畜牧兽医学报  2018, Vol. 49 Issue (11): 2529-2534. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2018.11.026    PDF    
引用本文
吕艳, 翟国莲, 常江艳, 石莲琴, 元正菊, 赵焕云, 邹丰才, 段博芳. 云南部分地区猫血巴尔通氏体感染状况的监测[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(11): 2529-2534.  
LÜ Yan, ZHAI Guo-lian, CHANG Jiang-yan, SHI Lian-qin, YUAN Zheng-ju, ZHAO Huan-yun, ZOU Feng-cai, DUAN Bo-fang. Surveillance of Cat Haemobartonella felis in Some Areas of Yunnan Province[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2018, 49(11): 2529-2534.  
云南部分地区猫血巴尔通氏体感染状况的监测
吕艳1,2, 翟国莲3, 常江艳1, 石莲琴1, 元正菊4, 赵焕云2, 邹丰才1, 段博芳2     
1. 云南农业大学动物医学院, 昆明 650201;
2. 云南省动物疫病预防控制中心, 昆明 650201;
3. 永德县动物卫生监督所, 永德 677600;
4. 云南省畜牧兽医科学院, 昆明 650224
收稿日期：2018-01-11
基金项目：家畜疫病病原生物学国家重点实验室开放基金（SKLVEB2017KFKT008）
作者简介：吕艳(1989-), 女, 云南玉溪人, 硕士, 主要从事兽医寄生虫病及寄生虫学研究, E-mail: LV810YAN@163.com
通信作者：段博芳(1986-), 女, 云南大理人, 兽医师, 硕士, 主要从事动物疫病防控监测研究, E-mail:duanbofang@126.com
摘要：为获悉云南省部分地区猫血巴尔通氏体的感染情况，采集来自云南省部分地区猫血液样品338份，PCR扩增猫血巴尔通氏体的16S rRNA基因，通过测序、序列比对分析、构建进化树，确定所检获的猫血巴尔通氏体种属关系。结果有21个样本确定为猫血巴尔通氏体感染阳性，总体感染率为6.21%（21/338），其中检测20份样品为猫小型血巴尔通氏体，1份样品为猫大型血巴尔通氏体。对不同养殖模式和不同年龄进行感染因素分析，表明感染率在不同养殖模式和不同年龄段之间有显著的差异（P < 0.05）。本研究首次报道了云南省部分地区猫体内存在猫血巴尔通氏体的感染，为云南省猫血巴尔通氏体病的防控提供了数据参考。
关键词：猫血巴尔通氏体    16S rRNA    流行病学调查    
Surveillance of Cat Haemobartonella felis in Some Areas of Yunnan Province
LÜ Yan1,2, ZHAI Guo-lian3, CHANG Jiang-yan1, SHI Lian-qin1, YUAN Zheng-ju4, ZHAO Huan-yun2, ZOU Feng-cai1, DUAN Bo-fang2     
1. College of Veterinary Medicine, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China;
2. Yunnan Province Center for Animal Disease Control and Prevention, Kunming 650201, China;
3. Health Supervision Institute of Yongde County, Yongde 677600, China;
4. Yunnan Animal Science and Veterinary Institute, Kunming 650224, China
Abstract: The present study was to examine the prevalence of Haemobartonella felis infections in cats from some areas of Yunnan province, a total of 338 fresh blood were collected and was detected using PCR amplification of the 16S rRNA gene, and the product of PCR were sequenced and compared the phylogenetic analysis. Results showed that 21 samples were positive, and the overall prevalence of H. felis was 6.21% (21/338). Twenty samples were infected with Candidatus Mycoplasma haemominutum, and one sample was infected with Mycoplasma haemofelis. Analysis of influences factors showed that there was a significant difference between breeding mode and age (P < 0.05). The present investigation firstly report of the H. felis infection in cat in Yunnan and the study provide the basic data for preventing and controlling H. felis infection in cats from Yunnan Province.
Key words: Haemobartonella felis     16S rRNA     epidemiological survey    

猫血巴尔通氏体(Haemobartonella felis, H. felis)是引起猫传染性贫血的一种血液原虫，主要寄生于猫红细胞表面，该病主要感染猫，呈急性和亚急性慢性发病等。患病动物通常呈现贫血、黄疸、血红蛋白尿等症状，但慢性感染时临床症状不明显[1], 主要通过输血、吸血昆虫叮咬或经过卵将病原传播给下一代[2]。1953年Flint和Moss[3]首次报道猫血巴尔通氏体之后，2010年在我国广州地区有猫血巴尔通氏体感染的相关报道[4]。

