2. 安徽省农业科学院畜牧兽医研究所, 合肥 230031
2. Institute of Animal Husbandry and Veterinary, Agricultural Academy of Anhui Province, Hefei 230031, China
我国长江流域夏季高温天气每年持续2~3个月，热应激给集约化养殖业造成巨大的损失，研究发现γ-氨基丁酸 (γ-aminobutyric acid，GABA) 能够有效缓解畜禽热应激，但其作用机制尚不明了，为此，本试验探究高温对淮南麻黄鸡血脑屏障的影响，为深入研究γ-氨基丁酸防治鸡热应激的机制奠定基础。γ-氨基丁酸 (γ-aminobutyric acid，GABA) 作为卫生部批准的新资源食品[1]，具有抗焦虑、抗惊厥、调节内分泌等作用[2]，能够提高动物采食量及体增重，改善胴体品质和繁殖性能[3]，近年来研究发现，GABA还能缓解热应激对畜禽生长、免疫、产蛋、泌乳及肌肉品质的不良影响，提高热应激下畜禽的生产性能和免疫力，其机制方面的研究主要涉及免疫、抗氧化、内分泌和肠道消化功能[4-6]。部分学者认为，下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴 (hypothalamic-pituitary-adrenocortical axis, HPA) 过度分泌是夏季热应激损害动物机体的主要机制[7-8]。下丘脑室旁核中的促肾上腺皮质激素释放激素 (corticotropin-releasing hormone, CRH) 神经元是HPA轴的最高级中枢。脑组织内产生的内源性神经递质GABA能够作用于CRH神经元调控HPA轴激素分泌[9-10]，但尚未见脑组织外的外源性GABA具有调控HPA轴激素分泌功能的报道。徐秋良等、胡家澄等于饲料中添加GABA抑制了热应激猪HPA轴激素的分泌[11-12]，本课题组研究也发现饲料中添加包被GABA抑制了热应激奶牛HPA轴激素的分泌[13]，但饲料中添加的GABA并非脑内产生的神经递质，成年动物血脑屏障完整，血液中的GABA无法穿过血脑屏障进入脑组织内[14-15]，那么饲料中添加的GABA如何调控HPA轴激素分泌？张礼[16]在热应激肉鸭饲料中添加GABA后，全血和心、肝、肾中GABA的含量均无显著变化，只有脑组织中GABA的含量显著提高。本课题组在添加GABA防治淮南麻黄鸡夏季热应激的试验中也发现，饲料中添加GABA使鸡脑组织内的GABA水平显著升高，且GABA水平随着GABA添加剂量的增加而递增。根据这两个试验的结果推断饲喂的GABA进入了肉鸭和鸡的脑组织。据报道，热应激能够破坏鼠的血脑屏障，增加血脑屏障的通透性[17-19]，但未见热应激对其他动物血脑屏障影响的报道。由此设想，是否高温破坏了畜禽的血脑屏障，饲喂的GABA吸收进入血液后穿过受损的血脑屏障进入脑组织内，从而发挥调控HPA轴的作用？雏鸡血脑屏障尚未形成，四周龄后才发育完全[20]。因此，利用成年鸡构建热应激模型，旨在探讨高温是否破坏成年鸡的血脑屏障，并通过静脉注射GABA验证血脑屏障的完整性。
1 材料与方法 1.1 试验时间与地点2015年11月1日至2015年11月21日，安徽农业大学动物科技学院动物房。
1.2 试验设计与管理 1.2.1 动物与分组100日龄淮南麻黄鸡120羽，购于安徽皖西麻黄鸡禽业原种有限公司，按常规饲养7 d后随机均分4组：常温对照组 (Ⅰ组)，常温注射组 (Ⅱ组)，高温对照组 (Ⅲ组)，高温注射组 (Ⅳ组)。Ⅰ、Ⅱ组鸡置于21~23 ℃下常规饲养，Ⅲ、Ⅳ组鸡每天12:00—15:00，34~37 ℃的高温处理3 h，持续2周。试验第7、14天，每组随机抽取5羽鸡，Ⅱ组和Ⅳ组鸡静脉注射GABA (每千克体重8.87 mg)，Ⅰ、Ⅲ组鸡注射同等剂量生理盐水。注射0.5 h后迅速断头，冰浴上取脑。试验第7天采集四组鸡大脑组织保存于-80 ℃冰箱待测脑组织中GABA含量；第14天，在Ⅰ、Ⅲ组鸡大脑皮层同一部位处剪切数个大约1 mm3组织块放入4 ℃ 2.5%戊二醛溶液中固定 (用于透射电镜观察血脑屏障结构)，其余大脑组织保存于-80 ℃冰箱待测GABA含量及紧密连接蛋白ZO-1、Occludin的mRNA和蛋白质表达，Ⅱ、Ⅳ组鸡取大脑组织保存于-80 ℃冰箱待测GABA含量。
