磷是影响动物正常生长发育的一种重要的常量矿物元素。幼龄动物缺乏磷会出现佝偻病，而成年动物缺乏磷会出现软骨病；此外，磷还参与了动物体内氨基酸、脂类和碳水化合物等营养物质的消化代谢[1-3]。同时，磷也是一种价格较为昂贵的饲料原料[4]。研究发现，植物性饲料中的磷由于受到植酸的束缚，并不能被动物胃肠道完全消化吸收，未消化的磷主要以粪便的形式排放到体外，然后渗透到地表以及水体中，最终造成极其严重的环境污染[5]。因此，提高动物对饲料磷的消化利用效率，不但能降低动物的养殖成本，而且对减少环境污染也具有非常重要的意义。与单胃动物相比，反刍动物对植物性饲料中所含的磷具有较高的消化率。这主要是因为反刍动物拥有特殊的瘤胃器官，其中共生的微生物能够分泌大量的植酸酶，微生物植酸酶通过催化植酸水解，释放出其中所含的磷，从而促进宿主对饲料磷的消化[6]。
迄今为止，虽然已有许多关于瘤胃微生物结构和组成的研究报道[7-8]。但是人们对于瘤胃中能分泌植酸酶的微生物了解的并不太多，饲料磷的消化率与瘤胃微生物的结构与组成关系仍未知[9]。针对这些问题，本研究以山羊作为试验动物，通过消化试验筛选出饲料磷消化率不同的群体，然后采用16S rRNA高通量测序技术来比较不同磷消化率的山羊瘤胃微生物结构与组成的差异。研究结果将促进人们更清晰地认识瘤胃微生物与宿主磷消化率之间的关系，为通过调控瘤胃微生物区系来提高反刍动物对饲料磷的利用效率，以及植酸酶高产菌株的筛选等提供试验依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物与日粮选取28只10月龄，雌性，平均体重为(24.25±2.47)kg的努比亚黑山羊作为试验动物。试验在四川农业大学动物营养研究所试验基地进行，整个试验期山羊单笼饲养，每日饲喂量(干物质)按体重的3.5%供给，自由饮水。参照我国《肉羊饲养标准》(NY/T 816-2004)，以每天每头增重0.1 kg为标准配制日粮，日粮配方和营养水平详见表 1。
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表 1 日粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 The composition and nutrient level of the diet (dry matter basis) |
为了满足使用差量法计算山羊饲料磷真消化率的条件，整个试验由两个时期(Ⅰ期和Ⅱ期)组成，每个试验期由14 d预饲期和6 d消化试验期组成，每期20 d，共40 d。Ⅱ期试验与Ⅰ期试验相比，额外添加磷酸氢钙来提高日粮磷的含量。两期消化试验期间，每日收集山羊排泄的全部粪便，取粪便总量的10%，用10%盐酸固氮后贮存于-20 ℃。根据两期山羊的采食量和粪便排泄量，然后通过钒钼酸铵比色法测定饲料和粪便样品中的磷含量，采用差量法计算山羊对饲料磷的真消化率。试验结束的次日晨饲前2 h对每只山羊静脉采血20 mL，静置30 min后，4 000 r·min-1离心10 min，分离出血清，分装于1.5 mL的离心管中，置于－20 ℃冰箱保存备用。然后采用胃管法抽取山羊瘤胃内容物，主要过程：将10 mm直径聚氯乙烯管连接到一个真空泵(7 mbar)，用开口器打开羊的口腔，将聚氯乙烯管从羊口腔缓慢插入，直至瘤胃。打开真空泵电源，抽取瘤胃内容物，弃去混入大量唾液的初始瘤胃内容物，然后再抽取瘤胃内容物约50 mL装入充满氮气的样品袋中，置于冰上。反复拍打样品袋以确保固相微生物充分进入液相，然后用4层纱布过滤得到瘤胃液。迅速用pH计测定瘤胃液的pH[10]，最后将瘤胃液编号分装后贮存于-80 ℃，用于后期测定挥发性脂肪酸和提取微生物总DNA。
采用差量法计算公式计算28只山羊个体对饲料磷的真消化率：
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统计28只山羊对饲料磷真消化率的平均值及标准差，将磷真消化率大于群体平均值+0.5倍标准差的山羊作为高磷真消化率组(high true digestibility of phosphorus，HP)，磷真消化率小于群体平均值-0.5倍标准差的山羊作为低磷真消化率组(low true digestibility of phosphorus，LP)。
1.3 瘤胃液挥发性脂肪酸含量测定、微生物DNA提取和PCR扩增及高通量测序分别取各样品瘤胃液5 mL，按偏磷酸与瘤胃液1:5的比例加入25%偏磷酸溶液，4 ℃ 20 000 r·min-1离心10 min，取上清液运用气相色谱法测定挥发性脂肪酸总量和各酸的含量[12]。
