2. 贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室, 贵阳 550025
, GAO Hong-bo1,2, YUAN Chao1,2, ZHAO Jia-fu1,2, NI Meng-meng1,2, DUAN Zhi-qiang1,2
, JI Xin-qin1,2
2. Key Laboratory of Animal Genetics, Breeding and Reproduction in Plateau Mountainous Region of Ministry of Education, Guizhou University, Guiyang 550025, China
细胞基质蛋白3(matrin 3, MATR3)是最早报道的12种主要核基质蛋白之一，在不同细胞类型中广泛表达且高度保守[1-2]。MATR3蛋白相对分子质量约为125 ku，有四个明显的功能结构域，包括两个可结合RNA的RNA识别基序(RNA recognition motif type, RRM)和两个可结合DNA的锌指结构域(zinc-finger domains, ZF)，另外还存在几个酪氨酸或丝氨酸/苏氨酸激酶的磷酸化位点[3-5]。大量的研究表明，MATR3蛋白主要定位在细胞核，在细胞内参与了细胞的基因转录调节、mRNA前体的剪接和稳定、DNA损伤修复以及细胞增殖等活动[6]。最近的研究发现，MATR3蛋白在逆转录病毒RNA的核输出、基因组的稳定性和表达调控等方面也具有重要作用[7-8]。一般来说，相对分子质量小于50 ku的蛋白质可以通过自由扩散或被动扩散的方式进入细胞核，而相对分子质量大于50 ku的蛋白质只能通过主动转运进入细胞核，其序列中必须存在核定位信号(nuclear localization signal, NLS)，并且被相应的细胞核转运受体蛋白识别和结合后才能将其转运至细胞核[9-11]。鸡MATR3蛋白的相对分子质量远大于50 ku，但是目前其携带的NLS以及入核转运机制尚不清楚。因此，本研究首先通过核定位信号在线预测软件预测鸡MATR3蛋白中存在的假定NLS(putative NLS, pNLS)，然后构建pNLS缺失体重组真核表达载体，转染细胞后观察重组蛋白的亚细胞定位来确定鸡MATR3蛋白NLS。同时，构建鸡MATR3蛋白NLS邻近碱性氨基酸缺失的重组真核表达载体，通过观察重组蛋白的亚细胞定位来判断邻近碱性氨基酸位点是否参与了NLS介导的鸡MATR3蛋白细胞核定位。另外，将鉴定的鸡MATR3蛋白NLS与红色荧光蛋白融合表达观察其对外源蛋白的核输入情况，确定鸡MATR3蛋白NLS的核输入能力。这些研究将为进一步鉴定鸡MATR3蛋白的核转运受体蛋白，阐明其细胞核定位的分子机制奠定基础。
1 材料与方法 1.1 细胞、菌株和质粒HEK-293T细胞、大肠杆菌DH5α感受态细胞、真核表达载体pDsRed1-C1和鸡MATR3基因重组克隆质粒pMD19T-MATR3[12]由本实验室保存。
1.2 主要试剂pfu Taq DNA高保真聚合酶、T4 DNA连接酶、DNA marker、限制性内切酶XhoⅠ和BamH Ⅰ购自Thermo Fisher公司；DNA凝胶回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒购自AxyGen公司；TransIT® -2020 Transfection Reagent购自Mirusbio公司；质粒小提试剂盒购自Qiangen公司；DNA寡核苷酸退火缓冲液(Annealing Buffer for DNA Oligo 5×)、4%多聚甲醛和Triton X-100购自碧云天生物技术研究所；卡那霉素、细胞核染料DAPI购自Sigma公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清购自Gibco公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.3 鸡MATR3蛋白NLS的预测利用蛋白质NLS在线预测软件PSORT Ⅱ(https://www.genscript.com/psort.html)对鸡MATR3蛋白中存在的假定NLS进行预测，共发现4个pNLS(表 1)。
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表 1 鸡MATR3蛋白假定NLS的预测 Table 1 Prediction of the putative NLS in chicken MATR3 |
