犬细小病毒病(canine parvovirus disease，CPD)又称犬传染性肠炎或犬病毒性肠炎，是由犬细小病毒(canine parvovirus，CPV)引起的犬的一种急性、接触性、致死性传染病^[1]。临床表现以急性出血性肠炎和非化脓性心肌炎为特征, 该病一年四季均可发生，不同年龄、性别及品种的犬均易感，但多发于幼犬，以发病急、病程短、传染性强、死亡率高为主要特点^[2-4]。CPD是危害养犬业最为严重的传染病之一。

1977年美国学者A. K. Eugster等从患有出血性肠炎的病犬粪便中首次观察到类似猫细小病毒样颗粒^[5]。次年，几乎同时在美国、欧洲和澳大利亚分离获得CPV。为了区别于1967年由L. N. Binn等从健康犬粪便中分离到的犬极细小病毒(minute virus of canine，MVC，习惯上也叫CPV-1)^[6]，而将后来分离的病毒命名为犬细小病毒2型(CPV-2)。CPV呈世界性分布，血清学调查显示，CPV阳性血清在欧洲最早可以追溯到1974—1976年；在美国、加拿大、日本和澳大利亚可以追溯到1978年。在我国，梁士哲等于1982年首次报道了类似犬细小病毒感染性肠炎，次年，徐汉坤等正式报道了该病的流行^{[2, 7]}。

CPV在分类上属细小病毒科(Parvoviridae)，细小病毒亚科(Parvovirinae)，细小病毒属(Parvovirus)^[8]。CPV只有一个血清型，但不同毒株间抗原性有所差异，自发现CPV至今，共出现了CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c三个抗原亚型。CPV的基因组是单股、负链、线性DNA，全长5 300个核苷酸左右。有2个开放阅读框，5′端ORF编码非结构蛋白(668个氨基酸)，即早期转录的调节蛋白(NS1和NS2蛋白)；3′端ORF编码结构蛋白(722个氨基酸)，即晚期转录的病毒衣壳蛋白(VP1和VP2)。整个编码区基因是互相重叠的，结构基因和非结构基因各有一套早期启动子和晚期启动子。通过选择性剪切mRNA前体形成不同的翻译模板，终止于共同的Poly(A)末端。

由于犬细小病毒新变异株的不断出现，临床上使用的灭活疫苗与弱毒疫苗的免疫效果均有不同程度的下降，导致免疫失败时有发生。故分离新的毒株，对其基因组进行分析研究，了解和掌握目前流行毒株的变异情况，为更有效地预防、控制犬细小病毒病的发生提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 临床样品

来自北京某比格犬养殖场1只雌性经产犬，年龄约2岁，临床表现为发烧、呕吐、腹泻等症状，经PCR检测为CPV阳性，采集肠组织备用。

1.1.2 培养细胞、载体和菌株

A-72细胞为本实验室保存，pMD19-T载体购自TaKaRa公司，DH5α大肠杆菌购自北京全式金生物技术有限公司。

1.1.3 主要试剂

EX-Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA提取试剂盒均为Promega公司产品，胶回收试剂盒购自Omega公司，DMEM为Gibco公司产品。注射用青霉素钠和注射用硫酸链霉素为华北制药股份有限公司产品。

1.2 方法 1.2.1 病毒分离

刮取肠内膜及肠内容物，用DMEM(含青、链霉素2 000 IU·mL^-1)冲洗并稀释，4 000 r·min^-1离心20 min，取上清，经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后，接入A-72细胞，37 ℃吸附1 h后，加入含2%犊牛血清的DMEM维持液培养，逐日观察有无细胞病变(CPE)。5 d后收获病毒，反复冻融3次，连续盲传5代仍无病变视为阴性。出现细胞病变达80%时收获病毒液，经-20 ℃冻融2次后置-70 ℃保存备用。

1.2.2 病毒鉴定 1.2.2.1 血凝试验

取第4~7代细胞培养毒株，采用微量血凝及血凝抑制试验鉴定分离病毒株的血凝特性。

1.2.2.2 形态学鉴定

参考文献方法^[9]对细胞培养液进行负染，电镜观察。

1.2.2.3 病毒滴度测定

取该分离株反复冻融3次的F4代细胞培养物，用维持液将病毒进行10^-1~10^-9系列稀释，分别接种在已长满A-72单层细胞的96孔细胞培养板中，每个稀释度接种6孔，每孔0.1 mL，37 ℃吸附1 h加入维持液，置37 ℃ 5%CO₂培养箱培养，同时设只加维持液的细胞作为对照，连续7 d观察细胞病变并记录结果，按Reed-Muench法计算分离毒株的TCID₅₀。

