畜牧兽医学报  2018, Vol. 49 Issue (12): 2593-2601. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2018.12.008    PDF    
引用本文
张云生, 杨宇泽, 郭占宝, 谢明, 常卓, 张智英, 侯水生. 高低剩余采食量北京鸭品系皮脂蛋白质组差异研究[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(12): 2593-2601.  
ZHANG Yun-sheng, YANG Yu-ze, GUO Zhan-bao, XIE Ming, CHANG Zhuo, ZHANG Zhi-ying, HOU Shui-sheng. Study on Differential Expression of Proteome in Sebum between High and Low Residual Feed Intake Strains of Pekin Ducks[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2018, 49(12): 2593-2601.  
高低剩余采食量北京鸭品系皮脂蛋白质组差异研究
张云生1,2, 杨宇泽3, 郭占宝1, 谢明1, 常卓3, 张智英2, 侯水生1     
1. 中国农业科学院 北京畜牧兽医研究所, 北京 100193;
2. 西北农林科技大学 动物科技学院, 杨凌 712100;
3. 北京市畜牧总站, 北京 100101
收稿日期：2018-04-17
基金项目：国家水禽产业技术体系（CARS-42）
作者简介：张云生(1983-), 男, 陕西岐山人, 博士, 主要从事北京鸭育种工作, E-mail:zhangyunsheng0902@126.com;
杨宇泽(1982-), 男, 山西平鲁人, 高级畜牧师, 主要从事畜禽遗传资源开发与利用研究, E-mail:yyz84929056@126.com.
通信作者：张智英, 教授, E-mail:zzhang888@gmail.com; 侯水生, 研究员, E-mail:houss@263.net.
二者为共同第一作者
摘要：旨在对高、低剩余采食量（RFI）北京鸭品系皮脂蛋白质组分进行比较分析，揭示不同RFI品系间脂肪沉积差异的分子机制。本研究以相同条件下饲养的高、低RFI品系各12只6周龄的北京鸭皮脂为研究对象，利用iTRQA技术和生物信息学方法分析6周龄北京鸭皮脂的蛋白质组分差异。结果共鉴定到859种蛋白质，以表达量差异1.5倍以上的作为显著差异蛋白，共发现差异表达蛋白59个，其中在低RFI品系中高表达的蛋白34个，在高RFI品系中高表达蛋白25个；GO分析结果表明，差异蛋白主要参与有机酸代谢、脂类应答、脂类合成等过程；蛋白网络互作分析发现，参与脂质代谢过程的差异表达蛋白数量最多；qRT-PCR分析了3个编码差异蛋白基因的表达量，结果与蛋白表达量一致。脂肪酸合酶、围脂滴蛋白、载脂蛋白以及脂肪酸结合蛋白在高RFI品系皮脂中高表达，提高了高RFI品系北京鸭的脂肪沉积能力。该试验结果为进一步研究不同RFI品系北京鸭皮脂差异的分子机制奠定了基础。
关键词：北京鸭    RFI    蛋白质组    iTRAQ    
Study on Differential Expression of Proteome in Sebum between High and Low Residual Feed Intake Strains of Pekin Ducks
ZHANG Yun-sheng1,2, YANG Yu-ze3, GUO Zhan-bao1, XIE Ming1, CHANG Zhuo3, ZHANG Zhi-ying2, HOU Shui-sheng1     
1. Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China;
2. College of Animal Science and Technology, Northwest A & F University, Yangling 712100, China;
3. Beijing General Station of Animal Husbandry, Beijing 100101, China
Abstract: The study aimed to compare and analyze the sebum protein components of high and low residual feed intake (RFI) Pekin duck strains, and to reveal the molecular mechanism of fat deposition differences among different RFI strains. In this paper, the sebum of 12 Pekin ducks in high RFI line and 12 Pekin ducks in low RFI line of 6 weeks old were selected as experimental material, then the protein components in sebum of different RFI strains were analyzed by using the iTRAQ proteomics and bioinformatics mathods. The results showed that a total of 859 proteins were identified, 25 proteins were highly expressed in high RFI strain, and 34 proteins were highly expressed in low RFI strain; GO analysis showed that differentially expressed proteins were mainly involved in organic acid metabolism, lipid response, lipid synthesis, and so on; Protein network interaction analysis found that the number of differentially expressed proteins involved in the lipid metabolism process was the highest; The expression of 3 genes coding differentially expressed proteins were analyzed by qRT-PCR, and the results were consistent with the corresponding proteins expression. The results showed that fatty acid synthase, lipid droplet protein, apolipoprotein and fatty acid binding protein were highly expressed in the sebum of ducks in high RFI strain, which improved the fat deposition ability of Pekin ducks in high RFI strain. The results of this experiment lay the foundation for further study of the molecular mechanism of differences in sebum of ducks of different RFI strains.
Key words: Pekin duck     RFI     proteomics     iTRAQ    

