2. 农业部养猪科学重点实验室, 荣昌 402460;
3. 养猪科学重庆市市级重点实验室, 荣昌 402460
2. Key Laboratory of Pig Industry Sciences of Ministry of Agriculture, Rongchang 402460, China;
3. Chongqing Key Laboratory of Pig Industry Sciences, Rongchang 402460, China
胸腺素最早在胸腺中发现，并且广泛分布于多种组织和细胞[1]，是一类具有类激素特性的生物活性分子，可通过促进白介素-2 (IL-2) 的生成而在激活T淋巴细胞的生长、增强NK细胞的溶解活性、诱导调节性T细胞的分化、介导活化诱导的细胞死亡以及其他免疫信号通路中发挥重要作用[2-5]。
根据蛋白等电点的差异，胸腺素可分为α、β和γ 3个家族[1, 6]。其中，胸腺素β家族由40~44个氨基酸残基组成，蛋白质分子量约5 ku[7]。研究表明，胸腺素β家族成员在免疫系统中发挥着重要作用，目前研究较为深入的胸腺素β4被发现能够在诱导T细胞的表型变化[8]，抑制巨噬细胞的迁移[9]，抑制组织的炎症[10]和嗜中性粒细胞的趋化性[11]等过程中起作用。TMSB15同属于胸腺素β家族，包含TMSB15A和TMSB15B两个亚型[12]。目前，关于TMSB15A的报道较少，人上仅有研究证实TMSB15A是三阴性乳腺癌的化疗应答靶点[13]，鼠上仅有研究证实TMSB15A有4个剪切变异体，在大脑的各区域有表达[14]，对该基因的功能也缺乏进一步的深入研究，在猪等其他物种中也未见相关报道。
普遍认为，中国地方猪种的抗病抗逆性能优于引进猪种，但还缺乏相应的理论支撑，相关的分子基础研究也较少。在猪的各器官中，胸腺(Thymus)是机体一个极其重要的中枢淋巴器官，是T淋巴细胞发生、发育、成熟的重要场所。我们通过胸腺转录组分析发现，荣昌猪胸腺中TMSB15A mRNA的表达量远远高于长白猪。因此，TMSB15A可能是引起中国地方猪种和引进猪种抗病抗逆性能差异的一个重要的候选基因。然而，目前对猪胸腺素的研究尚未起步，对其相关的生理生化功能也尚不了解。因此，对该基因的进一步研究有助于提升我们对猪抗病抗逆性状的理解。
本研究以荣昌猪胸腺mRNA为模板，利用RT-PCR、5′ RACE以及3′ RACE方法克隆得到TMSB15A cDNA全长，利用生物信息学软件对TMSB15A序列进行分析，并利用实时荧光定量PCR技术分析TMSB15A在荣昌猪各组织中的表达差异。本试验结果可为研究TMSB15A基因的功能奠定基础，也为荣昌猪抗病育种提供理论支撑。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验用3月龄荣昌猪(公、母各3头)选自重庆市畜牧科学院荣昌猪国家资源保种场。
RNeasy® Mini Kit、DNaseI购自QIAGEN公司；SMART cDNA synthesis Kit购自Clontech公司；DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自Omega公司；T-Vector pMDTM 19(simple)购自TaKaRa公司；反转录试剂盒、GoTaq® qPCR Master Mix购自Promega公司，其他试剂均为国产分析纯。
1.2 荣昌猪各组织RNA提取及cDNA合成对试验动物采集心、肝、脾、肺、肾、肌肉、胸腺及淋巴组织，并使用RNeasy® Mini Kit提取荣昌猪各组织总RNA，Nanodrop 2000测定RNA样品的浓度及OD值。1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。每个组织取1 μg总RNA用于cDNA合成，20 μL反转录体系包括Ⅰ液：Radom Primer 1 μL，Oligo dT 1 μL，RNA 5 μL，RNase free H2O 3 μL；Ⅱ液：Reaction Buffer 4 μL，MgCl2 2 μL，PCR nucleotide Mix 1 μL，RNase inhibitor 0.4 μL，RNase free H2O 1.6 μL，反转录酶1 μL。Ⅰ液70 ℃反应5 min后再与Ⅱ液混匀，混合体系按照如下程序进行反转录：25℃ 5 min，42℃ 60 min，70 ℃ 15 min。cDNA产物储存于-20 ℃备用。
1.3 引物设计参考NCBI数据库中TMSB15A基因序列(NC_010461.4) 以及预测的mRNA序列，采用Primer 3.0设计基因克隆及实时荧光定量引物。所有引物(表 1，表 2)均由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
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表 1 TMSB15A mRNA全长扩增引物 Table 1 Primers used to amplify the full-length sequence of TMSB15A mRNA |
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表 2 实时荧光定量PCR引物 Table 2 Primers used for qRT-PCR |