1.2.2 药物与试剂GABA (YY10158) 购自上海源叶生物科技有限公司；鸡γ-氨基丁酸 (GABA) 酶联免疫分析试剂盒 (FK0487-02) 购自江苏雨桐生物科技有限公司；Star Spin Animal RNA Mini Kit (P111-1)、StarScript II First-strand CDNA Synthesis Mix (A214)、2×Realstar Power SYBR Mixture (A313) 试剂盒均购于北京康润诚业生物科技有限公司；ZO-1抗体 (ab59720) 购自美国Abcam公司；β-actin抗体 (RM200130) 购自北京锐抗生物科技有限公司；Occludin抗体 (bs-10011R) 购自北京博奥森生物技术有限公司；彩虹Marker (PR1920) 购自北京索莱宝科技有限公司；BeyoECL Star (P0018A) 购自上海碧云天生物技术有限公司；鼠源二抗 (BL001A)、兔源二抗 (BL003A)、RIPA裂解液 (BL504A)、SDS-PAGE蛋白质上样缓冲液 (BL502A)、BCA蛋白质浓度测定试剂盒 (BL521A) 均购于Biosharp生物科技公司。
1.2.3 仪器超薄切片机 (LKB-NOVA)，瑞典LKB公司生产；透射电镜 (JEM-1230)，日本株式会社产品；电子天平 (AE224)，上海舜宇恒平科学仪器有限公司产品；可调高速匀浆器 (FSH-2)，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司产品；冷冻高速离心机 (TGL-18R) 珠海黑马医学仪器有限公司产品；酶标仪 (Multiskan MK3)、实时PCR扩增仪、NanoVue plus，赛默飞世尔科技公司产品；-80 ℃冰箱 (DW-86L388A)，青岛海尔特种电器有限公司；DYY-6C电泳仪，北京市六一仪器厂产品；HY-4脱色摇床，江苏金坛市正基仪器厂产品；BIO-RAD凝胶成像系统，美国伯乐BIO-RAD公司产品。
1.3 测定指标 1.3.1 鸡脑组织中的GABA从-80 ℃冰箱中取出大脑组织，在冰冷的生理盐水中漂洗后除去组织表面的血液，用滤纸吸干。然后称取0.5 g，按重量体积比加入9倍的PBS缓冲液，使用高速匀浆机制成10%的组织匀浆液，在冷冻高速离心机上按照12 000 r·min-1离心15 min，取上清液，用ELISA法检测第7、14天脑组织中GABA的含量。
1.3.2 鸡血脑屏障超微结构将2.5%戊二醛溶液固定过的脑组织再用1%锇酸后固定，梯度乙醇脱水，环氧树脂包埋，制作超薄切片 (厚70 nm)，经醋酸铀、枸橼酸铅双重染色后置于透射电镜下观察并摄片。
1.3.3 鸡脑组织中紧密连接蛋白ZO-1和Occludin mRNA的转录根据GenBank提供的序列，设计目的基因ZO-1和Occludin及内参基因18S引物，由安徽通用生物公司合成。基因序列见表 1。
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表 1 引物序列 Table 1 Primer sequences |
应用Star Spin Animal RNA Mini Kit试剂盒提取鸡脑组织总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。按照StarScript II First-strand cDNA Synthesis Mix试剂盒操作说明将RNA反转录成cDNA。应用2×Realstar Power SYBR Mixture试剂盒在实时PCR扩增仪上进行qRT-PCR反应。以18S作为内参，2-△△Ct法对ZO-1和Occludin基因转录进行相对定量分析。
