, YUE Hui-xi, LIU Hong-ming, CAO San-jie, WU Rui, HUANG Xiao-bo, WEN Yi-ping, ZHAO Qin, WEN Xin-tian
流行性乙型脑炎(epidemic encephalitis B)又称日本乙型脑炎，简称乙脑，是由黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)的乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)引起的一种蚊媒性人兽共患传染病[1]。该病属于自然疫源性疾病，可通过蚊虫叮咬传播，在流行季节，病毒很容易通过“猪—蚊—猪”的方式扩散。乙脑病毒广泛分布于世界各地，特别是亚洲、西太平洋国家以及澳大利亚北部，现认为该病毒起源于马来西亚及印度尼西亚，并随着基因的不断进化，该病毒迅速在亚洲及周边地区扩散蔓延[2-4]。根据乙脑病毒C/PrM及E基因序列的差异，可将乙脑病毒分为具有明显地域特点的5个基因型，其中基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型主要分布在亚洲，基因Ⅳ型主要分布在印度尼西亚，而基因Ⅴ型最先分离自马来西亚，而后也相继在中国和韩国发现该型病毒[5-8]。近年来，随着全球气候、环境的不断改变，乙脑病毒基因型的分布有了较大变化，比如在中国、韩国、日本、越南等国相继分离到基因Ⅰ型乙脑病毒，而在2007年之前只存在基因Ⅲ型乙脑病毒的印度，也分离出了基因Ⅰ型乙脑病毒[9-13]。
我国是一个养猪大国，乙脑在猪群中的感染较为常见，母猪感染后可出现高热、流产、产死胎及木乃伊胎，公猪多表现为睾丸炎。乙脑除杀灭蚊虫及免疫接种外，目前尚无特效疗法，而现行我国兽用乙脑疫苗只有SA14-14-2株减毒活疫苗及HW1株鼠脑灭活苗，且均为基因Ⅲ型。研究发现，基因Ⅲ型疫苗对基因Ⅰ型乙脑病毒只能产生部分保护力，因此开发基因Ⅰ型乙脑疫苗显得尤为迫切[14]。笔者通过对2株基因Ⅰ型乙脑病毒的免疫原性进行筛选，拟挑选出一株免疫原性显著优于商品化乙脑灭活苗的毒株，为我国养猪业基因Ⅰ型乙脑的防控奠定基础。
1 材料与方法 1.1 生物材料乙型脑炎病毒YA1株、CZ株，BHK-21细胞均由四川农业大学猪病研究中心保存；SPF级昆明小鼠、清洁级豚鼠购自简阳达硕动物科技有限公司；4周龄仔猪购自雅安某猪场。
1.2 主要试剂DMEM培养基、新生牛血清、青链霉素购自GIBCO公司；佐剂ISA206购自法国Seppic公司；猪乙型脑炎油乳剂灭活苗购自武汉中博生物股份有限公司；猪乙型脑炎抗体检测试剂盒购自武汉科前生物股份有限公司。
1.3 病毒的鼠脑传代分别取冻干保存的YA1株、CZ株乙脑病毒于BHK-21细胞上复苏，待细胞出现80%CPE后收获病毒液。取收获的病毒液以25 μL脑内接种7日龄昆明乳鼠，2 d内死亡的小鼠不计。待小鼠出现离群、弓背、抽搐等明显症状后剖取鼠脑，用DMEM培养基制备成10%无菌鼠脑病毒液。取该病毒液继续脑内接种7日龄乳鼠，连续传代5次。
1.4 小鼠半数致死量(LD50)的测定将待测病毒液用不含血清的DMEM培养基作10倍梯度稀释至10-5~10-10，每个稀释度脑内接种2周龄小鼠，每个稀释度5只，每只40 μL，弃2 d内死亡的小鼠不计，其余小鼠连续观察14 d，记录小鼠死亡情况。按照Reed-Muench法计算YA1株、CZ株乙脑病毒复苏后的细胞毒与鼠脑毒第5代的LD50。