参考NCBI数据库中提供的猪TMSB15A序列，设计TMSB15A基因保守序列扩增引物(P1和P2)，以荣昌猪胸腺的cDNA为模板，经PCR扩增目的片段。50 μL PCR反应体系：5 μL 10× Ex Taq Buffer (20 mmol·L-1, Mg2+ plus)，4.0 μL dNTP mixture (2.5 mmol·L-1)，0.25 μL TaKaRa Ex Taq(5 U·μL-1)，1.0 μL cDNA，1.0 μL(10 μmol·L-1)正、反向引物以及38.75 μL ddH2O。PCR反应程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。
1.5 5′RACE和3′RACE以荣昌猪胸腺mRNA为模板，参照Clontech公司的SMART RACE cDNA Synthesis Kit，根据所获得的TMSB15A基因保守序列，设计5′ RACE和3′ RACE引物。为了确保RACE PCR的特异性，本试验进行了第二轮巢式PCR扩增。引物使用详情见表 1。
所有PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离后胶回收，连接到T-Vector pMDTM 19(simple)中，挑取阳性单菌落后送至苏州金唯智生物科技有限公司进行测序。
1.6 序列分析测序结果通过NCBI BLAST program (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)进行验证。利用NCBI网站中的ORF Finder program (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)查找和翻译开放阅读框；运用ExPASyProtParam工具(http://us.expasy.org/tools/protparam.html)对蛋白的理化性质进行在线分析；使用ProtScale程序(http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl)分析蛋白的疏水性；信号肽用SignalP 3.0 server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)预测；跨膜结构域用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测；运用COILS Server (http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html)预测蛋白的卷曲螺旋结构域；使用TargetP1.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)对TMSB15A蛋白进行亚细胞定位分析；蛋白二级结构用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)预测；使用DNASTAR/MegAlign软件进行氨基酸序列多重比对；利用MEGA 6软件中phylogeny下的Neighbour-joining法构建荣昌猪TMSB15A基因与其他物种之间的进化树，进化树的每一个分支均用重复测试1 000次来进行评估。
1.7 实时荧光定量PCR利用GoTaq® qPCR Master Mix检测TMSB15A在猪各组织的表达量，荧光定量PCR反应在ABI 7900 HT fast real-time PCR system上进行。10 μL反应体系：GoTaq® qPCR Master Mix(2×) 5 μL，正、反向引物各0.2 μL(10 μmol·L-1)，CXR 0.1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3.5 μL。反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，40个循环。每个样品3个重复。熔解曲线为仪器默认设置。采用2-ΔΔ CT方法计算TMSB15A基因在荣昌猪各组织中的表达量[15]。TMSB15A及内参ACTB的引物信息见表 2。
1.8 统计分析使用Excel整理试验数据并制作图表，用SPSS19软件中的Student’s t-test或ANOVA进行差异显著性分析，P＜0.05表示达到显著水平。
2 结果 2.1 荣昌猪TMSB15A基因的克隆及序列分析荣昌猪胸腺RNA经RACE-PCR扩增得到的TMSB15A基因各片段产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测结果如图 1所示。将各片段产物测序后进行拼接，得到TMSB15A基因cDNA。基因cDNA全长序列在NCBI数据库中进行同源性搜索，结果表明，该基因属于胸腺素β家族。应用ORF Finder程序对TMSB15A基因序列分析表明(图 2)，TMSB15AmRNA全长654 bp(GenBank登录号：KU356694)，其中CDS区长138 bp，编码45个氨基酸，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，5′ UTR和3′ UTR区长分别为86和430 bp。
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M. DL 2000 marker 图 1 TMSB15A基因RACE-PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图 Figure 1 Agrose gel electrophoresis of RACE-PCR amplification of TMSB15A gene |