1.3.4 鸡脑组织中紧密连接蛋白ZO-1和Occludin蛋白的表达称取1 g鸡大脑组织加入9倍体积的RIPA蛋白质裂解液，充分研磨后以12 000 r·min-1的转速离心10 min，取组织上清液，BCA法测定蛋白质浓度，按照上样体积的1/4加入5×Buffer，将制备好的样品保存于-80 ℃冰箱中。配制浓缩胶和分离胶，加样跑胶后用SDS-PAGE电泳缓冲液将条带转移至PVDF膜上，室温条件下，使用5% BSA封闭液摇床4 h，孵育一抗在4 ℃条件下过夜，TBST清洗5次，每次3 min。室温下孵育二抗45 min，同样步骤清洗，将洗净的膜放于新TBST液中，用化学发光方法检测蛋白质条带的表达量。
1.4 统计分析试验数据采用SPSS 17.0统计软件进行t检验分析，结果以“x±s”表示。
2 结果 2.1 鸡脑组织中GABA含量由表 2可见，试验第7、14天，Ⅰ组与Ⅱ组间鸡脑组织中GABA含量均无显著差异 (P>0.05)，此结果表明，常温下鸡的血脑屏障结构完整，静脉注射GABA不能穿过血脑屏障进入脑内；Ⅳ组鸡脑组织中GABA含量高于Ⅲ组，且在第7天两组间差异极显著 (P < 0.01)，此结果表明，高温破坏了鸡的血脑屏障，使得正常时不能穿过血脑屏障的GABA进入脑组织内。
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表 2 鸡脑组织中GABA含量的比较 (x±s) Table 2 Comparison of GABA contents in chick brain tissues (x±s) |
透射电镜下观察，常温对照组鸡的脑毛细血管内皮细胞线粒体嵴结构完整 (图 1-1 A)，细胞间紧密连接结构正常 (图 1-1 B)，内皮细胞外基膜完整 (图 1-1 C)，基膜外的神经胶质细胞细胞质内细胞器基本存在 (图 1-3 D)；而高温对照组鸡的脑毛细血管内皮细胞线粒体发生空泡变性 (图 1-2 A)，内皮细胞间的紧密连接间隙增宽 (图 1-2 B)，内皮细胞外的基膜结构破坏，变得疏松 (图 1-2 C)，神经胶质细胞细胞质水肿，大部分细胞器结构减少及消失，细胞质空化 (图 1-4 D)，血管内皮细胞与血管基膜间隙增大 (图 1-4 E)，血管周围出现水肿 (图 1-4 F)。血脑屏障由血管内皮细胞 (内皮间有紧密连接)、内皮外的基膜及神经胶质细胞膜构成，由电镜观察可知，高温对这三层结构都有不同程度的破坏。血管周围水肿可能是由于血脑屏障破坏，血管内的液体渗漏出血管所致。
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图 1-1为常温对照组 (20 000×)，图 1-2为高温对照组 (20 000×)，图 1-3为常温对照组 (10 000×)，图 1-4为高温对照组 (10 000×)；图中箭头A指线粒体，箭头B指细胞紧密连接，箭头C指基膜，箭头D指神经胶质细胞，箭头E指血管内皮细胞，箭头F指血管周围 Fig. 1-1 is the normal temperature control group (20 000 ×), Fig. 1-2 is the high temperature control group (20 000 ×), Fig. 1-3 is the normal temperature control group (10 000 ×), Fig. 1-4 is the high temperature control group (10 000 ×); The arrow A in the figure refers to mitochondria, arrow B