2. 石河子大学动物科技学院, 石河子 832000;
3. 中国农业大学动物医学院, 北京 100193
2. College of Animal Science and Technology, Shihezi University, Shihezi 832000, China;
3. College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193, China
细粒棘球绦虫属于扁形动物门，绦虫纲，棘球属，其幼虫——细粒棘球蚴寄生于中间宿主牛、羊等动物以及人类，引起严重的脏器损伤，是一种危害性极其严重的人畜共患寄生虫病[1-2]。该病呈世界性分布，我国有20余省份有该病发生，主要流行于西部一些牧区，包括青海、西藏、新疆等地。据估计国内包虫病的患者人数达35万~130万[1]。细粒棘球绦虫需要经历中间宿主和终末宿才能完成其生活史。犬科动物诸如犬和狼等是其终末宿主，狐狸同样是其终末宿主，牛、羊、骆驼等动物，以及人类均是其中间宿主[3]。其生活史如下，成虫寄生于犬科动物的小肠，成熟的孕卵节片脱落，随粪便排出体外，污染周围环境，中间宿主误食虫卵后，虫卵在宿主体内孵化出六钩蚴，六钩蚴钻过肠壁，随血液循环到达全身各处，形成包囊，包囊由外部的囊壁包围，内部充满包囊液，并且处于囊壁内测的生发层可以产生原头蚴。当终末宿主误食了感染的动物脏器(主要为肝和肺)后，原头蚴可以在终末宿主小肠内，在胆酸盐的调控下发育成成虫[3]。包虫病是一种严重的“被忽视的疾病”，我们急需了解虫体的免疫逃避机制，宿主与虫体的互作以及虫体的免疫致病机制，同时我们需要为诊断以及疫苗设计发掘出一些新的分子靶标。
系统地对细粒棘球绦虫转录组以及蛋白质组进行研究，将为进一步研究虫体发育生物学以及虫体与宿主间的互作提供非常有价值的信息。近年来，细粒棘球绦虫的基因组以及转录组数据相继发表[4-6]。同时，也有一些研究者采用双向电泳以及质谱技术对细粒棘球绦虫的蛋白质组进行了分析[7-14]，从中鉴定出了大量的抗原蛋白质以及一些与宿主免疫逃避相关的蛋白质[15-18]。
为了进一步发掘虫体幼虫阶段的抗原蛋白质以及与虫体生长发育紧密相关的功能性蛋白质和信号通路，本研究采用LC-MS/MS技术对原头蚴表达的蛋白质进行了系统的研究。这些数据将帮助研究者发掘出更多的疫苗以及治疗靶标，同时将为诊断提供更多潜在靶标基因。
1 材料与方法 1.1 材料在新疆石河子市牛羊定点屠宰场采集细粒棘球蚴感染的绵羊肝，低温保存带回实验室，用酒精棉球对脏器表面做消毒处理，用无菌注射器吸取囊液，于无菌条件下剪开包囊的顶部，取出内囊于一无菌平皿中，用加双抗的无菌PBS液反复吹打冲洗3~5次，收集虫体沉淀，备用。
1.2 方法 1.2.1 细粒棘球绦虫原头蚴基因型鉴定提取细粒棘球绦虫原头蚴基因组DNA，然后参照文献提供的方法[19]，以细粒棘球绦虫线粒体COX1基因为扩增靶标，以JB3 (5′-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3′)，JB4.5 (5′-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3′)为扩增引物，进行PCR扩增，纯化PCR扩增产物送公司测序，最后对测序所得序列进行生物信息学分析，确定其基因型。
1.2.2 虫体蛋白质的提取取出液氮冻存的细粒棘球绦虫原头蚴，用液氮研磨成干粉，加入200 μL的TEAB溶液溶解，加入4倍体积的冷丙酮(含终浓度为10 mmol·L-1的DTT)沉淀2 h，13 000 r·min-1离心20 min，弃上清，加入800 μL的冷丙酮(含终浓度为10 mmol·L-1的DTT)重悬沉淀，13 000 r·min-1离心20 min，弃上清，室温风干沉淀，加入100 μL TEAB溶解蛋白质，最后采用选择常规的Bradford定量方法定量总蛋白质。
1.2.3 LC-MS/MS质谱检测与数据处理将样品通过LC-MS/MS进行蛋白质检测。对质谱数据用ProteinPilot软件进行检索和筛选。对于LC-MS/MS的鉴定结果，需进一步过滤，对于鉴定到的蛋白，unused score≥1.3 (即可信度水平在95%/以上)，每个蛋白至少包含一个unique肽段的蛋白质为可信蛋白质，不符合该条件的蛋白质不包括在结果中：对于鉴定的肽段，可信度在95%以上认为可信肽。对于蛋白质定量，为了得到更全面的关于某蛋白质的定量信息，ProteinPilot软件使用了conf≥15的所有肽段，不符合该条件的肽段不包含在结果中。运用富集分析算法对初步鉴定的蛋白质数据进行分组，鉴定的蛋白质与数据库进行比对，选择GO(gene ontology)的生物过程、细胞成分和分子功能注释对蛋白质进行分类；选择KOG(clusters of orthologous group of protein)对未知蛋白质序列进行功能注释；选择KEGG(Kyoto Encyclopedia of genes and genomes)对蛋白质进行信号通路分析。
