党参 (Radix Codonopsis) 具有补中益气、健脾益肺的功效，其主要有效成分为皂苷、生物碱和多糖类等[1]。从中药材中获得的多糖，尤其是β-D-葡聚糖衍生物、糖/蛋白质复合物和蛋白多糖，已被认为具有免疫调节和抗肿瘤的作用，可激活免疫效应细胞 (如淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞)，这些效应细胞在机体的固有免疫和适应性免疫过程中发挥重要作用[2-4]。研究表明，党参多糖 (Codonopsis pilosula polysaccharide，CPPS) 具有广泛的药理作用，主要表现在机体免疫调节、抗肿瘤、抗氧化及造血功能等方面[5-8]。
巨噬细胞是宿主防御病原体入侵和肿瘤生长的关键免疫细胞[9]。活化的巨噬细胞释放出广泛的介质，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α) 以及白细胞介素-6(IL-6) 等细胞因子，这些细胞因子在抗癌和免疫应答过程中发挥重要作用[10-12]。本试验旨在通过将CPPS作用于巨噬细胞RAW 264.7，检测细胞的增殖、细胞因子的mRNA转录和分泌以及NF-кB信号通路的激活，研究CPPS增强机体免疫功能的作用机制，为临床应用提供理论支持。
1 材料与方法 1.1 材料小鼠巨噬细胞RAW 264.7购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。
DMEM培养基、胎牛血清购自Hyclone公司；脂多糖 (LPS) 购自美国Sigma公司；噻唑蓝 (MTT) 购自美国Sigma公司；TNF-α和IL-6 ELISA试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司；Trizol购自北京天根公司；反转录试剂盒购自日本TaKaRa公司；SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒购自Biotool公司；核蛋白和细胞质蛋白质提取试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；BCA蛋白提取试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；HRP兔抗鼠IgG和Western blot化学发光试剂盒购自CWBiotech公司；NF-кB P65(L8F6) mouse mAb (#6956) 购自Cell Signaling Technology公司；IкB-a polyclone antibody (#10268-1-AP)、GAPDH Monoclone Antibody (#60004-1-1g)、TBP Monoclone Antibody (#66166-1-1g) 购自Proteintech公司；引物由北京擎科新业生物科技有限公司合成。
1.2 CPPS的制备及含量测定称取潞党参1 000 g，加入8倍量95%乙醇回流提1 h，过滤留药渣，加入10倍量水煎煮3次，每次1 h，合并煎液，滤过，滤液浓缩至1.15~1.20 g·mL-1，加入乙醇，使含醇量达80%，冷藏静置24 h，滤取沉淀物，减压干燥。采用Sevage法除去蛋白质，苯酚-硫酸法测定CPPS含量。
1.3 细胞培养RAW 264.7细胞用含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM培养基培养，培养条件：37 ℃、5% CO2。取对数期生长的RAW 264.7细胞接种于培养板中，细胞密度为2.5×105·mL-1，培养24 h后根据不同试验设计进行分组处理。
1.4 RAW 264.7细胞增殖的测定RAW 264.7细胞接入96孔板中，加入31.25~4 000 μg·mL-1 2倍倍比稀释的CPPS作用24 h，随后每孔加入20 μL的MTT (5 mg·mL-1) 继续培养4 h，弃去培养液，每孔加入100 μL DMSO，37 ℃孵育30 min后在490 nm处检测每孔的吸光度。根据吸光度值计算相对增殖率。试验重复3次以上。
| $ 相对增值率 = \frac{{实验组{\rm{OD}}均值-对照组{\rm{OD}}均值}}{{对照组{\rm{OD}}均值}} \times 100\% $ |