采用前人描述的方法提取和纯化HP组和LP组山羊瘤胃液微生物总DNA[13]，主要过程为用细菌通用引物对:515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′，此处的M是简并碱基)和806R (5′-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3′，此处的V、S是简并碱基)，以瘤胃内容物菌群总DNA为模板，针对细菌16S rRNA基因的V4区用PCR仪扩增。PCR反应体系(50 μL)：5 U·μL-1 Taq酶0.25 μL，10×Buffer 5.0 μL，10 mmol·L-1 dNTPs 1.0 μL，10 μmol·L-1引物各1.25 μL，50 ng·μL-1模板DNA 1.0 μL，补ddH2O至50 μL。扩增反应条件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环30次；72 ℃ 5 min。PCR产物用含溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶电泳鉴定并用PCR纯化试剂盒纯化和回收。回收的PCR产物用QuantiFluorTM-ST fluorometer定量。送北京诺禾致源有限公司构建文库，利用Illumina MiSeq测序平台上机测序。
1.4 高通量测序数据生物信息学分析测序平台得到的原始数据依次用QIIME 1.8.0软件质控、Mothur软件拼接，并进行Tags过滤和剔除嵌合体[14-16]。然后使用Uclust[17]聚类算法将序列聚类为OTU (operational taxonomic units)，并使用RDF分类器对OTU的代表序列从门到属进行物种注释。基于OTU table和rep_set. tree文件及抽样的最大深度，绘制OTU稀释曲线并计算α多样性指数。结合各样品的OTU种类及其丰度进行计算，获得样品间Unweighted unifrac距离矩阵，利用加权组平均法(UPGMA)进行聚类分析，绘制PCoA聚类图[18]；根据门和属水平上物种的结构和组成，用OriginPro 9.0和R x64 3.0.2软件绘制门水平优势菌属柱状图和共享属聚类热图。基于16S rRNA扩增子测序结果，用PICRUSt(Phylogenetic Investigation of Communities byReconstruction of Unobserved States)，通过比对KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http://www.genome.jp/kegg/)数据库，对瘤胃微生物的基因进行功能预测，并挑选参与主要功能通路的基因，对其相对丰度进行组间差异性分析[19]。
1.5 数据分析采用SPSS18.0统计软件，对LP组和HP组之间磷的真消化率、细菌相对丰度等数据的差异性进行独立样本t检验，将P < 0.05视为差异显著，P < 0.01视为差异极显著。对于组间差异显著的微生物，用其相对丰度与宿主对饲料磷的真消化率进行相关性分析。
2 结果 2.1 磷真消化率不同山羊的瘤胃发酵参数、血液生化指标和营养物质表观消化率比较本试验测定的28只山羊对日粮磷真消化率的平均值为(78.61±7.65)%，变异系数(CV)为9.73%。用“1.2”中所描述的分组方法，HP和LP组从群体中各挑选出了6只山羊，两组饲料磷的真消化率分别为(89.20±0.01)%和(68.95±0.05)%，组间差异极显著(P < 0.01)。山羊瘤胃发酵指标见表 2，瘤胃pH和挥发性脂肪酸浓度在HP与LP组间差异均不显著(P>0.05)。由表 3可知，HP组山羊血液磷含量显著高于LP组(P < 0.05)，而血液钙和碱性磷酸酶含量组间差异不显著(P>0.05)。从表 4可知，HP和LP组山羊营养物质表观消化率(干物质、粗脂肪、粗蛋白、酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维)组间差异均不显著(P>0.05)。
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表 2 HP和LP组山羊瘤胃发酵参数比较 Table 2 Comparison of rumen fermentation parameters between HP and LP groups in goats |
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表 3 HP和LP组山羊血液生化指标比较 Table 3 Comparison of blood biochemical indexes between HP and LP groups in goats |