1.5 鼠脑灭活苗的制备分别将灭活的YA1株、CZ株鼠脑毒(灭活条件：体积分数0.02%甲醛，37 ℃灭活48 h，体积分数0.02%的硫代硫酸钠终止灭活)与等体积的ISA206佐剂加热至31 ℃。佐剂以350 r·min-1预乳化5 min，将病毒液缓慢倒入佐剂中，继续以350 r·min-1乳化5 min，乳化结束后室温静置1 h，4 ℃保存。
1.6 小鼠免疫试验 1.6.1 小鼠IgG抗体水平的测定3周龄SPF级昆明雌鼠20只，随机分为4组，每组5只。分别用YA1株、CZ株鼠脑灭活苗、HW1株商品化鼠脑灭活苗以及PBS对小鼠进行免疫，每只腹腔接种0.5 mL，2周后同等剂量加强免疫一次。分别于免疫后0、2、4、6、8周断尾采血，分离血清，按照武汉科前公司的乙脑抗体检测试剂盒检测血清中IgG抗体水平，并使用SPSS对数据进行分析。
1.6.2 小鼠免疫攻毒保护试验3周龄SPF级昆明雌鼠80只，随机分为8组，每组10只。分别用YA1株、CZ株鼠脑灭活苗原液、10、100倍稀释液以及HW1株商品化鼠脑灭活苗对小鼠进行免疫，每只腹腔注射0.3 mL，同时设置一组空白对照。免疫1周后以同等剂量加强免疫一次。二免后1周用乙脑强毒YA1株鼠脑毒第10代脑内攻毒，每只注射25 μL(100LD50)，连续观察14 d，记录小鼠发病死亡情况。
1.7 豚鼠免疫试验 1.7.1 豚鼠的分组及免疫300~400 g成年清洁级豚鼠16只，随机分为4组，每组4只。分别用自制的YA1株、CZ株鼠脑灭活苗、HW1株商品化鼠脑灭活苗以及PBS对小鼠进行免疫，每只肌肉注射0.5 mL，初次免疫后2周以同等剂量加强免疫1次。二免后2周心脏采血，分离血清，采用HI试验检测豚鼠血清血凝抑制抗体水平。
1.7.2 血凝试验以YA1株为感染毒株，脑内接种7日龄乳鼠，待乳鼠发病后收取鼠脑采用蔗糖-丙酮提取法制备乙脑病毒血凝素。取96孔V型微量板，每孔加入pH 9.0的BABS 25 μL，每排的第一孔加入25 μL血凝素，混匀后吸取25 μL至第二孔作等量倍比稀释至倒数第二孔，并从倒数第二孔中吸去25 μL。最后一孔不加血凝素作红细胞对照。每孔加入BABS 25 μL，混匀，25 ℃放置60 min，最后每孔中加入50 μL 0.33%的鸽红细胞悬液，混匀，37 ℃作用1 h后判断结果。
结果判定：++++(#)表示红细胞100%被凝集；+++表示红细胞约75%被凝集；++表示红细胞约50%被凝集；+表示红细胞约25%被凝集；－表示红细胞不被凝集。以出现“++”以上凝集的血凝素最高稀释倍数的倒数为其血凝效价。HI试验中抗原采用4单位凝集抗原。
1.7.3 血凝抑制试验(HI)取灭活后的待检血清50 μL，加入pH 9.0 BS 150 μL、25%的高岭土200 μL，振荡混匀，37 ℃孵育20 min，2 500 r·min-1离心30 min，取上清。加入50 μL鸽红细胞泥，混匀，冰浴吸附20 min，1 500 r·min-1离心10 min，收集上清，即为1:8稀释度的被检血清。
取96孔V型微量板，每孔加入pH 9.0的BABS 25 μL，于每排第一孔加入25 μL处理过的被检血清，混匀后吸取25 μL至第二孔，混匀，以此倍比稀释至最后一孔，最后一孔弃25 μL。于每孔中加入25 μL 4单位的血凝素，室温作用1 h后加入50 μL 0.33%的鸽红细胞悬液，37 ℃作用1 h后判断结果。
1.8 仔猪免疫试验 1.8.1 仔猪抗体水平的测定28日龄乙脑抗体阴性仔猪20头，随机分为4组，每组5只。分别用自制的YA1株、CZ株鼠脑灭活苗、HW1株商品化鼠脑灭活苗以及PBS对仔猪进行免疫，每只肌肉注射2 mL，首免后14 d以同等剂量加强免疫一次。所有仔猪于首免后0、1、2、3、4、5周采血，分离血清，使用武汉科前公司乙脑抗体检测试剂盒检测血清IgG抗体，并使用SPSS对数据进行分析。