到目前为止，基于猫血巴尔通氏体16S rRNA基因序列的种系发育鉴定，猫血巴尔通氏体有3个病原株：猫大型血巴尔通氏体(Mycoplasma haemofelis，Mhf，又叫Haemobartonella felis，H. felis)、猫小型血巴尔通氏体(Candidatus Mycoplasma haemominutum，CMhm)及Candidatus Mycoplasma turicensis(CMt)[5-6]。研究发现，猫小型血巴尔通氏体在猫中感染率较高且较为普遍，而猫大型血巴尔通氏体感染率较低且致病性强，Candidatus Mycoplasma turicensis感染率及致病性相对较弱[7-8]。针对云南地区猫感染猫血巴尔通氏体的情况尚缺乏报道。

本研究采用PCR扩增猫血巴尔通氏体16S rRNA基因序列，通过序列分析及系统发育进化树的构建，获悉云南地区猫血巴尔通氏体的流行情况，为云南猫中猫血巴尔通氏体病的防治提供理论依据和数据信息。

1 材料与方法 1.1 材料来源

2016年1月至2017年10月从云南昆明市某宠物医院、玉溪市某宠物医院、版纳州勐腊县、红河州金平县、临沧市沧源县5个地区采集无菌抗凝猫血液样品338份，样品信息见表 1。

表 1 样品信息表 Table 1 The sample information
1.2 DNA提取

DNA提取参照TIANGEN血液基因组DNA提取试剂盒，按照试剂盒操作进行(试剂批号：Q5612)，DNA于-20 ℃保存备用。

1.3 猫血巴尔通氏体种类的初步鉴定

采用Jensen等[9]的方法进行PCR扩增，该方法能鉴别区分猫体内感染猫大型血巴尔通氏体(H. helis/Large-form，Mycoplasma haemofelis)和猫小型血巴尔通氏体(H. felis/Small-form，Candidatus Mycoplasma haemominutum)的感染，预计扩增片段大小分别为170和193 bp。引物序列如下，352-F:5'-ACGAAAGTCTGATGGAGCAATA-3'，544-R：5'-ACGCCCAATAAATCCG(A/G)ATAATPCR-3'，扩增体系：总体积25 μL，其中Premix-Taq 12.5 μL, 引物浓度为50 μmol·L-1，DNA标准模板2 μL，加水至25 μL，PCR反应条件：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，共45个循环；最后72 ℃再延伸5 min。其中阳性对照样品来自于本实验室保存样，阴性对照为无菌水。

1.4 16S rRNA基因的扩增

检测得到的1份猫大型血巴尔通氏体感染根据2014年Aquino等[10]报道的PCR方法扩增，完成猫血巴尔通氏体病原体16S rRNA大于1 000 bp的测序检测，PCR扩增体系：总体积50 μL，其中Premix-Taq 25 μL, 引物浓度为50 μmol·L-1, 猫血巴尔通氏体DNA标准模板5 μL, 加水至50 μL，PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；变性95 ℃ 10 s；退火62 ℃ 30 s；72 ℃ 90 s进行45个循环，最后72 ℃延伸5 min。

1.5 电泳与序列分析

取扩增后的PCR产物7 μL，选用DL2000 marker、2%琼脂糖凝胶进行电泳，30 min后在紫外凝胶成像系统上观察结果、拍照。将出现预期条带的扩增产物送至生工生物工程有限公司进行双向测序，测序结果经BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)核酸比对系统比对。

1.6 生物信息学分析

采用DNAMAN、MEGA6等分子生物学软件进行序列拼接与校正，将测得序列与GenBank中公布的猫血巴尔通氏体的16S rRNA标准序列进行比对，采用邻位相连法(neighbor-joining)绘制遗传进化树，分析检获样本的种属关系。同时，使用SPSS22.0完成感染因素分析。

2 结果 2.1 感染情况

338份样品中，检出猫血巴尔通氏体阳性21个，其感染率为6.21%。其中阳性样品均来自于宠物猫，阳性率为7.98%，电泳图见图 1。

M. DNA相对分子质量标准；1~21.检测样品；+.阳性对照；-.阴性对照 M. DL2000 marker; 1-21. Test sample; +. Positive control; -. Negative control 图 1 猫血巴尔通氏体16S rRNA PCR产物电泳图 Figure 1 Agarose gel electrophoresis of Haemobartonella felis 16S rRNA PCR products
2.2 16S rRNA核苷酸序列及系统进化树分析