1.2.3 动物回归试验

选择HI抗体 < 1:20的60日龄健康比格犬10只，随机编号，人工感染组7只(1#~7#)，经口灌服2 mL病毒液(TCID₅₀为10^-8.4·mL^-1)，对照组3只(8#~10#)，经相同途径灌服2 mL细胞培养物，分别隔离观察饲养，每天观察临床症状，并于第3天开始收集攻毒犬粪便，检测病毒排放情况。

1.2.4 基因组扩增及分析 1.2.4.1 病毒DNA的提取

按试剂盒操作说明书进行。

1.2.4.2 引物设计

应用DNAMAN软件针对GenBank上收录的CPV全基因序列设计5对引物，由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.2.4.3 CPV全基因组的扩增

以提取的DNA为模板，用设计的5对引物进行扩增。程序：95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s，50~58 ℃ 45 s；72 ℃ 2 min，35个循环，72 ℃10 min。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收。回收产物与pMD19-T载体连接，转化感受态细胞DH5α，PCR方法鉴定重组质粒。将鉴定正确的阳性菌株送上海英骏生物技术有限公司测序。

1.2.4.4 序列分析

将测序正确的各序列用DNAMAN进行拼接，与GenBank上国内外发表的代表性CPV基因组序列进行同源性分析比较，构建系统发育树。

2 结果 2.1 病毒分离和形态学观察

病料接种A-72细胞后出现明显细胞病变(CPE)，感染病毒的细胞表现为细胞膨大，变圆，并有“拉网”现象，继而开始脱落(图略)，将出现80%以上病变的培养物收集，-20 ℃反复冻融3次，备用。并将分离的病毒命名为CPV-YH。电子显微镜观察结果显示，病毒粒子呈圆形或六边形，无囊膜，直径20~22 nm，见图 1。

2.2 血凝特性

用新鲜1%猪红细胞悬液进行检测，以每孔中50%以上的红细胞出现凝集时判为阳性。结果显示该分离株4~7代均能凝集猪红细胞，其凝集价可达2⁸~2⁹。在血凝抑制试验中，该病毒可被CPV阳性血清所抑制。

2.3 病毒滴度测定

按Reed-Muench法计算分离毒株4代毒的TCID₅₀为10^-8.4·mL^-1。

2.4 动物回归试验

攻毒组各犬在感染后第4天出现不同程度的精神沉郁、排便异常，出现软便、黏液便，并伴有呕吐症状，随之停止进食；体温升高，最高达40 ℃。7只攻毒犬在接种后10 d内死亡，致死率100%，剖检发现攻毒犬呈脱水症状，小肠充血、淤血、甚至大面积坏死，肠系膜充血、淤血，胃内有大量白色或黄色黏液、黏膜有出血点，肝水肿、出血、坏死，脾肿大、淤血，肾盂融合或皮质、髓质区界限不清，肺淤血、坏死，心包膜增厚，胰腺肿大、有出血点等病理变化。感染组犬粪便CPV检测结果均为阳性。而对照组健康情况均正常。

2.5 全基因组的扩增、克隆与鉴定

以细胞培养4代病毒提取的DNA为模板，用5对引物进行PCR扩增后，得到了与目的基因大小一致的目的片段(图 2)，其片段长度分别为810、762、926、505和2 039 nt。与pMD19-T克隆载体连接后，取鉴定为阳性的样品测序。

2.6 基因组特征

将5个片段进行拼接，PCV-YH基因组全长4 921 nt(GenBank登录号为KY403998)。CPV基因组有2个开放阅读框，分别编码早期转录的调节蛋白(NS1和NS2) 和晚期转录的病毒衣壳蛋白(VP1和VP2)。非结构蛋白NS1和NS2共长2 007 nt，位于基因组的273~2 279 nt之间。结构蛋白VP1和VP2编码基因位于基因组的2 283~4 538 nt之间，长2 256 nt，中间有长72 nt的间隔序列。5′-端有回文序列形成的发夹结构，3′-端有一个拷贝的长约60 nt的重复序列。全基因组序列比对结果显示，CPV-YH毒株与2011年兰州分离的CPV-LZ2分离株相似性最高，为99%。NS1基因推导的氨基酸序列与CPV-LZ2分离株NS1相似性为99.55%，有3处发生变异(表 2)。同时，VP1基因氨基酸序列也出现了3处变异(表 2)，其中第一处变异存在于25位的间隔序列位置，VP2基因氨基酸有两处发生变异，具体见表 2。