根据GenBank中登录的鸡MATR3基因序列(登录号：NM_204147)，利用Primer Premier 5.0软件，设计扩增鸡MATR3基因pNLS缺失体(图 1)的特异性引物(表 2)，上游引物加XhoⅠ酶切位点，下游引物加BamHⅠ酶切位点(酶切位点用下划线斜体标出)，引物由上海Invitrogen公司合成。以重组克隆质粒pMD19T-MATR3为模板，用特异性引物(图 2)进行PCR分段扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测和纯化后，再用上下游引物F/R进行overlap PCR扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测和纯化后，将PCR产物和pDsRed1-C1真核表达载体分别进行双酶切，胶回收目的片段后进行连接，然后转入DH5α感受态细胞，挑取单菌落培养，提取质粒进行双酶切鉴定，将鉴定为阳性的重组质粒送上海Invitrogen公司测序。
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图 1 鸡MATR3蛋白pNLS缺失体结构 Figure 1 The schematic diagram of chicken MATR3 pNLS deletants |
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表 2 构建鸡MATR3蛋白pNLS缺失体重组质粒所用引物 Table 2 Primers used to construct the recombinant plasmids of chicken MATR3 with the pNLS deletion |
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图 2 鸡MATR3蛋白pNLS缺失体基因PCR扩增引物示意 Figure 2 The schematic diagram of primers used for the amplification of chicken MATR3 genes with the pNLS deletion |
由于鸡MATR3蛋白NLS附近存在多个碱性氨基酸位点，为了验证其对NLS介导的鸡MATR3蛋白核定位是否有影响，笔者分别设计合成相应的DNA寡核苷酸引物(表 3)将MATR3蛋白NLS邻近碱性氨基酸位点缺失。设计的引物两端分别带有XhoⅠ和BamHⅠ酶切位点便于插入相应的载体，引物由上海Invitrogen公司合成。使用DNA寡核苷酸退火缓冲液将相应的上下游引物连接形成双链DNA，然后将其与经过同样双酶切的pDsRed1-C1真核表达载体连接，转化DH5α感受态细胞，挑取单菌落扩大培养后提取质粒，将电泳检测结果为阳性的重组质粒送上海Invitrogen公司测序。
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表 3 构建鸡MATR3蛋白NLS邻近碱性氨基酸缺失重组质粒所用引物 Table 3 Primers used to construct the recombinant plasmids carrying the deletion of adjacent basic amino acids in chicken MATR3 NLS |
HEK-293T细胞使用含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1链霉素的DMEM培养基，置于37 ℃、含5% CO2的细胞培养箱中培养。转染前一天，按5×105cells·well-1的量将消化后的HEK-293T细胞铺在35 mm细胞培养皿中培养过夜，待细胞完全贴壁生长至80%左右，更换细胞培养皿中的培养基，然后将纯化的重组真核表达载体和脂质体(比例为2.5 μg: 10 μL)先后加入到250 μL无抗无血清DMEM基础培养基中，轻轻吹打混匀后室温静置25 min，最后加入细胞培养皿中，放入37 ℃、含5% CO2的细胞培养箱中继续培养24 h。
1.7 重组蛋白的荧光观察重组真核表达载体转染HEK-293T细胞后24 h，PBS洗涤细胞3次，加入预冷的4%多聚甲醛室温固定20 min；弃掉液体，PBS洗涤3次，加入0.25% TritonX-100室温作用5 min；PBS洗涤3次，加入DAPI染细胞核10 min；PBS洗涤3次后，于荧光显微镜下观察重组蛋白的荧光表达情况。将获得的重组蛋白荧光定位图片与对应的细胞核荧光图片用Photoshop CS3软件进行Merge处理，通过荧光共定位来判断重组蛋白的亚细胞定位。