北京鸭具有生长速度快和育肥快的特点，因此北京烤鸭也是驰名中外的佳肴。但是随着人们对健康食品需求的增加，低皮脂率的北京鸭越来越受到大众的欢迎，因此选择胴体脂肪含量适宜的北京鸭品种就非常必要。鸭皮脂率的高低与鸭胸肉中的脂肪含量呈正相关，鸭肉中过低的脂肪含量会影响鸭肉的风味和口感，而较高的脂肪含量会改善肉的风味和品质，因此需要对北京鸭的脂肪含量进行不同方向的选择，以满足人们对不同风味鸭肉的需求。鸭肉脂肪含量的高低取决于日粮组成、血浆激素水平等因素[1-4]。瘦肉型和肉脂型品种间的差异主要由代谢过程驱动[5-6]。瘦肉型和肉脂型鸭保存能量的方式也有很大的差异，瘦肉型主要通过增加蛋白质的沉积保存能量，而肉脂型则优先使用饲料能量来进行脂肪组织的合成[7]。

Koch等[8]首次提出以剩余采食量(residual feed intake, RFI)作为评价动物个体饲料转化效率的指标。研究表明，与高RFI猪相比，低RFI猪的胴体水分和脂肪含量较低，但是蛋白含量略高[9-10]；猪腰部更大、背膘更薄，瘦肉率更高[11-15]。Begli等[16]研究表明，RFI性状的育种值与鸡F2群体的体重腹脂率等显著相关，与胸肌率呈负相关。Zhang等[17]研究表明，RFI与北京鸭的皮脂率呈显著正相关。因此，本研究对北京鸭的RFI性状进行了连续3个世代的选择，形成了两个胴体脂肪含量差异显著的北京鸭品系。为了更清楚的了解不同RFI品系北京鸭脂肪沉积能力差异的原因，本试验采用了iTRAQ蛋白质定量技术和生物信息学技术分析了不同RFI品系的北京鸭皮脂蛋白质组分，为进一步研究北京鸭脂肪的沉积机制奠定基础。

1 材料与方法 1.1 试验材料

试验所用不同品系北京鸭由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所种鸭场提供。高、低RFI品系各100只雄性雏鸭，同条件下饲养6周，然后各品系随机选取12只取皮脂，液氮保存备用。

主要试剂：iTRAQ®Reagent-8Plex Multiplex Kit(Applied Biosystem)；strata-X C18除盐柱(phenomenex)；SCX强阳离子交换柱(phenomenex Luna SCX 100A)；R6834RNA试剂盒(Omega美国)；Thermo First cDNA合成试剂盒(SinoGene中国)

1.2 方法 1.2.1 不同RFI品系北京鸭皮脂蛋白提取消化

将皮脂样品在液氮中磨成粉，然后加入4倍体积的预冷丙酮沉淀2 h，20 000 g离心30 min，收集沉淀，重复2次上述操作；然后加入TEAB溶解蛋白。采用Bradford方法定量总蛋白。高RFI组和低RFI组分别等量混合12只个体的皮脂蛋白。

1.2.2 不同RFI品系北京鸭皮脂蛋白iTRAQ标记及肽段分离

提取的总蛋白进行酶切除盐。根据iTRAQ试剂操作手册步骤进行操作。两份样品分别用113和114 iTRAQ试剂标记。

1.2.3 不同RFI品系北京鸭皮脂部分差异蛋白编码基因的实时定量PCR分析

使用总RNA提取试剂盒从皮脂中制备总RNA，然后根据生产商提供的使用说明书利用Thermo First cDNA合成试剂盒(SinoGene，中国)进行cDNA合成。使用实时PCR检测系统(Applied Biosystems StepOnePLUS)进行实时定量PCR。