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表 4 HP和LP组山羊营养物质表观消化率比较 Table 4 Comparison of apparent digestibility of nutrients between HP and LP groups in goats |
本次测序共获得915 084条有效序列，平均每个样品含有(76 257±4 976)条序列。基于相似度大于97%的原则，将获得的有效序列进行聚类，共获得5 777个OTU，不考虑处理效应，平均每个样品含(2 343±129)个OTU。其中HP组有3 608个OTU，LP组4 037个，两组间共享的OTU有1 868个(图 1)。
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图 1 OTU维恩图 Figure 1 OTU venn diagram |
样品稀释曲线如图 2所示，在本次试验的测序深度下，各条曲线最终均趋于平缓，说明本次试验的测序量足以覆盖各样品中的绝大多数微生物。在相同测序深度下，OTU数由高到低的HP内样品依次为HP3、HP5、HP2、HP6、HP4和HP1，而LP组内各样品OTU数由高到低的分别为LP5、LP1、LP3、LP4、LP6和LP2。
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图 2 各样品的稀释曲线 Figure 2 Rarefaction curves of each sample |
Alpha多样性指数主要用于评价样品中微生物的丰富性和均匀性。表 5列出了山羊HP组和LP组样品的PD_whole_tree指数、Chao 1指数和Shannon指数。由表 5可以看出，在同一测序深度下(15 230条序列)，LP组的Alpha多样性指数在数值上均大于HP组，其中LP组Shannon指数显著大于HP组(P < 0.05)。
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表 5 组间α多样性指数的差异性比较 Table 5 Comparison of alpha diversity indices between the two groups |
根据样本的OTU种类及其相对丰度，通过计算各个样本间加权遗传距离矩阵绘制PCoA聚类图。由图 3可知，LP组样品依据其组别聚集在一起，表明LP组内相似性比组间相似性高；HP组样品并没有依据其组别而表现出明显的组内聚集，说明LP组组内个体间微生物结构与组成的相似度高于HP组。
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图 3 PCoA聚类分析 Figure 3 Cluster analysis by Principal Co-ordinate Analysis |
将试验所得的有效序列在不同分类水平上进行物种注释和统计，本次试验在门水平上共注释得到24种菌。拟杆菌门和厚壁菌门在两组中均为优势菌门，其在HP组和LP组中的相对丰度依次分别为(65.99±6.25)%和(26.97±4.69)%、(59.62±5.92)%和(32.57±5.81)%。两个处理组中，相对丰度大于0.1%的菌门共有10个，它们在组间的差异性均不显著(P>0.05)，其在门水平上的菌群组成见图 4。
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图 4 山羊瘤胃微生物在门水平上的菌群组成 Figure 4 Composition of microbial at phylum level of rumen microorganism in goats |
属水平上，两组共注释得到187种菌，基于菌属种类多且部分菌属的相对丰度较低，本次仅对相对丰度大于0.1%的30个菌属进行了组间差异分析。结果表明，共有10个菌属的相对丰度在组间存在显著性(P < 0.05)或极显著(P < 0.01)差异，详见表 6。其中，HP组的Ruminococcaceae_UCG-010、Ruminococcus_2、Ruminococcaceae_NK4A214_group、Saccharofermentans、Ruminococcaceae_UCG-014、Butyrivibrio和Clostridium等7个属的相对丰度显著(P < 0.05)或极显著(P < 0.01)低于LP组，Prevotella、Desulfovibrio和Selenomonas等3个属显著高于LP组(P < 0.05)。通过对磷的真消化率与组间差异菌属的相对丰度进行相关性分析，结果发现，磷的真消化率与Ruminococcaceae_UCG-010(r=－0.621, P < 0.05)、Ruminococcus_2(r=－0.746, P < 0.01)、Ruminococcaceae_UCG-014(r=－0.865, P < 0.01)、Butyrivibrio(r=－0.654, P < 0.05)和Clostridium(r=－0.714, P < 0.01)的相对丰度显著负相关；与Prevotella (r=0.862, P < 0.01)和Selenomonas (r=0.824, P < 0.05)的相对丰度显著正相关(表 6)。