2 结果 2.1 鸡MATR3蛋白pNLS的预测用生物信息学在线预测软件PSORT Ⅱ对鸡MATR3蛋白进行pNLS预测。结果显示，鸡MATR3蛋白共有四个pNLS(表 1)，分为两种类型，分别是由单簇碱性氨基酸组成的单分型NLS：pNLS1(145KRRR148)、pNLS2(596PSDKKSK602)、pNLS3(706PATKKKL712)，以及两簇碱性氨基酸组成的双分型NLS：pNLS4(872KKTHCSSLPHYQKLKKI888)。
2.2 鸡MATR3蛋白pNLS缺失体重组真核表达载体的构建以质粒pMD19T-MATR3为模板，通过overlap PCR方法获得鸡MATR3蛋白pNLS缺失的基因片段，片段大小与预期大小相符(图 3A)。将其分别定向插入到真核表达载体pDsRed-C1多克隆位点中构建重组真核表达载体pDsRed-MATR3(△pNLS1)、pDsRed-MATR3(△pNLS2)、pDsRed-MATR3(△pNLS3)和pDsRed-MATR3(△pNLS4)。对提取的重组质粒进行双酶切鉴定，均可获得载体片段和相应大小的目的基因片段(图 3B)，将阳性的重组质粒送上海Invitrogen公司测序。对测序结果进行比对分析，结果表明：鸡MATR3基因全长片段及其pNLS缺失体片段按正确的开放阅读框插入到真核表达载体pDsRed1-C1，并且未发生基因突变，说明鸡MATR3蛋白pNLS缺失体重组真核表达载体构建成功。
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A. Overlap PCR扩增条带[M. DNA相对分子质量标准；1. MATR3(△pNLS1)基因；2. MATR3(△pNLS2)基因；3.MATR3(△pNLS3)基因；4. MATR3(△pNLS4)基因；5. MATR3基因]. B.重组质粒双酶切产物[M. DNA相对分子质量标准；1、2. pDsRed-MATR3(△pNLS1)双酶切产物；3、4. pDsRed-MATR3(△pNLS2)双酶切产物；5、6. pDsRed-MATR3(△pNLS3)双酶切产物；7、8. pDsRed-MATR3(△pNLS4)双酶切产物；9. pDsRed-MATR3双酶切产物] A. Overlap PCR amplification products (M. DNA marker; 1. MATR3(△pNLS1) gene; 2. MATR3(△pNLS2) gene; 3. MATR3(△pNLS3) gene; 4. MATR3(△pNLS4) gene; 5. MATR3 gene). B. Double enzyme digestion of the recombinant plasmids (M. DNA marker; 1, 2. pDsRed-MATR3(△pNLS1) enzyme digestion; 3, 4. pDsRed-MATR3(△pNLS2) enzyme digestion; 5, 6. pDsRed-MATR3(△pNLS3) enzyme digestion; 7, 8. pDsRed-MATR3(△pNLS4) enzyme digestion; 9. pDsRed-MATR3 enzyme digestion) 图 3 鸡MATR3蛋白pNLS缺失体重组真核表达载体的鉴定 Figure 3 Identification of recombinant plasmids expressing the pNLS deletants of chicken MATR3 |
将鸡MATR3蛋白NLS及其邻近氨基酸位点缺失的序列设计相应的上下游引物，将其连接形成双链DNA，与经过双酶切的pDsRed1-C1载体相连构建重组真核表达载体，分别命名为pDsRed-MATR3/M1、pDsRed-MATR3/M2、pDsRed-MATR3/M3、pDsRed-MATR3/M4、pDsRed-MATR3/M5和pDsRed-MATR3/M6。提取质粒后，将电泳检测结果为阳性的重组质粒(图 4)送上海Invitrogen公司测序。将测序结果比对分析发现，获得了鸡MATR3蛋白NLS及其邻近氨基酸位点缺失的重组真核表达载体。