本试验得到猫大型血巴尔通氏体16S rRNA核苷酸序列，见表 2(GenBank登陆号：MH447082)。

表 2 16S rRNA核苷酸序列信息表 Table 2 16S rRNA nucleotide sequence information table

基于猫血巴尔通氏体的16S rRNA种系发育分析，对1例为猫大型血巴尔通氏体(Mycoplasma haemofelis)样本序列构建进化树，根据邻接法(NJ)建立系统发育树，利用MEGA6.0构建种系发育进化树，进化树见图 2。

“▲”表示本研究鉴定的猫大型血巴尔通氏体 Haemobartonella felis isolates identified in this study are indicated by ▲ 图 2 猫血巴尔通氏体基于16S rRNA基因序列种系发育树 Figure 2 Phylogenetic analysis of Haemobartonella felis isolated from cats based on 16S rRNA gene sequences
2.3 不同养殖模式和不同年龄阶段猫的感染率

被检动物中，市区内宠物猫的感染率为7.98%，农村散养猫中未检出阳性，见表 3，不同养殖模式之间差异显著(P＜0.05)；根据年龄将检测的样品划分为三个阶段，各年龄阶段均有感染分布，其中小于5月龄，感染率为2.25%(2/89)，6~9月龄，感染率为4.17%(4/96)，10月龄以上，感染率为9.80%(15/153)，各年龄之间差异显著(P＜0.05)，见表 4。

表 3 养殖模式与猫血巴尔通氏体感染率的关系 Table 3 Prevalence of Haemobartonella felis in different nurture models of cats
表 4 年龄与猫血巴尔通氏体感染率的关系 Table 4 Prevalence of Haemobartonella felis in different ages of cats
3 讨论 3.1 猫血巴尔通氏体的感染情况分析

已有文献报道猫血巴尔通氏体的感染率与猫的年龄有一定的相关性[11]，本次检测发现各个年龄阶段的猫均有感染，总体感染率为6.21%，其中10月龄以上的猫感染率为9.80%，相对于其他年龄阶段的猫感染率较高。其中感染类型以猫小型血巴尔通氏体为主，这与2004年Tasker等[12]和2005年Willi等[6]报道的结果一致，说明在云南的猫群中猫血巴尔通氏体的感染没有明显的时间及地域差异性。本次试验从猫养殖模式分析中还发现，市区内饲养的宠物猫感染率明显高于农村散养猫，这与2010年庄庆均等[4]对广州地区猫血巴尔通氏体流行病学调查结果不一致，可能原因，本次试验收集农村家养猫的样本代表性不强，另一方面也说明随着宠物猫与人类的关系越来越亲近，提示在猫的圈养中要加强其免疫预防措施。

3.2 猫大型血巴尔通氏体的分子遗传分析

猫大型血巴尔通氏体是引起猫传染性贫血的一类血液寄生虫，扩增得到猫大型血巴尔通氏体近全长的16S rRNA基因序列，该序列与Mycoplasma haemofelis(GenBank登录号：EU839978)相似性高达98.6%，与感染鼠血巴尔通氏体相似性为86.3%，测序分析结果与1998年Foley等[13]的分析结果一致，本试验从分子水平上证实了云南地区存在猫大型血巴尔通氏体的感染。

3.3 不同养殖模式和年龄的感染因素分析

本研究采用PCR对来自云南部分地区不同养殖模式的猫血液样品进行了16S rRNA的基因扩增，检出市区内饲养猫感染率为7.98%(21/263)，养殖模式之间感染率有差异，且差异显著(P＜0.05)，说明养殖模式与其感染率关系密切。小于5月龄猫血89份，6~9月龄猫血96份，10月龄以上猫血153份。各年龄阶段均有分布，其中小于5月龄感染率2.25%(2/89)，6~9月龄感染率4.17%(4/96)，10月龄感染率9.80%(15/153)，检测三个年龄段之间的感染率差异性显著(P＜0.05)。结果显示猫血巴尔通氏体的感染率与猫年龄大小有着密切关系，年龄越大的猫越容易感染，可能原因随着猫年龄增大其免疫力低下，感染猫血巴尔通氏体的概率增大。