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上排字母表示核苷酸序列，其中大写字母代表CDS区，小写字母代表 5′ UTR区和3′ UTR区；下排字母表示CDS区编码的氨基酸序列；“*”代表终止密码(TAA) The upper-row letters represent the nucleotide sequence, where the upper-case letters indicate the CDS region and the lower-case letters indicate the 5′ UTR or the 3′ UTR regions; The down-low letters represent the amino acid sequence coded by CDS region. The asterisk indicates the stop codon (TAA) 图 2 荣昌猪TMSB15A cDNA全长及推导的氨基酸序列 Figure 2 The nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of TMSB15A cDNA in Rongchang pig |
TMSB15A蛋白分子式为C219H367N61O80S2，分子量为5.2 ku，理论等电点为5.3；含有16种基本氨基酸(图 3)，其中含量最高的为Lys(17.8%)；有10个带负电的氨基酸残基(7个Glu，3个Asp)，9个带正电的氨基酸残基(8个Lys，1个Arg)。
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K.赖氨酸; E.谷氨酸; T.苏氨酸; S.丝氨酸; D.天冬氨酸; Q.谷氨酰胺; L.亮氨酸; N.天冬氨酰; P.脯氨酸; V.缬氨酸; R.精氨酸; C.半胱氨酸; G.甘氨酸; I.异亮氨酸; M.蛋氨酸; F.苯丙氨酸 K. Lysine; E. Glutamic acid; T. Threonine; S. Serine; D. Aspartic acid; Q. Glutamine; L. Leucine; N. Asparagine; P. Proline; V. Valine; R. Arginine; C. Cysteine; G. Glycine; I. Isoleucine; M. Methionine; F. Phenylalanine 图 3 TMSB15A蛋白的氨基酸组成 Figure 3 The amino acid composition of TMSB15A protein |
TMSB15A蛋白并不包含疏水性氨基酸，所有的亲水性氨基酸均匀地分布于整个多肽链中；该蛋白无信号肽、跨膜结构域以及卷曲螺旋结构域；亚细胞定位揭示该蛋白既不位于线粒体也不位于分泌通路，表明TMSB15A极有可能在细胞质中发挥作用。
TMSB15A蛋白的二级结构由α-螺旋及无规则卷曲2种结构组成(图 4)，α-螺旋在多肽链的N端和C端均有分布。SWISS-MODEL同源建模揭示，TMSB15A成熟蛋白的三级结构是由α-螺旋和无规则卷曲构成(图 5)，这与二级结构预测结果一致。
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“|”代表无规则卷曲，“┃”代表α-螺旋 "|" represent the random coil; "┃" indicate the α-helix 图 4 TMSB15A蛋白的二级结构预测 Figure 4 The prediction of secondary structure of the TMSB15A protein |
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图 5 TMSB15A蛋白三级结构 Figure 5 The tertiary structure of TMSB15A |
荣昌猪TMSB15A基因的CDS区核苷酸序列与人、长臂猿以及黑猩猩的相似性最高，为93.5%，其次是骆驼，为92.0%，与马的相似性最低，为33.3%(表 3)；荣昌猪TMSB15A氨基酸序列与人、长臂猿以及黑猩猩的相似性最高，为97.8%，其次是骆驼和兔，为93.3%，与马的相似性最低，为11.1%(表 3，图 6)。进化树结果表明，荣昌猪TMSB15A与其他物种的TMSB15A属于同一类群，TMSB15A与小鼠的遗传距离最近，与牛的遗传距离最远(图 7)。
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表 3 荣昌猪TMSB15A CDS区与其他物种之间的同源性分析 Table 3 Analysis of homology of TMSB15A CDS between Rongchang pig and other species |
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共有氨基酸序列用黑色标出；同类氨基酸序列用灰色标出；不同氨基酸用白色标出 The consensus sequences are shadowed in black; The similar amino acids are in gray; The different amino acids are in white 图 6 荣昌猪TMSB15A与其他物种TMSB15A氨基酸序列的多重比对 Figure 6 Alignment of amino acid sequence of TMSB15A between Rongchang pig and other species |