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M.DNA相对分子质量标准；1~3. pDsRed-MATR3/M1重组质粒；4~6. pDsRed-MATR3/M2重组质粒；7~9. pDsRed-MATR3/M3重组质粒；10~12. pDsRed-MATR3/M4重组质粒；13~15. pDsRed-MATR3/M5重组质粒；16~18. pDsRed-MATR3/M6重组质粒 M.DNA marker; 1-3. pDsRed-MATR3/M1 recombinant plasmid; 4-6. pDsRed-MATR3/M2 recombinant plasmid; 7-9. pDsRed-MATR3/M3 recombinant plasmid; 10-12. pDsRed-MATR3/M4 recombinant plasmid; 13-15. pDsRed-MATR3/M5 recombinant plasmid; 16-18. pDsRed-MATR3/M6 recombinant plasmid 图 4 鸡MATR3蛋白NLS邻近碱性氨基酸缺失的重组真核表达载体鉴定 Figure 4 Characterization of the recombinant plasmids expressing the deletion of adjacent basic amino acids in chicken MATR3 NLS |
将成功构建的鸡MATR3蛋白pNLS缺失体重组真核表达载体分别转染HEK-293T细胞，转染后24 h观察重组蛋白的亚细胞定位情况。荧光观察结果表明，DsRed-MATR3重组蛋白和pNLS缺失体重组蛋白DsRed-△pNLS1、DsRed-△pNLS3和DsRed-△pNLS4主要定位在细胞核，而DsRed-△pNLS2缺失体重组蛋白主要定位在细胞质，作为对照的空载体表达的DsRed则在细胞核和细胞质均存在(图 5)。以上结果说明，pNLS2缺失会影响鸡MATR3蛋白的细胞核定位，因此pNLS2是决定鸡MATR3蛋白细胞核定位的NLS。
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图 5 鸡MATR3蛋白pNLS缺失的重组蛋白亚细胞定位 Figure 5 Subcellular localization of recombinant protein of chicken MATR3 pNLS deletants |
对鉴定的鸡MATR3蛋白NLS邻近氨基酸位点分析发现，其前方存在多个碱性氨基酸位点。为了确定这些碱性氨基酸位点是否对鸡MATR3蛋白核定位存在影响，笔者将构建的鸡MATR3蛋白NLS邻近碱性氨基酸位点缺失体(图 6)重组真核表达载体转染细胞，观察重组蛋白的亚细胞定位情况。荧光观察结果显示(图 6)：pDsRed-MATR3/M1、pDsRed-MATR3/M3、pDsRed-MATR3/M4、pDsRed-MATR3/M5和pDsRed-MATR3/M6重组蛋白主要定位在细胞核，而pDsRed-MATR3/M2重组蛋白和DsRed蛋白则在细胞核和细胞质中均存在。以上结果表明，NLS邻近碱性氨基酸位点不参与NLS介导的鸡MATR3蛋白细胞核定位。
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图 6 鸡MATR3蛋白NLS邻近碱性氨基酸缺失体重组蛋白的亚细胞定位 Figure 6 The subcellular localization of adjacent basic amino acids deletants of chicken MATR3 NLS |
从GenBank中下载鸡、鸭等禽类以及人和鼠、猪和牛等哺乳动物的MATR3蛋白的氨基酸序列进行比对分析，结果发现，MATR3蛋白NLS基序在人和不同动物中保守，均为PSDKKSK(图 7)。SV40大T抗原NLS(126PKKKRKV132)是第一个鉴定的单分型NLS，同时也是一个能将外源蛋白转运到细胞核的NLS，具有很强的核转运能力。笔者将构建的pDsRed-SV40/NLS和pDsRed-MATR3/NLS重组真核表达载体分别转染细胞，观察SV40/NLS和MATR3/NLS对红色荧光蛋白的核输入情况，结果发现DsRed-SV40/NLS和DsRed-MATR3/NLS重组蛋白均主要表现为细胞核定位(图 7)，说明MATR3/NLS具有与SV40/NLS相同的核输入能力。
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图 7 MATR3蛋白NLS保守性分析及其核输入能力检测 Figure 7 Conservative analysis and nuclear import ability detection of MATR3/NLS |