1.2.4 β-catenin基因在细粒棘球绦虫原头蚴体外培养不同时间的mRNA转录水平 1.2.4.1细粒棘球绦虫原头蚴的体外培养：将无菌采集的细粒棘球绦虫原头蚴按2 000枚·mL-1的培养密度接种于含10%胎牛血清的RPMI-1640为主的培养液中，于37 ℃，5% CO2的恒温培养箱中培养，每3 d更换一次培养液，分别在培养0、4、10 d采集样品，保存于液氮中，备用。
1.2.4.2β-catenin基因在细粒棘球绦虫原头蚴体外培养不同时间的mRNA转录水平分析：提取不同培养时间的原头蚴组织样品总RNA，反转录成cDNA，以体外培养0、4和10 d的cDNA为模板，以β-actin为内参基因，对β-catenin基因进行qRT-PCR扩增，反应体系：SYBR Premix Ex Taq Mix(2×) 10 μL，上游引物(10 mmol·L-1)0.4 μL，下游引物(10 mmol·L-1)0.4 μL，cDNA 1 μL，加ddH2O至20 μL。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，共40个循环。每个基因做三个重复，采用相对比较ΔCt (Qr=2-ΔΔCt) [20]法对β-catenin基因在细粒棘球绦虫原头蚴不同培养时间的相对转录量进行分析。
1.2.5 β-catenin基因在细粒棘球绦虫原头蚴体外培养不同时间的组织分布全量组织荧光原位杂交的操作流程主要参照Olson实验室网站(http://www.olsonlab.com/)公开的操作方法以及相关文献提供的方法[21-23]进行。主要包括以下步骤：(1) 将液氮冻存的细粒棘球绦虫原头蚴取出，在无RNA酶PBS配制的多聚甲醛中4 ℃过夜固定；(2) 将过夜固定的原头蚴在PBST溶液中洗脱3次；(3) 将原头蚴依次在15 μg·mL-1蛋白酶K溶液中作用10 min，在0.1 mol·L-1 TEA溶液中作用2次，每次5 min，在0.25%乙酸酐溶液中作用2次，每次5 min，再用PBST洗脱2次，每次5 min，然后在多聚甲醛中固定20 min，最后再用PBST洗脱；(4) 预杂交，在原头蚴中加入预杂交液，60 ℃预杂交24 h；(5) 杂交，将带有FITC标记的杂交探针加入杂交液中，使其质量浓度为0.2~2.0 ng·μL-1，将杂交探针在80 ℃变性3 min，然后置冰上3 min，最后将变性好的探针加入到原头蚴中，57 ℃杂交16~24 h；(6) 杂交后洗脱，用预杂交液57 ℃洗脱10 min，用含有0.1% Tween-20的2×SSC 57 ℃洗脱3次，每次20 min，用含有0.1% Tween-20的0.2×SSC 57 ℃洗脱3次，每次20 min；(7) 封片，在标本上滴加20 μL含有碘化丙啶(PI)和抗荧光猝灭剂的封片剂，盖上盖玻片后，暗处静置15 min后，用尼康荧光共聚焦显微镜观察。阴性对照试验：不加任何探针，其余步骤同上。
2 结果 2.1 细粒棘球绦虫基因型鉴定采用核酸测序法对新疆石河子地区细粒棘球绦虫线粒体COX1基因片段进行测序分析，结果显示基因扩增大小为417 bp。以GenBank数据库中已登陆的细粒棘球绦虫不同基因型COX1基因序列为参照序列，分别为G1(登录号JF828337)、G2(登录号M84662)、G3(登录号DQ856466)、G4(登录号M84664)、G5(登录号M84665)、G6(登录号M84666)、G7(登录号M84667)、G8(登录号AB235848)、G10(登录号AF525457)，以亚洲带绦虫(登录号AB465211) 为外组，利用Mega5.1软件进行遗传进化分析，由图 1可见，此分离株与G1基因型遗传进化关系最近。
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图 1 基于细粒棘球绦虫线粒体COX1基因系统发育树 Figure 1 Phylogenetic tree based on E. granulosus mt COX1 gene |
本试验中质谱数据采集自Orbitrap Elite高分辨率质谱仪，能够获得高质量的MS1和MS2图谱。然后使用Maxqunt对MS图谱数据进行分析，最终获得每张MS2图谱的得分。从图 2中可以看出，MS2的Maxquant得分较为理想，大约95%的肽段得分在30分以上。每一套数据在定性分析工作中均使用蛋白质、肽段FDR＜0.01作为筛选标准，结合所得的优秀肽段得分分布情况，进一步说明MS试验数据质量较高。