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图 7 TMSB15A基因的物种进化树 Figure 7 Phylogenetic tree of TMSB15A gene from Rongchang pig and other species |
TMSB15A mRNA在所检测的组织中均有表达，但存在显著差异。TMSB15A在脾和胸腺中的表达量最高，在淋巴结及肺中呈中等丰度表达，在心、肝、肾以及肌肉等非免疫器官中表达量较低(图 8)。
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相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，不同字母表示差异显著(P＜0.05) The same letter indicates the difference is not significant(P > 0.05); The different letters indicate the difference is significant (P < 0.05) 图 8 荣昌猪TMSB15A组织表达谱 Figure 8 Tissue expression profile of Rongchang pig TMSB15A |
胸腺素β家族在机体免疫中发挥着重要作用。TMSB15A是胸腺素β家族的一个重要成员。研究发现TMSB15能通过影响细胞克隆生长、转化以及细胞迁移来促进癌症进程，如前列腺癌[16]、乳腺癌[17]以及非小细胞肺癌[18]等。鉴于机体内表达的胸腺素β家族成员通常发挥相同的功能[7]，并且其同家族成员胸腺素β4具有诱导T细胞的表型变化[8]、抑制巨噬细胞的迁移[9]、抑制组织的炎症[10]和嗜中性粒细胞的趋化性[11]等免疫功能，可以推测，TMSB15A对机体的免疫功能具有重要作用。但是，迄今为止，并未见到TMSB15A直接在机体免疫中发挥功能的报道。目前仅在人[19]和鼠[14]上有TMSB15A相关的报道，但是，对该基因的功能也缺乏进一步的深入研究，在猪等其他物种中则是完全没有报道。本研究以荣昌猪胸腺mRNA为模板，克隆了TMSB15A mRNA的全长序列，对TMSB15A序列进行了生物信息学分析，并且检测了TMSB15A在荣昌猪各组织中的表达差异，试验结果为研究TMSB15A基因的功能奠定了基础。
在本研究中，我们获得了荣昌猪TMSB15A mRNA全长，该基因由654个碱基组成，CDS区长为138 bp，5′ UTR和3′ UTR分别长86和430 bp。与NCBI数据库中已有的猪TMSB15A预测序列相比(XM_003135258.3)，本试验获得的TMSB15A mRNA的3′ UTR区较预测序列的3′ UTR区长19 bp，5′ UTR区较预测序列短43 bp，两者的CDS区长度相同。TMSB15A蛋白由45个氨基酸组成，且无疏水性氨基酸，表明该蛋白是一个亲水性蛋白。M.Frohm等[20]发现，胸腺素β能够分泌到细胞外，但是其作用机理还不清楚。荣昌猪TMSB15A蛋白并不包含有助于TMSB15A蛋白穿过细胞膜和细胞器膜的信号肽及跨膜结构域，但其二级结构包含α-螺旋，通常α-螺旋与信号肽的跨膜功能有关[21-22]，因而，可以推测，TMSB15A蛋白中的α-螺旋可能促进了TMSB15A蛋白向细胞外的分泌。人的TMSB15A蛋白是一种具有多种功能的酸性蛋白[7]，由45个氨基酸残基组成，并且不包含信号肽、跨膜结构，是一类位于细胞质中的蛋白。本研究蛋白结构分析揭示，荣昌猪TMSB15A是一类多肽分子，具有胸腺素β家族成员的典型特征，这进一步证明了所克隆的TMSB15A基因属于胸腺素β家族。
氨基酸序列多重比对揭示，荣昌猪TMSB15A蛋白在人、长臂猿和黑猩猩之间高度保守(97.8%)，因此，荣昌猪TMSB15A蛋白可能发挥着与哺乳动物TMSB15A蛋白相似的功能[23]。进化树分析揭示，荣昌猪TMSB15A基因可以与其他物种聚类到一起，说明荣昌猪TMSB15A基因在进化上是保守的，这些物种的TMSB15A基因极有可能由共同的祖先进化而来。这表明TMSB15A基因具有悠久的进化历史。
胸腺素β家族许多成员广泛表达于各种组织和细胞[24-27]。研究发现，TMSB15A在人的许多癌细胞和癌症患者的组织中上调表达[12]。然而，TMSB15A在正常个体的不同组织中的分布情况未见报道。在小鼠中，仅有研究发现该基因在小鼠大脑区域有4个剪切变异体表达，而TMSB15A在其他组织中的表达尚未见报道[14]。在本试验中，我们研究了TMSB15A mRNA在荣昌猪各组织中的表达分布，结果发现，TMSB15A在所测试的组织中均有表达，但在脾和胸腺中的表达水平显著高于其他组织。虽然TMSB15A在淋巴和肺中的表达不显著高于心、肝、肾和肌肉，但是较心、肝、肾及肌肉表达量高的趋势较明显。造成差异不显著的原因可能是个体间的差异，这需要进一步扩大样本含量来验证。总体来说，TMSB15A mRNA在荣昌猪免疫组织(脾、胸腺、淋巴)中的表达高于其他组织。虽然肺不是免疫组织，但由于其是呼吸器官，经常接触空气中的病原体，因而TMSB15A在肺中的表达量较其他非免疫组织中的表达量高。因此，TMSB15A基因可能与其同家族成员一样，在机体免疫应答中发挥着重要作用，但其具体功能还有待进一步研究。
4 结论荣昌猪TMSB15A基因全长654 bp，其中CDS区长138 bp，编码45个氨基酸，5′ UTR和3′ UTR分别长86和430 bp，其在氨基酸水平上与其他物种的TMSB15A高度同源；TMSB15A蛋白是一类位于细胞质内、与小鼠遗传距离最近的蛋白；TMSB15A在荣昌猪脾和胸腺中表达量最高(P＜0.05)，在淋巴结和肺中呈中等丰度表达，在心、肝、肾和肌肉中表达量较低。
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