MATR3蛋白是细胞核基质蛋白重要成员之一，它可在不同的细胞中广泛表达，参与了细胞核中的多种活动，如形成细胞核骨架，与多种蛋白质相互作用促进DNA复制、转录和修复[13]以及维持mRNA的稳定性[14]等。最近研究发现，MATR3蛋白表达水平的改变与人类某些疾病密切相关，如MATR3蛋白表达水平降低或氨基酸发生突变与唐氏综合征[15]、声带麻痹和肌萎缩性侧索硬化[16-17]相关。除此之外，研究人员还发现MATR3蛋白还参与了某些逆转录病毒的复制增殖过程，如MATR3蛋白能结合人免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus 1，HIV-1)基因组RNA，并且只有当包含病毒基因组RNA的Rev蛋白应答元件(Rev response element, RRE)被MATR3蛋白结合时才能增强Rev蛋白的活性，而抑制细胞内MATR3蛋白的表达则会降低Rev/RRE介导的未剪切HIV-1基因组RNA的核输出，说明MATR3蛋白是增强HIV-1 Rev蛋白活性的细胞辅助因子，对HIV-1的复制和感染过程具有重要作用[7-8]。而MATR3蛋白参与动物病毒复制和致病机制的研究方面目前尚未见报道。最近笔者课题组通过酵母双杂交技术筛选到鸡MATR3蛋白与新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)基质蛋白存在相互作用[18]。由于NDV感染细胞期间，其基质蛋白可定位在细胞核，能抑制宿主细胞基因的转录和翻译[19]，笔者推测NDV基质蛋白与MATR3蛋白互作抑制了MATR3蛋白在细胞核中的功能，这为后期深入探讨鸡MATR3蛋白在NDV复制和致病中的作用机制提供了理论基础。
大量的研究证实，大分子蛋白质进入细胞核需要特定的NLS[20]。根据蛋白质NLS组成特点可将NLS分为两种类型[21]：一是由单簇碱性氨基酸(R或K)(包含2~10个连续的碱性氨基酸)组成的单分型NLS和由两簇碱性氨基酸(包含一段5~20个氨基酸残基组成的间隔序列)组成的双分型NLS，以上两种NLS均属于经典NLS，二是由不单独成簇碱性氨基酸(碱性氨基酸在组成上没有明显规律)组成的非经典NLS。此外，研究还发现许多蛋白质中可存在一个或多个NLS介导其细胞核定位[22]。在本研究中，笔者用生物信息学软件预测鸡MATR3蛋白有四个pNLS，分别是单簇碱性氨基酸组成单分型pNLS1、pNLS2和pNLS3，以及两簇碱性氨基酸组成的双分型pNLS4。但是通过pNLS缺失体试验发现，仅pNLS2(596PSDKKSK602)是决定鸡MATR3蛋白细胞核定位的关键NLS。有研究结果表明，NLS邻近的碱性氨基酸可能在NLS介导的细胞核定位中发挥着辅助作用[23]。因此根据鸡MATR3蛋白NLS及其邻近碱性氨基酸序列构建不同的重组真核表达载体，转染细胞后对重组蛋白进行荧光观察和亚细胞定位分析，发现鸡MATR3蛋白NLS邻近的碱性氨基酸不参与NLS介导的MATR3蛋白细胞核定位。此外，笔者还发现该NLS基序在不同物种MATR3蛋白中均保守，并且与SV40/NLS具有相同的核输入能力。因此，本研究确定鸡MATR3蛋白中仅存在一个功能性的单分型NLS。
最近的研究结果表明，蛋白质进入细胞核除了需要自身携带的NLS外，还需要通过核转运受体importin α和/或importin β两个输入蛋白家族成员识别和结合其NLS，将其转运到细胞核[24-25]。例如胰岛素样生长因子结合蛋白5(insulin-like growth factor-binding protein 5, IGFBP-5)进入细胞核需要通过importin α5结合IGFBP-5蛋白NLS，然后与importin β1形成三元复合物后进入细胞核，此过程需要importin α5和importin β1的共同作用[26]；Rowe等[27]证实狂犬病毒(rabies virus，RV)P蛋白的入核转运仅需要importin β1识别P蛋白NLS来介导其入核转运过程，而不需要importin α家族成员的参与；Pumroy等[28]的研究发现A型流感病毒PB2蛋白入核转运需要importin α3和importin α7的协同作用，该过程不需要importin β1蛋白的参与。鉴于MATR3蛋白在细胞生活史中的重要作用，了解其入核转运机制对深入研究MATR3蛋白细胞核定位的功能具有重要意义。本研究成功鉴定了鸡MATR3蛋白NLS，这为后续研究鸡MATR3蛋白细胞核定位的分子机制奠定了工作基础。
4 结论鸡MATR3蛋白中存在一个保守的单分型NLS(596PSDKKSK602)介导其细胞核定位，并且NLS邻近碱性氨基酸位点不参与MATR3蛋白的细胞核定位。
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