选取部分差异蛋白的编码基因，分析其mRNA在鸭高、低RFI品系皮脂中的表达量。应用Primer premier5.0软件设计差异表达基因实时定量PCR引物序列(表 1)。用β-actin基因对样品进行标准化，然后使用2-ΔΔCt方法计算倍数变化，应用SPSS软件进行组间差异显著性检验。

表 1 差异表达基因实时定量PCR引物序列 Table 1 The primer sequence for real-time PCR of the differentially expressed genes
1.3 质谱检测与数据处理

将样品应用LC-MS-MS进行检测，然后用ProteinPilot软件分析质谱数据，并对蛋白质组iTRAQ定量，差异倍数达到1.5倍视为显著差异表达蛋白。运用GO富集分析对差异表达蛋白进行分析，选择GO(Gene Ontology)的生物过程、细胞成分和分子功能注释对蛋白进行分类。利用SING在线软件对差异蛋白进行网络互作分析。

2 结果 2.1 高、低RFI品系北京鸭皮脂差异表达蛋白及GO分析

在北京鸭皮脂中鉴定到了859个蛋白，选择表达量差异1.5倍以上的作为显著差异标准，共发现59个差异表达蛋白，其中在低RFI品系中高表达的蛋白34个，在高RFI品系中高表达蛋白25个(表 2)。

表 2 低RFI与高RFI北京鸭皮脂之间差异表达蛋白 Table 2 The differentially expressed proteins identified in the sebum of the low RFI and high RFI Pekin ducks

对皮脂中差异表达蛋白进行GO分析，结果表明，在细胞组分本体中，差异表达蛋白主要分布于中间丝状体、细胞骨架、包围区域、细胞连接以及线粒体(图 1 A)；在生物学过程本体中，差异蛋白主要包括组织发育、有机酸代谢、脂类应答、脂类合成、角质化、上皮细胞分化等生物学过程(图 1B)；在分子功能本体中，差异表达蛋白主要参与离子结合、氧化还原、细胞骨架构成、裂解酶活性等生物学功能(图 1 C)。

A.细胞组分；B.生物学过程；C.分子功能 A.Cellular component; B.Biological process; C. Molecular function 图 1 皮脂差异蛋白质GO分析 Figure 1 Gene ontology (GO) analysis of differential proteins in sebum
2.2 高、低RFI品系北京鸭皮脂差异表达蛋白网络互作分析

大部分的单个蛋白质只是作为活性细胞中较大蛋白质复合物的基本组成部分，蛋白质之间需要相互协作才能发挥出相应的生物学功能。因此，这些差异丰度蛋白很可能就是蛋白质-蛋白质相互作用中具有各种关系的关键节点蛋白，本研究应用STRING 10.5在线工具分析了差异表达蛋白之间的相互作用，不同RFI品系鸭皮脂差异表达蛋白之间的互作分析见图 2。差异表达蛋白主要参与脂肪代谢、碳水化合物代谢、核苷酸代谢、粘连锚定以及离子、维生素结合等功能。

红色表示基因融合迹象，绿色表示相邻迹象，蓝色表示共同迹象，紫色表示试验迹象，黄色表示文本挖掘迹象，浅蓝色表示数据库迹象，黑色表示共表达迹象，浅紫色表示蛋白质同源性 Red indicates gene fusions evidence, green indicates neighborhood evidence, blue indicates co-occurrence evidence, purple indicates experimental evidence, yellow indicates text-mining evidence, light blue indicates database evidence, black indicates co-expression evidence, light purple indicates protein homology 图 2 不同RFI鸭群体皮脂差异表达蛋白生物学互作网络 Figure 2 Biological interaction network of the differentially expressed proteins in sebum of the low RFI and high RFI Pekin ducks
2.3 高、低RFI品系北京鸭部分皮脂差异表达蛋白编码基因qRT-PCR分析