RAW 264.7细胞接入24孔板中，试验分为空白对照组 (不做任何处理)、阳性对照组 (LPS 200 ng·mL-1) 和不同质量浓度CPPS组 (25、50、100、150和200 μg·mL-1)，按照分组设计分别加入LPS和CPPS作用24 h，随后收集各组细胞上清液，用ELISA试剂盒分别检测TNF-α和IL-6的分泌量。
1.6 TNF-α和IL-6 mRNA转录量的测定RAW 264.7巨噬细胞接入6孔板中，试验分为空白对照组 (不做任何处理)、阳性对照组 (LPS 200 ng·mL-1) 和不同质量浓度CPPS组 (25、50、100、150和200 μg·mL-1)，按照分组设计分别加入LPS和CPPS作用24 h，分别提取各组细胞的总RNA，并反转录成cDNA，RT-PCR检测TNF-α和IL-6 mRNA的转录量。本试验设计引物如表 1。
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表 1 RT-PCR引物序列及产物大小 Table 1 RT-PCR primer sequences and product size |
RAW 264.7细胞在6孔板中培养，试验分为空白对照组 (不做任何处理)、阳性对照组 (LPS 200 ng·mL-1) 和不同质量浓度CPPS组 (25、100 μg·mL-1)，按照分组设计分别加入LPS和CPPS作用24 h，弃去培养基，用预冷的PBS洗两遍，用核蛋白质和细胞质蛋白质提取试剂盒提取各处理组的核蛋白质和细胞质蛋白质。蛋白质浓度经测定后调整同一浓度加入蛋白质上样buffer，跑胶，转膜，封闭，分别加入一抗 (NF-кB p65、IкB-α、TBP、GAPDH)，再加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，显色曝光。用Quantity One软件对NF-кB p65、IкB-α、TBP、GAPDH的条带进行灰度值半定量分析。
1.8 数据分析所有数据均用GraphPad prism 5(GraphPad Software，Inc.，California，USA) 软件分析处理，结果用“x±s”表示，用单因素方差分析差异显著性。
2 结果 2.1 CPPS含量测定测得还原糖的吸光度值为0.197，根据标准曲线计算得还原糖含量为9.84%；总糖的吸光度值为0.296，根据标准曲线计算得总糖的含量为93.81%。按照多糖含量=总糖含量-还原糖含量，测定CPPS的含量为83.97%。
2.2 CPPS对RAW 264.7细胞增殖的作用图 1为经不同质量浓度的CPPS处理后RAW 264.7的细胞数量变化。试验结果显示，与空白对照组相比，CPPS质量浓度在31.25~250 μg·mL-1有刺激RAW 264.7细胞增殖的作用，且CPPS质量浓度为125 μg·mL-1时增殖作用极显著 (P < 0.01)；CPPS质量浓度高于500 μg·mL-1时则会抑制RAW 264.7细胞的增殖。因此，根据MTT的结果选择质量浓度为25~200 μg·mL-1的CPPS进行下一步分泌细胞因子的研究。
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与对照 (0 μg·mL-1) 相比，*. P < 0.05，**. P < 0.01，***.P < 0.001。下图同 Compared with control (0 μg·mL-1), *. P < 0.05, **. P < 0.01, ***. P < 0.001. The same as below 图 1 CPPS对RAW 264.7细胞增殖的影响 Figure 1 CPPS-induced the proliferation of RAW 264.7 cells |
ELISA测定结果显示，与对照组相比，LPS及100和150 μg·mL-1CPPS可极显著提高RAW 264.7细胞分泌TNF-α的量 (P < 0.01)，而100和150 μg·mL-1 CPPS可显著提高RAW 264.7细胞分泌IL-6的量 (P < 0.05)，其余各组与对照组差异不显著 (P>0.05)(图 2、图 3) 结果表明CPPS可刺激RAW264.7细胞分泌TNF-α和IL-6，但不具有浓度依赖性。