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横坐标为Maxquant肽段得分；纵坐标表示鉴定到的具有对应离子得分的肽段数量 The abscissa represents the score of Maxquant peptide; the coordinate represents the number of peptides with corresponding ion identification to score 图 2 肽段离子得分分布 Figure 2 The map of the peptide ion score distribution |
本研究共分离得到7 172个肽段，其长度最小为7个氨基酸，最大为34个氨基酸，平均长度为11个氨基酸，见图 3。
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横坐标为鉴定到的肽段序列的氨基酸个数；纵坐标为鉴定到的肽段数量 The abscissa represents the number of amino acids identified in the peptide sequence; the coordinates represents the number of identification of peptides 图 3 肽段序列长度分布 Figure 3 The map of the peptide sequence length distribution |
本研究共分离鉴定得到1 197个蛋白质，其最小相对分子质量为5.83 ku，属于细粒棘球绦虫的假定蛋白hypothetical protein，对应蛋白质文库编号为CDJ21276.1，EgrG_001125850。其最大相对分子质量为1 224 ku，属于细粒棘球绦虫的肌联蛋白titin，对应蛋白质文库编号为CDJ19039.1。平均相对分子质量为62.19 ku，见图 4。
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横坐标为鉴定到的蛋白质的相对分子质量；纵坐标表示鉴定到的具有对应相对分子质量的蛋白质数量 The abscissa represents the relative molecular weight of identified protein; the coordinate represents the number of the protein with corresponding the relative molecular mass 图 4 鉴定蛋白质相对分子质量分布 Figure 4 The map of relative molecular weight distribution of identified proteins |
本研究运用富集分析算法对初步鉴定的1 197个蛋白质数据进行分组，鉴定的蛋白质与数据库进行比对，选择GO(gene ontology)的生物过程、细胞成分和分子功能注释对蛋白质进行分类、注释。结果显示，在生物过程中，有546个蛋白质与代谢相关，有56个蛋白质与生殖相关，有30个蛋白质与免疫相关，有236个蛋白质与发育相关，有424个蛋白质与生物调控相关；在细胞成分中，有868个蛋白质与细胞组分相关，有402个蛋白质与细胞膜相关；在分子功能中，有647个蛋白质与结合相关，有355个蛋白质与催化活性相关，有86个蛋白质与结构分子活性相关，有42个蛋白质与酶调节活性相关，见图 5。
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图 5 蛋白质的GO功能分类 Figure 5 Functional classification of proteins based on gene ontology |
本研究使用BLASTP将获得1 197个蛋白质基因集序列与eggNOG数据库进行比对，获得基因对应的KOG。结果显示，有155个蛋白质参与翻译后修饰、蛋白质转换以及分子伴侣过程，有132个蛋白质参与机体的一般功能，有123个蛋白质参与信号传导，有122个蛋白质参与细胞骨架的形成，但未发现与机体二次代谢产物合成、转运和代谢相关的蛋白质，见图 6。
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图 6 蛋白质的KOG功能分类 Figure 6 Functional classification of proteins based on eukaryotic orthologous groups of proteins |