1.8.2 空斑减少中和试验仔猪2免后2周，无菌采血并分离血清。用不含血清的DMEM培养基2倍梯度稀释待检血清，56 ℃灭活30 min。取100 μL适当稀释梯度的待检血清与含100 PFU的乙脑病毒等体积混合，37 ℃作用1 h后，加入长满单层BHK-21细胞的6孔细胞培养板中，每孔200 μL，37 ℃吸附1 h后弃病毒液，按2 mL·孔-1加入含1.25%甲基纤维素的维持液，于37 ℃，含5%CO2培养箱中连续培养3~5 d，弃维持液，结晶紫染色液染色固定20 min，流水反复冲洗细胞板，根据病毒蚀斑形成数计算血清中和抗体效价。
2 结果 2.1 病毒毒价的测定复苏后的乙脑病毒YA1株、CZ株细胞毒的LD50较低，分别为103.7、104.4 LD50·0.04 mL-1，在鼠脑上连续传代5次后病毒LD50明显上升，分别为107.0、107.5 LD50·0.04 mL-1。
2.2 小鼠免疫试验效果 2.2.1 小鼠血清乙脑IgG抗体的检测免疫YA1株、CZ株鼠脑灭活苗和HW1株商品化鼠脑灭活苗组的小鼠在免疫后的第2周都能产生一定的抗体，与PBS对照组相比差异显著(P＜0.05)，但各免疫组组间差异不显著；免疫后第4周，3种灭活苗组小鼠的抗体水平进一步提升，与PBS对照组相比差异均极显著(P＜0.01)，其中YA1、CZ株灭活苗组小鼠与HW1株灭活苗组小鼠抗体水平差异极显著(P＜0.01)，但组间差异不显著；免疫后第6周，各灭活苗组小鼠抗体水平还有一定的提高，与PBS对照组相比差异极显著(P＜0.01)，其中YA1、CZ株灭活苗组小鼠与HW1株灭活苗组小鼠抗体水平相比差异极显著(P＜0.01)，组间差异仍不显著；免疫后第8周，各组小鼠抗体水平均出现下降，但与PBS对照组相比抗体水平差异仍极显著(P＜0.01)，其中YA1和CZ株灭活苗组相比HW1株灭活苗组小鼠抗体水平差异仍极显著(P＜0.01)，组间差异依然不显著，详见图 1。YA1株、CZ株鼠脑灭活苗的免疫原性均优于HW1株商品化鼠脑灭活苗，但组间差异不显著。
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与PBS对照组相比，a. P＜0.05，A.P＜0.01；与HW1组相比，b. P＜0.05，B. P＜0.01；与YA1组相比，c. P＜0.05，C.P＜0.01 Compared with PBS group, a.P < 0.05, A. P < 0.01; Compared with HW1 group, b. P < 0.05, B. P < 0.01; Compared with YA1 group, c. P < 0.05, C.P < 0.01 图 1 不同疫苗免疫小鼠前后抗体水平的动态变化 Figure 1 Kinetic change of antibody level in mice of different vaccines post immunization |
2免后7 d对小鼠进行脑内攻毒。结果(图 2)显示，YA1株鼠脑灭活苗原液、10倍稀释液、100倍稀释液对小鼠的保护率分别为70%、50%、30%，CZ株鼠脑灭活苗原液、10倍稀释液、100倍稀释液对小鼠的保护率分别为80%、60%、40%，HW1株商品化鼠脑灭火苗对小鼠的保护率为60%。CZ株鼠脑灭活苗免疫原性优于YA1株及HW1株鼠脑灭活苗。