利用qRT-PCR方法测定6周龄高低RFI北京鸭品系皮脂中脂肪酸合酶(FASN)、脂肪酸结合蛋白(FABP1)、围脂滴蛋白(PLIN)mRNA表达水平(图 3)。由图 3可以看出，高RFI品系北京鸭的脂肪酸合酶、脂肪酸结合蛋白和围脂滴蛋白对应基因的mRNA表达水平均显著高于低RFI品系(P < 0.05)。表 2结果显示, 上述3个的蛋白在高RFI品系北京鸭中的表达量均高于低RFI品系。表明不同RFI品系北京鸭脂肪酸合酶、脂肪酸结合蛋白以及围脂滴蛋白编码基因的mRNA表达水平与蛋白质表达水平一致。

同一组数据不同字母表示差异显著 The different letters indicate the significant difference between low and high RFI lines 图 3 北京鸭不同RFI品系FASN、FABP1、PLIN基因mRNA实时定量PCR分析 Figure 3 Validation of FASN, FABP1, PLIN at the mRNA level by quantitative real-time PCR analysis in sebum of different RFI line Pekin ducks
3 讨论

脂肪酸合成和沉积是一个复杂的生物学过程，在这个过程中需要多种蛋白质参与。研究表明，脂肪酸合酶是一种催化脂肪酸合成的多酶蛋白，其主要功能是在NADPH存在下催化合成长链饱和脂肪酸、乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A[18]，这种机制是将丙二酰辅酶A中的两个碳单元依次加入生长脂肪酸链；乙酰辅酶A酰基转移酶在许多重要的生化途径中具有关键的作用[19]，其中就包括β-羟基丁酸、类固醇等各种生物合成途径。乙酰辅酶A酰基转移酶超家族酶可以通过硫脂依赖性克莱森凝聚反应机理催化碳-碳键的形成，而碳-碳键的形成是生成脂肪酸和聚酮化合物生物合成途径中的关键步骤。这些蛋白均在高RFI品系北京鸭的皮脂中高表达，表明高RFI品系北京鸭的脂肪合成能力要强于低RFI品系北京鸭。

载脂蛋白是一组载脂蛋白家族，载脂蛋白C家族是乳糜微粒，为极低密度脂蛋白(VLDL)和高密度脂蛋白(HDL)的表面组分，在吸收膳食脂肪期间，载脂蛋白优先分布到富含三酰甘油的乳糜微粒和VLDL[20]。基础脂肪酸结合蛋白是脂肪酸和其他亲脂性物质如类花生酸和类视黄醇的转运蛋白家族[12, 21-23]，这些蛋白质被认为可以促进脂肪酸在细胞外和细胞膜之间的转移[24]，该家族成员的过氧化物酶增殖受体(PPAR)被认为可以将亲脂性分子从外细胞膜转运到特定的细胞内受体。在人类中，围脂滴蛋白是与脂肪细胞脂滴相关的最丰富的蛋白质[25]。围脂滴蛋白包裹在脂肪细胞中脂滴的周围，对脂肪组织存储脂滴有着重要的作用[26]。围脂滴蛋白可作为人体天然脂肪酶的保护性涂层，如激素敏感性脂肪酶，将三酰甘油分解为甘油和游离脂肪酸，用于代谢过程，而围脂滴蛋白可以减缓对脂肪酸的分解[27]，对脂肪的沉积具有重要的作用。综上所述，与脂肪合成和沉积相关的重要蛋白质，如脂肪酸合酶、载脂蛋白、基础脂肪酸结合蛋白、围脂滴蛋白、乙酰辅酶A乙酰转移酶等蛋白在高RFI北京鸭品系中高表达表明, 高RFI品系北京鸭具有比低RFI品系北京鸭更强的脂肪沉积能力。

4 结论

本研究对高、低RFI北京鸭品系差异蛋白质组学研究发现，差异表达蛋白中参与脂质代谢过程的蛋白数量最多，主要参与有机酸代谢、脂类应答、脂类合成等生物学过程；其中脂肪酸合酶、围脂滴蛋白、载脂蛋白以及脂肪酸结合蛋白在高RFI品系北京鸭皮脂中高表达，是高RFI品系北京鸭脂肪沉积能力较强的重要原因。

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