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表 6 组间差异显著的微生物相对丰度与磷真消化率的相关性分析 Table 6 The correlation between phosphorus true digestibility and the relative abundance of microorganism with significant difference between HP and LP groups at genera level |
HP组和LP组组间共有90个共享属，相对丰度大于0.5%的共享属有23个，其共享属聚类图见图 5。由图 5可看出，除HP2、HP4、LP2和LP6外，其它各个样品依据所处组别的不同而相互聚类到一起，表明组内共享菌群相似性比组间相似度高。由系统发育树可以看出，HP组中HP1和HP2、HP3和HP6分别聚为一簇，LP组中LP1和LP5、LP3和LP4分别聚为一簇，它们的菌群相似度相对高于同组内其它样品。
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横坐标为组名，纵坐标为微生物的相对丰度。越偏蓝色表示相对丰度越高，越偏绿色表示相对丰度越低 The abscissa is the group name and the ordinate is the relative abundance of the microorganism. The closer to blue, the higher relative abundance, while the closer to green, the lower relative abundance 图 5 HP和LP组山羊瘤胃共享菌群在属水平上的聚类热图 Figure 5 Log-scaled percentage heatmap of shared flora at the shared-genus level between HP and LP groups in goats |
基于本次试验16S rRNA扩增子的测序结果，用PICRUSt对山羊瘤胃微生物的基因进行功能预测，图 6展示了相对丰度大于1%的功能基因，这些基因的丰度之和分别占HP组和LP组总基因丰度的97.18%和97.24%。相对丰度从高到低的基因功能依次为氨基酸代谢、碳水化合物代谢、复制和修复、膜转运、翻译、能量代谢等，这些基因的相对丰度在组间的差异均不显著(P>0.05)。
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横坐标为组名，纵坐标为功能基因的相对丰度。越偏蓝色表示相对丰度越高，越偏红色表示相对丰度越低 The abscissa is the group name and the ordinate is the relative abundance of the functional genes. The closer to blue, the higher relative abundance, while the closer to red, the lower relative abundance 图 6 功能基因聚类热图 Figure 6 Log-scaled percentage heatmap of the functional genes |
由于反刍动物唾液和消化道内源磷的存在，以往采用表观消化率这个指标严重低估了动物对饲料磷的真实消化吸收情况[20]。与磷的表观消化率相比，真消化率更能真实且准确地反映出动物机体对磷的消化吸收效率[21]。因此，本研究采用差量法测定了山羊对饲料磷的真消化率。本试验中，两期日粮磷的水平分别为2.2和3.3 g·kg-1DM，磷的供给量低于中国肉羊饲养标准中磷的推荐量(3.5 g·kg-1DM)；两期试验日粮的原料组成及养分含量也基本相同。因此，本试验满足采用差量法测定饲料磷真消化率的条件。本研究中，山羊对饲料磷的真消化率平均值为78.61%，高于以往单胃动物猪[22]和鸡[23]的测定结果，最主要的原因是由于反刍动物瘤胃微生物能够分泌植酸酶，将饲料中与植酸结合的磷释放出来，从而有利于反刍动物对饲料磷的消化吸收[24]。