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图 2 CPPS对RAW 264.7细胞分泌TNF-α的影响 Figure 2 CPPS-induced TNF-α secretion of RAW 264.7 cells |
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图 3 CPPS对RAW 264.7细胞分泌IL-6的影响 Figure 3 CPPS-induced IL-6 secretion of RAW 264.7 cells |
TNF-α和IL-6基因相对水平的检测结果显示，与对照组相比，LPS组TNF-α和IL-6 mRNA转录量极显著升高 (P < 0.001)；CPPS各个质量浓度组均可促进TNF-α和IL-6 mRNA转录量升高，但以100和150 μg·mL-1浓度CPPS作用最为显著 (P < 0.001)(图 4、图 5)，这与ELISA检测TNF-α和IL-6分泌量的结果一致。
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图 4 CPPS对RAW 264.7细胞TNF-α mRNA转录的影响 Figure 4 Effect of CPPS on TNF-α mRNA transcription of RAW 264.7 cells |
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图 5 CPPS对RAW 264.7细胞IL-6 mRNA转录的影响 Figure 5 Effect of CPPS on IL-6 mRNA transcription of RAW 264.7 cells |
与对照组相比，200 μg·mL-1 LPS与100 μg·mL-1CPPS处理组细胞核中NF-кB p65表达量极显著升高，细胞质中IкB-α量极显著下降 (P < 0.01或P < 0.001)，而25 μg·mL-1 CPPS处理组与对照组差异不显著 (P>0.05)(图 6)。结果表明200 μg·mL-1 LPS和100 μg·mL-1CPPS可激活NF-кB信号通路。
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CPPS 1、CPPS 2分别为25、100 μg·mL-1 CPPS 1, CPPS 2 stand for 25, 100 μg·mL-1, respectively 图 6 CPPS对RAW 264.7细胞NF-кB p65和IкB-α蛋白表达的影响 Figure 6 Effect of CPPS on RAW 264.7 expression of NF-кB p65 and IкB-α protein |
TNF-α、IL-6与NF-кB p65的相关系数分别为0.939和0.852(表 2)。TNF-α、IL-6的分泌量与细胞核内NF-кB p65表达量呈显著正相关 (r>0.8，P < 0.05)。
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表 2 TNF-α、IL-6与NF-кB p65相关性分析 Table 2 TNF-α, IL-6 and NF-кB p65 correlation analysis |
机体巨噬细胞参与免疫应答的所有阶段，是宿主防御系统的重要成员，通过吞噬作用来消灭进入机体的微生物，然后对抗原进行加工和递呈，发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用[12-13]。MTT试验结果显示，CPPS质量浓度在31.25~250 μg·mL-1可以促使RAW 264.7细胞增殖，RAW 264.7细胞数量的增多表明机体防御病原体的能力增强，提示CPPS可通过增加巨噬细胞数量来发挥免疫增强作用；CPPS质量浓度高于500 μg·mL-1会抑制细胞的增殖，表明CPPS作用于巨噬细胞是在一定浓度范围内发挥作用，根据MTT的结果选择CPPS质量浓度25~200 μg·mL-1进行下一步分泌细胞因子的研究。