信号通路分析结果显示鉴定的1 197个蛋白质中有596个蛋白质参与276个调控通路，诸如与虫体发育紧密相关的Wnt、Notch、Hedgehog、NF-κB、cAMP以及胆酸盐信号通路，依次对应的信号通路编号为ko04310、ko04030、ko04110、ko04064、ko04024和ko04976。但一些与氨基酸合成相关的通路发生缺失。
2.4 β-catenin基因在细粒棘球绦虫原头蚴体外培养不同时间段表达规律分析采用qRT-PCR对β-catenin基因在细粒棘球绦虫原头蚴体外培养不同时间段表达规律分析结果表明，随着培养时间的增长，β-catenin基因的表达呈下降趋势，且培养0和4 d相比较，差异显著(P＜0.05)，培养0和10 d相比较，差异极显著(P＜0.01)(图 7)。
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*.P＜0.05; **.P＜0.01 图 7 β-catenin在细粒棘球绦虫原头蚴体外培养不同时间段的差异表达 Figure 7 Differential transcription of β-catenin in different phages of E.granulosus |
采用全量组织原位杂交的方法对β-catenin基因在细粒棘球绦虫原头蚴的组织分布进行了分析，结果显示，β-catenin基因主要分布于细粒棘球绦虫原头蚴顶突的小刺部位，以及原头蚴散在的细胞中，图中绿色荧光为阳性杂交结果，红色为PI染核结果，见图 8。
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Ⅰ~Ⅲ.体外培养0 d Merge(200×)，FITC(200×)，PI(200×)；Ⅳ~Ⅵ.体外培养4 d Merge(200×)，FITC(200×)，PI(200×)；Ⅶ~Ⅸ.体外培养10 d Merge(200×)，FITC(200×)，PI(200×)。H.小刺；C.散在的细胞，阳性杂交结果为绿色，细胞核为红色 Ⅰ-Ⅲ. The distribution of β-catenin in protoscoleces in vitro culture on 0 day, Merge(200×), FITC(200×), PI (200×); Ⅳ-Ⅵ. The distribution of β-catenin in protoscoleces in vitro culture on 4 days, Merge(200×), FITC(200×), PI(200×); Ⅶ-Ⅸ. The distribution of β-catenin in protoscoleces in vitro culture on 10 days, Merge(200×), FITC (200×), PI(200×). H. Hooks; C. Dispersed cells, Whole-mount in situ hybridization signal is shown in green and nuclear PI staining in red 图 8 β-catenin基因在细粒棘球绦虫原头蚴的组织定位 Figure 8 β-catenin in E. granulosus protoscoleces in situ hybridization results |
此前，G. Chemale等[7]、K. M. Monteiro等[8]和C. Hidalgo等[13]运用2DE-MS以及LC-MS/MS技术从细粒棘球绦虫原头蚴分别分离鉴定出了15、61和94个蛋白质。之后S. J. Cui等[12]运用2DLC-MS技术在细粒棘球绦虫原头蚴以及成虫共鉴定出1 610个蛋白质。本研究运用LC-MS/MS技术对细粒棘球绦虫原头蚴的蛋白质组进行了研究，共分离鉴定出1 197个蛋白质。
对细粒棘球绦虫原头蚴蛋白质组的进一步分析将会为理解原头蚴蛋白质表达特性提供新的视角。本研究在细粒棘球绦虫原头蚴中共鉴定得到274个各种酶相关的蛋白质，其中与合成相关的有10种酶，7种与ATP的合成相关，没有鉴定到与氨基酸合成相关的酶，这一结果进一步证实了细粒棘球绦虫无法自身合成氨基酸，而靠摄取宿主氨基酸提供营养的学说[4, 24]。有27种各种激酶相关的蛋白质，包括cAMP依赖蛋白激酶、cGMP依赖蛋白激酶、整合素连接蛋白激酶、丙酮酸激酶、己糖激酶、磷酸甘油酸激酶、S期激酶相关蛋白、钙调蛋白依赖性蛋白激酶、丝氨酸：苏氨酸蛋白激酶、腺苷酸激酶、酪氨酸蛋白激酶、6-磷酸果糖激酶、表皮生长因子受体激酶等，其中6-磷酸果糖激酶是血吸虫的一种有效抗原[25-26]；己糖激酶和丙酮酸激酶是两个重要的激酶，已有的研究表明它们是锥虫和疟原虫的药物靶标[27-28]。