研究表明，动物对饲料磷的消化利用效率主要受饲料磷的来源、磷的水平、钙磷比和饲粮植酸的水平等因素的影响[25-26]。但本试验结果发现，饲喂相同饲粮，且遗传背景相同的山羊，饲料磷的真消化率也存在显著的个体差异，这在以往的研究中还未见详细的报道。但前人研究发现，给遗传背景一致的肉牛饲喂同一饲粮，其消化利用效率存在显著的个体差异[27]。因此，磷作为饲粮中一种必不可少的组分，其真消化率存在显著的个体差异也应该是一种正常现象。
Azeem等[28]研究发现，在猪日粮中加入植酸酶，猪对菜籽粕和豆粕中磷的消化率均提高约30%。Kincaid等[29]在奶牛日粮中添加植酸酶，奶牛血液中的磷含量显著增加。Knowlton等[30]研究发现，添加植酸酶能显著提高奶牛磷的消化率，减少粪便中磷的含量。在本研究中，HP组山羊血液磷含量显著高于LP组，这可能是由两组山羊瘤胃中微生物结构与组成的差异造成的，因为反刍动物瘤胃微生物自身能够分泌大量的植酸酶催化植酸的水解，释放日粮中以植酸磷形式存在的磷，提高宿主对日粮植物磷的消化率，减少动物粪便中磷的含量[31-34]。但由于研究技术的限制，到目前为止，已鉴定出的产植酸酶的瘤胃微生物种类很有限，主要有双歧杆菌(Bifidobacterium sp.)[35]、希瓦氏菌属(Shewanella sp.)[36]、左旋乳酸芽孢杆菌(Bacillus laevolacticus)[37]。此外，Yanke等[31]还发现，反刍兽新月形单胞菌属(Selenomonas sp.)、密螺旋体属(Treponema sp.)、普雷沃氏菌属(Prevotella sp.)也能够分泌植酸酶。其中，反刍兽新月形单胞菌属中96%的菌株都具有植酸酶分泌活性，植酸酶活性高且变异较大。本研究中，HP组Prevotella和Selenomonas的相对丰度显著高于LP组，且两者的相对丰度均与磷真消化率呈显著的正相关，说明Prevotella和Selenomonas可能是尚未被人们认识的能分泌植酸酶的细菌。
本研究中，组间差异显著的菌属中HP组Prevotella和Selenomonas的相对丰度显著高于LP组(P < 0.05)，并且与磷的真消化率呈显著正相关。而其余8个差异菌属中，除溶纤维丁酸弧菌属(Butyrivibrio)，其它7个菌属的相对丰度均是LP组较高，并且与磷的真消化率呈负相关。令人惊奇的是，与磷真消化率呈正相关的菌属(Prevotella和Selenomonas)均是瘤胃中最主要的淀粉降解菌；而与磷真消化率呈负相关的菌属，它们主要为纤维降解菌，如瘤胃球菌属(Ruminococcus)、溶纤维丁酸弧菌属(Butyrivibrio)和和梭菌属(Clostridium)等。以往的研究发现，瘤胃微生物分泌的植酸酶活性随日粮中粗饲料比例的增加(精料比例的降低)而降低[38]。这可能是由于日粮中粗饲料含量较高时，瘤胃环境更有利于纤维降解菌的生长和繁殖，纤维降解菌的相对比例会升高。而瘤胃微生物区系作为一个动态的调节系统，微生物之间存在着竞争抑制作用，纤维降解菌相对比例的升高一定程度上会引起其他菌群的比例降低，如淀粉降解菌Prevotella和Selenomonas，最终导致植酸酶的分泌量减少、活性降低。由此可见，瘤胃中纤维降解菌的相对丰度较高可能会竞争性抑制分泌植酸酶的微生物的生长和繁殖，从而会减少植酸酶的产量，降低宿主对磷的消化利用效率。本研究未检测瘤胃中微生物植酸酶的活性以及含量。因此，目前尚不能确定瘤胃微生物是否是通过调控微生物植酸酶的分泌量或活性来促进磷的消化。但是，本研究发现了瘤胃微生物的结构与组成与山羊磷真消化率的关联性，这为今后研究调控微生物以促进磷的消化利用提供了崭新的思路。
本研究中，拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)在瘤胃微生物中均为优势菌，这与以往研究结果一致[39-40]。但是，以往在牛上的研究发现，Firmicutes在瘤胃微生物中处于绝对优势地位[41-42]。出现这种差异的原因可能是，瘤胃微生物的最优菌门可能与反刍动物日粮中精料和粗料的比例有关。因为有研究发现，日粮是影响瘤胃微生物结构与组成的最主要因素，随日粮中粗饲料的比例升高，瘤胃中厚壁菌门的比例会随之升高[43]。
4 结论不同饲料磷真消化率的山羊瘤胃微生物的结构存在着显著差异，部分瘤胃微生物的相对丰度与山羊对饲料磷的真消化率之间存在显著的相关性；山羊对饲料磷的消化率越高，瘤胃中Prevotella和Selenomonas的相对丰度越高，Ruminococcaceae_UCG-010、Ruminococcus_2、Ruminococcaceae_UCG-014、Butyrivibrio和Clostridium的相对丰度越低。
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