巨噬细胞被激活后会产生许多细胞因子，例如肿瘤坏死因子 (TNF)、干扰素 (IFN)、白细胞介素 (IL)、一氧化氮 (NO) 和其他氧化反应的产物[9, 14-15]。其中，TNF-α参与机体天然免疫和获得性免疫，是特异性免疫应答和炎症反应的中间纽带，起着激活白细胞的趋化和诱导黏附分子表达的作用，可抑制恶性细胞的生长，激活其他免疫细胞[16]，在宿主防御机制中发挥重要作用。IL-6可促进B细胞增殖、分化并产生抗体[17]，诱导肝细胞生成急性时相反应蛋白，促进巨核细胞成熟和细胞毒性T细胞分化，并抑制髓系白血病细胞株和某些癌细胞株的生长[18]。多糖可以活化巨噬细胞从而促使其分泌细胞因子，50~400 μg·mL-1沙参多糖可促使巨噬细胞TNF-α和IL-6的分泌量增加[19]，30~300 μg·mL-1的黄芪多糖作用于巨噬细胞，可使其分泌TNF-α和IL-6的量显著增加[20]。本试验结果显示，各剂量组的CPPS均可增加TNF-α和IL-6的分泌量，质量浓度在100~150 μg·mL-1刺激效果最佳。RT-PCR结果显示，各剂量的CPPS均能提高TNF-α和IL-6 mRNA的转录水平，质量浓度在100~150 μg·mL-1效果极显著，且TNF-α和IL-6的分泌量的检测结果与TNF-α和IL-6 mRNA转录量的检测结果一致。表明CPPS可以通过上调RAW 264.7细胞TNF-α和IL-6 mRNA的转录量使得TNF-α和IL-6分泌量增加，从而增强机体免疫功能。
TNF-α和IL-6分泌是通过不同信号通路的激活来实现的，T. Yan等[21]从延龄草中提取出一种甾体皂苷，这种甾体皂苷可通过激活RAW 264.7细胞PI3K/Akt，MARK和Nrf2/HO-1通路来调节TNF-α和IL-6的分泌。R. Q. Chen等[22]用Penicillium marneffei感染人巨噬细胞，发现Penicillium marneffei只有激活ERK1/2通路才能诱导TNF-α的产生。J. W. Li等[19]证明黄芪多糖作用于RAW 264.7细胞后，可以通过激活TLR-4介导的MARK和NF-кB信号通路来调节TNF-α和IL-6的分泌。
核转录因子-кB (NF-кB) 是一种可以调控基因转录的核因子，对巨噬细胞内部的多种基因都有调控作用，多糖主要通过NF-кB信号通路诱导巨噬细胞发生免疫应答[23]。细胞表面有可识别多糖的受体包括TLR4和Dectin-1[24]等，多糖与这些巨噬细胞表面的受体结合后活化下游相关信号分子，从而激活NF-кB诱导酶 (NIK)，NIK再激活NF-кB抑制蛋白IкB激酶 (IKK)，使IкB降解并释放出NF-кB，NF-кB进入到细胞核内启动靶基因的转录[25-26]。为了研究TNF-α和IL-6分泌量的增多是否与NF-кB通路的激活有关，根据TNF-α和IL-6分泌量及其mRNA转录量的结果选择25和100 μg·mL-1两个不同质量浓度的CPPS作用于RAW 264.7，对NF-кB通路中的相关蛋白质进行提取和表达量的分析。试验结果显示，RAW 264.7细胞经质量浓度为25和100 μg·mL-1的CPPS刺激后细胞质内IкB-α表达量降低，细胞核内NF-кB p65表达量升高，且100 μg·mL-1的CPPS刺激效果更为显著。根据表 2相关性分析得到，TNF-α和IL-6的分泌量与细胞核内NF-кB p65表达量呈显著正相关，表明CPPS可能通过激活NF-кB通路，上调TNF-α和IL-6 mRNA的转录量来调节TNF-α和IL-6的分泌量。但是CPPS与RAW 264.7细胞上的哪些受体结合从而激活NF-кB通路以及CPPS作用于RAW 264.7后是否只激活NF-кB信号通路尚不清楚，还有待进一步研究。
综上所述，CPPS作用于RAW 264.7细胞使得TNF-α和IL-6分泌量增多有两个原因。一是CPPS对RAW 264.7细胞有促进增殖的作用，通过增加RAW 264.7细胞的数量使得TNF-α和IL-6的分泌量增加；二是CPPS可能通过激活NF-кB通路，促使TNF-α和IL-6 mRNA的转录水平升高，最终使得TNF-α和IL-6分泌量增多，进而调节机体免疫。
4 结论CPPS对RAW 264.7细胞有明显增殖作用；显著增加RAW 264.7细胞TNF-α和IL-6的分泌量及其mRNA的转录量，并可使RAW 264.7细胞细胞核内NF-кB p65升高，细胞质内IкB-α降解。结果表明，CPPS不仅可以通过刺激RAW 264.7细胞增殖，还可能通过激活NF-кB信号通路使TNF-α和IL-6的分泌量增多，进而参与机体的免疫调节。
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