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图 2 小鼠免疫攻毒后存活率 Figure 2 Survival rate of the immunized mice after challenge |
制备的YA1株乙脑病毒血凝素抗原的血凝效价为1:28，可用于血凝抑制试验。2免后2周，CZ株灭活苗组豚鼠产生的血凝抑制抗体水平显著高于HW1株(P＜0.05)、极显著高于PBS对照组(P＜0.01)，但与YA1株之间差异不显著(图 3)。YA1株、HW1株灭活苗组豚鼠以及PBS对照组豚鼠产生的血凝抑制抗体之间差异不显著。结果表明，CZ株灭活苗的免疫原性优于YA1株和HW1株。
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*.P＜0.05; **.P＜0.01 图 3 豚鼠血凝血凝抑制抗体检测结果 Figure 3 Results of hemagglutination inhibition antibody detection of guinea pigs |
结果见图 4。YA1株灭活苗组仔猪在免疫后一周与PBS对照组相比抗体水平显著上升(P＜0.05)，免疫后两周抗体水平出现一定水平的下降，并在加强免疫后两周抗体水平回升并显著高于PBS对照组(P＜0.05)。CZ株灭活苗组在免疫后一周抗体水平显著上升，极显著高于PBS对照组(P＜0.01)，显著高于HW1商品化灭活苗组(P＜0.05)，第二周抗体水平有所下降，二免后一周抗体水平回升至极显著高于PBS组(P＜0.01)，显著高于HW1株商品化灭活苗组和YA1株灭活苗组(P＜0.05)，并在二免后两周抗体水平上升至极显著高于HW1株商品化灭活苗组和PBS对照组(P＜0.01)，二免后三周抗体水平还略有上升，仍极显著高于HW1株商品化灭活苗组和PBS对照组(P＜0.01)，显著高于YA1株灭活苗组(P＜0.05)。HW1株商品化灭活苗抗体水平虽有一定的起伏，但与PBS对照组相比，差异不显著。结果显示，YA1株和CZ株灭活苗的免疫原性优于与HW1株商品化灭活苗，且CZ株灭活苗相比YA1株灭活苗显示出更高的免疫原性。
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与PBS对照组相比，a. P＜0.05，A.P＜0.01；与HW1组相比，b. P＜0.05，B. P＜0.01；与YA1组相比，c. P＜0.05，C.P＜0.01 Compared with PBS group, a. P < 0.05, A. P < 0.01; Compared with HW1 group, b. P < 0.05, B. P < 0.01; Compared with YA1 group, c. P < 0.05, C.P < 0.01 图 4 不同疫苗免疫仔猪前后抗体水平的动态变化 Figure 4 Kinetic change of antibody level in piglets of different vaccines post immunization |
2免后2周，CZ株灭活苗组仔猪产生的中和抗体效价显著高于YA1株灭活苗组(P＜0.05)，极极显著高于HW1株商品化灭活苗组和PBS对照组(P＜0.001)；YA1株灭活苗组仔猪产生的中和抗体效价极显著高于PBS对照组(P＜0.01)，但与HW1株商品化灭活苗组之间差异不显著；HW1株灭活苗组仔猪产生的中和抗体效价与PBS对照组相比差异不显著。结果表明，YA1株、CZ株灭活苗的免疫原性高于HW1株，其中CZ株更高。