2.7 VP2核苷酸和氨基酸序列分析

分离株CPV-YH的VP2基因包括1 755个核苷酸，编码584个氨基酸。氨基酸序列进化树显示，CPV-YH分离株与2013-BJ-P27(中国)分离株和UY306(乌拉圭)分离株在同一个小的分支上，见图 3。与GenBank上收录的CPV代表株的VP2基因比对，核苷酸和氨基酸相似性分别是98%~99.4%和97.1%~99.5%。根据第426位氨基酸残基的变异情况，该分离株为CPV-2a型。

3 讨论

CPV在我国的流行，以CPV-2a亚型为主，CPV-2b伴随存在，CPV-2c偶尔存在^{[1, 10]}。目前，我国主要使用CPV-2型疫苗，鉴于这种情况以及常出现的免疫失败现象，对国内犬细小病毒抗原变异株的分子流行病学检测势在必行。本研究从疑似犬细小病毒感染病例中用A-72细胞分离出一株病毒，经病毒形态学鉴定、血凝特性、动物回归试验以及全基因组测定等分子生物学鉴定，成功分离出一株犬细小病毒CPV-YH，属于CPV-2a型。

动物回归试验表明，CPV-YH分离株为强毒株。可致比格犬出现细小病毒典型临床症状，死亡率100%，这与王建科等报道结果一致^[11]。可用于建立犬细小病毒病攻毒模型，同时为开发新的疫苗奠定基础。基因组测序结果显示CPV-YH基因组全长4 921 nt。CPV基因组有2个开放阅读框，分别编码早期转录的调节蛋白(NS1和NS2) 和晚期转录的病毒衣壳蛋白(VP1和VP2)。细小病毒具有特征性的末端重复序列^[12]，CPV的第一个末端重复序列起始于终止密码附近的外显子处，长约60 nt，另一个60 nt的末端重复序列起始于下游的75 nt处。CPV-2和早期CPV-2a第一个末端重复序列都是2个拷贝，但是目前流行的CPV-2a和CPV-2b多是1个拷贝。第二个末端重复序列的变化较大，1988年A.P.Reed等检测的CPV-N是3个拷贝^[12]，1985年S.L.Ⅲ Rhode检测的CPV-B是1个拷贝^[13]。本研究结果显示，CPV-YH毒株在5′-端有回文序列形成的发夹结构，3′-端有1个拷贝的长约60 nt的重复序列。末端重复序列的具体功能目前尚不清楚。有学者认为末端重复序列的作用是调节DNA的长度到最佳，以使他们恰好包装在各自的衣壳中^[13]；也有学者认为是调节转录^[14]。S. L. Ⅲ Rhode的研究表明，将大鼠H1细小病毒在NB细胞上传代，其5′末端出现重复序列，认为是由于细胞传代造成^[15]。但从细小病毒拥有的重复序列拷贝数，可以推测这两个末端重复序列对CPV只有1个拷贝就足够。

VP2氨基酸进化树显示，CPV-YH分离株与2013-BJ-P27(中国)分离株和UY306(乌拉圭)分离株亲缘关系最为接近。全基因组序列比对结果显示，CPV-YH毒株与2011年兰州分离的CPV-LZ2分离株相似性最高(为99%)，VP2基因编码氨基酸第406位由T突变成S，第426位由D变成N，VP1基因编码氨基酸序列出现了3处变异。其中第一处变异出现于25位，此位置处于间隔序列位置，目前关于犬细小病毒VP1间隔序列的相关研究尚有欠缺，剪切方式和具体位置尚未确定，故本毒株此位置氨基酸的变异是否会直接导致病毒毒力的变化，是否与病毒的进化和致病性有关还有待进一步的研究。

本研究为CPV的分子生物学提供了数据，为犬细小病毒病的预防和控制提供了一定的参考依据，也为犬细小病毒流行病学调查、新型疫苗开发以及分析生产实践中免疫失败的原因提供素材。

4 结论

成功分离到一株CPV-2a亚型分离株，并命名为CPV-YH。其基因组全长为4 921 nt(GenBank登录号为KY403998)，与2011年兰州分离的CPV-LZ2分离株基因组相似性最高，为99%；VP2氨基酸进化树显示，CPV-YH分离株与2013-BJ-P27(中国)分离株和UY306(乌拉圭)分离株在同一小的分支上。