4 结论 4.1

云南部分地区猫血巴尔通氏体的感染以猫小型血巴尔通氏体为主。

4.2

本试验对猫血巴尔通氏体16S rRNA测序分析，得到一个猫大型血巴尔通氏体的16S rRNA核苷酸序列，应高度关注这种病原体引起的猫的严重贫血症。

4.3

猫对于感染猫血巴尔通氏体与其养殖模式和年龄密切相关。

综上所述，通过对云南部分地区猫的血液样品进行检测，本试验首次报道了云南省部分地区猫血巴尔通氏体的感染情况，揭示了猫血巴尔通氏体在云南的流行，亦为该病的防控提供了支撑数据。

参考文献
[1] HARVEY J W, GASKIN J M. Experimental feline haemobartonellosis[J]. J Am Anim Hosp Assoc, 1977, 13(1): 28–38.
[2] MESSICK J B. Hemotrophic mycoplasmas (hemoplasmas):a review and new insights into pathogenic potential[J]. Vet Clin Pathol, 2004, 33(1): 2–13. DOI: 10.1111/vcp.2004.33.issue-1
[3] FLINT J C, MOSS L C. Infectious anemia in cats[J]. J Am Vet Med Assoc, 1953, 122(910): 45–48.
[4] 庄庆均, 张浩吉, 白挨泉, 等. 我国猫Candidatus Mycoplasma haemominutum的分子鉴定及其系统发生关系[J]. 中国兽医科学, 2010, 40(6): 551–555.
ZHUANG Q J, ZHANG H J, BAI A Q, et al. Molecular identification and phylogenetic relationship of Candidatus Mycoplasma haemominutum from cat in China[J]. Chinese Veterinary Science, 2010, 40(6): 551–555. (in Chinese)
[5] SPLITTER E, CASTRO E, KAN AWYER W. Feline infectious anemia[J]. Vet Med, 1956, 51: 17–22.
[6] WILLI B, BORETTI F S, CATTORI V, et al. Identification, molecular characterization, and experimental transmission of a new hemoplasma isolate from a cat with hemolytic anemia in Switzerland[J]. J Clin Microbiol, 2005, 43(6): 2581–2585. DOI: 10.1128/JCM.43.6.2581-2585.2005
[7] TASKER S, PETERS I R, PAPASOULIOTIS K, et al. Description of outcomes of experimental infection with feline haemoplasmas:copy numbers, haematology, Coombs' testing and blood glucose concentrations[J]. Vet Microbiol, 2009, 139(3-4): 323–332. DOI: 10.1016/j.vetmic.2009.06.028
[8] PETERS I R, HELPS C R, WILLI B, et al. The prevalence of three species of feline haemoplasmas in samples submitted to a diagnostics service as determined by three novel real-time duplex PCR assays[J]. Vet Microbiol, 2008, 126(1-3): 142–150. DOI: 10.1016/j.vetmic.2007.06.017
[9] JENSEN W A, LAPPIN M R, KAMKAR S, et al. Use of a polymerase chain reaction assay to detect and differentiate two strains of Haemobartonella felis in naturally infected cats[J]. Am J Vet Res, 2001, 62(4): 604–608. DOI: 10.2460/ajvr.2001.62.issue-4
[10] AQUINO L C, HICKS C A E, SCALON M C, et al. Prevalence and phylogenetic analysis of haemoplasmas from cats infected with multiple species[J]. J Microbiol Methods, 2014, 107: 189–196. DOI: 10.1016/j.mimet.2014.10.013
[11] TASKER S, BINNS S H, DAYM J, et al. Use of a PCR assay to assess the prevalence and risk factors for Mycoplasma haemofelis and 'Candidatus Mycoplasma haemominutum' in cats in the United Kingdom[J]. Vet Rec, 2003, 152(7): 193–198. DOI: 10.1136/vr.152.7.193
[12] TASKER S, BRADDOCK J A, BARAL R, et al. Diagnosis of feline haemoplasma infection in Australian cats using a real-time PCR assay[J]. J Feline Med Surg, 2004, 6(6): 345–354. DOI: 10.1016/j.jfms.2003.12.003
[13] FOLEY J E, HARRUS S, POLAND A, et al. Molecular, clinical, and pathologic comparison of two distinct strains of Haemobartonella felis in domestic cats[J]. Am J Vet Res, 1998, 59(12): 1581–1588.