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*. P＜0.05; **. P＜0.01; ***. P＜0.001 图 5 仔猪血清中和抗体检测结果 Figure 5 Results of serum neutralizing antibody detection of piglets |
早先乙脑病毒的流行病学研究主要集中在E蛋白和小部分的基因组序列上，较少进行综合性分析，N. Han等[15]收集了873份拥有完整基因组与宿主信息的乙脑病毒序列，发现基因Ⅰ型和基因Ⅲ型乙脑病毒在遗传和宿主多样性方面存在显著差异，相比Ⅲ型病毒，Ⅰ型病毒具有更窄的宿主范围和更少的人源分离株。L. P. DO等[16]以同等病毒含量的基因Ⅰ型和基因Ⅲ型乙脑病毒同时接种C6/36细胞(蚊源)、PS细胞(猪源)及RD细胞(人源)，在病毒传代过程中发现，Ⅰ型病毒更适于在C6/36、PS细胞中增殖，而Ⅲ型病毒更适于在RD细胞中增殖，这也就解释了基因Ⅰ型如何替代基因Ⅲ型成为优势基因型，同时也解释了基因Ⅰ型乙脑病毒很少从人源材料中分离到。B. K. Kang等[17]在对基因Ⅰ型和基因Ⅲ型乙脑病毒的抗原关系进行比较后发现，免疫Ⅰ型和Ⅲ型病毒所产生的血清能有效中和相对应基因型的乙脑病毒，不能中和不同基因型的病毒。目前猪乙脑的预防主要采用减毒活疫苗SA14-14-2，围绕该毒株展开的工作也较多[18-19]，该疫苗毒株源于人用疫苗毒株，且为基因Ⅲ型，而国内乙脑流行的优势基因型已从Ⅲ型转变为Ⅰ型[20]。基因型的转变对病毒的传播及疫情的暴发所带来的影响不得而知，但重新评价当前基因Ⅲ型乙脑疫苗的有效性以及研发基因Ⅰ型乙脑疫苗是最有效的控制措施。
本研究使用的2个毒株均为基因Ⅰ型，其中YA1株为猪源毒株，CZ株为蚊源毒株。在小鼠免疫试验中发现，自制的YA1株、CZ株鼠脑灭活苗相较于HW1株灭活苗，具有更好的免疫原性，在首免后2周就能产生较高的IgG抗体。在接下来的小鼠攻毒保护试验中未经稀释的YA1株、CZ株灭活苗的攻毒保护率分别为70%、80%，都高于HW1株灭活苗60%的攻毒保护率，且CZ株灭活苗10倍稀释液的攻毒保护率也有60%。该试验攻毒方式采用脑内攻毒，相比传统腹腔攻毒模式，病毒不用通过血脑屏障即可直接感染中枢神经系统，因此相较于腹腔攻毒，其保护率较低，但在免疫原性筛选过程中其结果仍具有参考性。在豚鼠免疫试验中，通过测定YA1株、CZ株、HW1株鼠脑灭活苗免疫豚鼠后所产生的血凝抑制抗体，显示YA1株、CZ株灭活苗产生的血凝抑制抗体明显高于HW1株。而在仔猪免疫试验中，通过测定YA1株、CZ株、HW1株鼠脑灭活苗免疫仔猪后所产生的IgG抗体以及中和抗体的水平，同样也得出YA1株、CZ株鼠脑灭活苗的免疫原性优于HW1株，同时CZ株的免疫原性优于YA1株。本研究成功筛选出一株免疫原性好，可用于制备猪用基因Ⅰ型乙脑鼠脑灭活苗的毒株，这不仅为我国养猪业防控乙脑的流行奠定了一定的基础，还为猪用基因Ⅰ型乙脑减毒活疫苗的研发提供了一株免疫原性好的毒株。
4 结论两株基因Ⅰ型乙脑病毒YA1株、CZ株鼠脑灭活苗在小鼠、豚鼠、仔猪上的免疫原性均优于商品化乙脑病毒鼠脑灭活苗HW1株，其中CZ株乙脑病毒鼠脑灭活苗相较于YA1株显示出更高的免疫原性。为猪用基因Ⅰ型乙脑减毒活疫苗的研发提供了好的材料。
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