+ZQp group 图 7 免疫低下小鼠脾淋巴细胞LC3BⅡ/Ⅰ蛋白的表达 Figure 7 Expression of LC3BⅡ/Ⅰ protein in splenic lymphocytes of immunocompromised mice |
脾淋巴细胞增殖是反映机体细胞免疫与体液免疫最直接的指标，通过促进淋巴细胞增殖，达到增强机体免疫力的目的[15]。本试验中环磷酰胺致免疫低下小鼠脾淋巴细胞增殖能力降低，加入术芩总多糖后，增殖能力增强。说明术芩总多糖能促进免疫抑制小鼠体外淋巴细胞增殖，增强免疫功能。
自噬是细胞基本的代谢过程，它能降解细胞内的蛋白质和细胞器，以最有效的方式重复利用这些成分，来维持细胞的生存和组织自稳。自噬参与了机体内许多重要的生理活动，如细胞周期、细胞死亡以及抵御外来病原微生物等。近年来，大量的研究表明，自噬参与淋巴细胞的发育、固有免疫和适应性免疫应答途径[20]。本试验中，环磷酰胺致免疫低下模型小鼠脾淋巴细胞增殖发育受损，Beclin1、LC3BⅡ/Ⅰ蛋白的表达增加，自噬增强；加入术芩总多糖后，淋巴细胞的增殖能力增强，Beclin1、LC3BⅡ/Ⅰ蛋白的表达降低，自噬减弱。说明自噬参与了淋巴细胞的发育，推测小鼠脾淋巴细胞增殖发育受损与Beclin1、LC3BⅡ/Ⅰ蛋白的表达增加有关。
自噬发生的第一步是吞噬泡的形成，Beclin1主要定位于内质网，在自噬的启动阶段发挥了重要作用，Beclin1与Class Ⅲ PI3K(hVPS34)、Atg14形成三聚体，准确的引导并不断募集其它自噬相关蛋白定位于自噬体膜，介导自噬起始[21]，在吞噬泡形成过程中起重要作用[22]。3-MA为特异性自噬抑制剂，通过抑制Class Ⅲ PI3K的活性从而抑制自噬泡的形成，术芩总多糖能解除3-MA的抑制，通过上调Beclin1蛋白的表达，调控自噬泡的形成，从而激活抑制状态下的自噬；在吞噬泡的隔离膜延长过程中，在Atg4作用下，LC3前体被加工成可溶性LC3-Ⅰ，后者在Atg7(E1样酶)和Atg3(E2样酶)作用下与磷脂酰乙醇胺(PE)连接成为脂溶性的LC3-Ⅱ-PE，参与自噬溶酶体膜的延伸，直到自噬溶酶体形成[23-24]。当LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表达的相对比值升高时，术芩总多糖能降低LC3BⅡ/Ⅰ蛋白的表达，说明术芩总多糖也在吞噬泡的隔离膜延长过程中起作用，参与自噬溶酶体膜的延伸阶段。
自噬是一把“双刃剑”，一方面激活抑制状态下低水平的自噬有利于激活机体正常的免疫水平，发挥积极的免疫功能；另一方面过高的自噬使机体正常的免疫细胞受损，导致Ⅱ型程序性细胞死亡[25-26]或自噬促使细胞凋亡的激活而导致Ⅰ型程序性细胞死亡。本试验中，术芩总多糖能增加3-MA抑制情况下低水平的自噬，降低环磷酰胺免疫低下小鼠脾淋巴细胞中高水平的自噬，推测术芩总多糖能调节自噬的稳态。当自噬抑制时，增加自噬；当自噬增加时，降低自噬。自噬和凋亡在哺乳动物发育和细胞稳态的维持中均发挥重要作用[27]。本试验中自噬与凋亡是合作关系[28]，还是自噬促进了凋亡的发生，有待进一步研究。
同时，笔者还发现一个现象，当Beclin1蛋白被3-MA抑制时，LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表达的相对比值反而升高，分析原因可能为：其一，LC3-Ⅱ的升高可能有两方面的原因[29]，一是刺激了自噬，二是阻碍了自噬体与溶酶体的融合而导致自噬体积累，抑制自噬；其二，LC3在不同肿瘤中发挥的作用具有组织特异性，自噬深深融入到了细胞代谢、应激反应和细胞死亡的途径中，这些反应可能因不同细胞类型而有所差异[30]；其三，细胞自噬是一个复杂的过程，多条信号转导途径参与自噬水平的调节，并且细胞自噬可以在多种条件下被诱导，生长因子、细胞内氨基酸水平、葡萄糖水平、DNA损伤、氧自由基等均可诱导细胞自噬水平的变化，LC3BⅡ/Ⅰ的升高可能是受其他信号通路的调控[31-32]；其四，中医药治疗疾病遵循整体平衡观，其通过多环节、多靶点、多途径共同发挥作用。推测术芩总多糖可能直接调控或者通过作用于其他途径调控了LC3B蛋白的表达。当Beclin1蛋白被3-MA抑制时，LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表达升高的机制有待进一步研究。
4 结论环磷酰胺能使小鼠脾淋巴细胞增殖发育受损，可能通过激活过度的自噬导致Ⅱ型程序性细胞死亡，术芩总多糖能抑制过高的自噬，使淋巴细胞增殖能力增强。术芩总多糖通过调控Beclin1、LC3BⅡ/Ⅰ蛋白的表达，在自噬的起始和延伸阶段发挥作用。
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