同时鉴定到9种氨基肽酶，包括2个亮氨酰氨肽酶、天冬氨酰氨基肽酶、嘌呤霉素敏感的氨基肽酶和肽酶CLP S14家族等，其中亮氨酰氨肽酶是反刍动物肝片吸虫的候选疫苗抗原[29]。鉴定到9个水解酶相关的蛋白质，包括脂肪酸酰胺水解酶和4个泛素羧基末端水解酶等。鉴定得到27个脱氢酶相关的蛋白质，包括11个NADH脱氢酶相关蛋白质、谷氨酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶等，其中谷氨酸脱氢酶是捻转血矛线虫的诊断抗原[30]。鉴定到19个还原酶相关的蛋白质，包括NADH-泛醌氧化还原酶、硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶、核糖核苷酸还原酶和阿尔多酮还原酶等，其中硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶是绦虫和吸虫的一种潜在药靶[31]。
此外，本研究还分析了其他潜在的抗原蛋白质，包括13个四跨膜蛋白质相关的抗原蛋白质，属于5个亚型，分别为TSP1、TSP2、TSP5、TSP6和TSP16，已有的研究表明此蛋白家族是泡状棘球蚴病和血吸虫病的疫苗候选靶标[32-33]。9个表膜抗原蛋白质，研究表明其中有些表膜蛋白与虫体的免疫逃避相关[34]。10个钙链接抗原蛋白质，有研究者用钙链接抗原蛋白1为诊断抗原，建立了人包虫病ELISA诊断方法，结果显示其检测特异性和敏感性均与商品化的检测试剂盒无显著性差异，提示该抗原可作为人类包虫病诊断的候选靶标[35]。3个虫卵抗原，1个绦虫特异性抗原Ag B，1个诊断抗原gp50，有研究表明此抗原可作为多头带绦虫的早期诊断抗原，用于山羊多头蚴病的诊断[36]。其他一些潜在的抗原还包括cd63、多价抗原TPI、增殖细胞核抗原、糖蛋白抗原5、猪囊尾蚴特异性抗原、绦虫特异性抗原B家族以及早期内涵体抗原1等。
3.2 细粒棘球绦虫原头蚴信号通路分析信号通路分析结果显示原头蚴表达的1 197个蛋白质中有632个蛋白质参与276个调控通路，诸如与虫体发育紧密相关的Wnt、Notch、Hedgehog、NF-κB、cAMP以及胆酸盐信号通路。其中，Wnt信号通路为动物体轴发育关键的信号通路，前期的研究表明，细粒棘球绦虫具有完整的Wnt信号通路主要成员，包括细胞外因子wnt分子(wnt1、wnt2、wnt4、wnt5、wnt11a和wnt11b)，跨膜受体卷曲蛋白frizzled 5和低密度脂蛋白受体分子LRP，胞质蛋白(蓬乱蛋白Dsh、β-连环蛋白β-catenin、糖原合成酶激酶3β GSK-3β、轴抑制蛋白Axin、腺瘤性结肠息肉病蛋白APC等)，以及下游的核内转录因子包括T细胞因子TCF和淋巴细胞增强因子LEF[37-39]。β-catenin为wnt/β-catenin信号通路的第二信使，在整个信号传导中具有非常重要的作用[38]，本研究首次揭示了其在细粒棘球绦虫原头蚴中的分布，为进一步研究其生物学功能提供了理论依据。同时前期的研究还表明，在细粒棘球绦虫原头蚴中，wnt分子主要表达于虫体的前后轴区域[40]，笔者所在的实验室还发现在成熟扩展莫尼茨绦虫中，wnt分子主要分布于虫体的节间腺以及雌雄生殖系统[41]，后续在细粒棘球绦虫原头蚴体外培养试验中发现，当阻断Wnt信号通路时，可促进细粒棘球绦虫头节外翻的进程(数据尚未发表)。结合wnt在其他物种中的作用，以及其他学者以及本试验前期开展的一些试验，笔者初步推测，Wnt信号通路在细粒棘球绦虫体轴形成过程中可能发挥重要作用，同时在虫体生殖细胞的发育过程中可能扮演着重要的调控作用。
另外，我们在细粒棘球绦虫原头蚴中还发现对虫体发育至关重要的一个信号通路，即胆酸盐信号通路。众所周知，细粒棘球绦虫原头蚴具有双向发育的特性，即在中间宿主体内，原头蚴可经无性生殖发育成新的包囊；在终末宿主体内，原头蚴经有性生殖发育形成成熟的虫体。已有的研究表明胆酸盐在细粒棘球绦虫原头蚴发育成成虫的过程中具有至关重要的作用[42]。
4 结论运用LC-MS/MS技术对细粒棘球绦虫原头蚴表达的蛋白质进行了较为系统的分析，结果鉴定得到了1 197个蛋白质，对其进行进一步分析发现，这些蛋白质参与细粒棘球绦虫原头蚴的生长发育、生殖、代谢以及免疫调控等多个方面。其中有大量的蛋白质参与虫体生长发育等密切相关的信号通路，诸如Wnt、Notch、Hedgehog等信号通路。通过解析细粒棘球绦虫原头蚴的蛋白质表达特性，将有助于我们发掘出一些潜在的抗原以及诊断靶标，为进一步揭示细粒棘球绦虫原头蚴的生长发育机制以及研制新型疫苗、药物和诊断方法提供理论依据。
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