refers to cells in close connection, arrow C refers to the base membrane, arrow D refers to glial cells, arrow E refers to vascular endothelial cells, arrow F refers to perivascular 图 1 大脑皮层血脑屏障的电镜观察 Figure 1 Observation of cerebral cortex blood-brain barrier by electron microscopy |
由表 3可见，与常温对照组相比，高温对照组鸡脑组织ZO-1 mRNA的相对转录量极显著降低 (P < 0.01)，Occludin mRNA的相对转录量显著降低 (P < 0.05)。
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表 3 高温对ZO-1和Occludin基因转录的影响 (x±s) Table 3 Effects of high temperature on ZO-1 and Occludin gene transcription (x±s) |
由图 2可见，与常温对照组相比，高温对照组鸡脑组织ZO-1和Occludin蛋白相对表达量极显著降低 (P < 0.01)，这个结果基本与ZO-1和Occludin的mRNA转录吻合，说明高温破坏了鸡血管内皮间的紧密连接蛋白。
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图 2 高温对ZO-1和Occludin蛋白表达的影响 Figure 2 Effects of high temperature on the expression of ZO-1 and Occludin proteins |
血脑屏障 (blood-brain barrier) 由毛细血管内皮细胞及细胞间紧密连接、内皮外的基膜和神经胶质膜三部分组成[21]，是血液与脑组织之间的一种保护性结构，它能阻止血液中的某些大分子物质进入脑组织内。内皮细胞及其紧密连接是血脑屏障结构和功能的主要基础。鸡四周龄后血脑屏障才发育完全[20]，因此本试验采用的是血脑屏障已发育完全的成年鸡。电镜下观察，常温对照组鸡的血脑屏障结构正常，而高温对照组鸡的血脑屏障结构受到破坏，血管内皮细胞线粒体嵴有的断裂、有的空泡变性，血管内皮细胞间紧密连接间隙增宽，内皮细胞外基膜增厚、结构疏松。这就可能使正常情况下无法通过的药物进入脑组织内。据报道，热应激能够破坏鼠的血脑屏障，增加血脑屏障的通透性[17-19, 22]，出现脑水肿[23]。H. S. Sharma等研究发现脑水肿的形成与热应激所致血脑屏障通透性增加密切相关[24]。本试验中，高温对照组鸡大脑皮层部分小血管周围出现水肿，可能是热应激导致血脑屏障结构破坏、通透性增加所致，但未发现脑组织大范围水肿。
GABA正常时不能自由穿过血脑屏障[14, 25]。H. K. Knych等给马静脉注射和口服GABA，也证明外源性GABA无法进入到脑中[26]。给鼠腹腔注射、家兔和猫静脉注射GABA时，不能引起脑电生理活动，脑内GABA活性也不随着血液中GABA活性升高而上升，而当血脑屏障受到破坏时，注射GABA可引起脑电生理活动[27]。这些学者的研究表明正常情况下口服和注射外源性GABA均不能通过血脑屏障，而当血脑屏障受到破坏时，GABA则可以进入脑内并发挥作用。韩雁冰等采用静脉注射不能透过血脑屏障的GABA联合QPEEG监测的方法，了解疾病情况下血脑屏障的功能[28]。因此，本试验也采用静脉注射GABA探讨高温对鸡血脑屏障完整性和通透性的影响。试验结果显示，1、2组间鸡脑组织内的GABA含量无显著差异，这个结果表明常温饲养环境下，静脉注射GABA并不能使脑组织内GABA含量升高，说明常温环境下鸡血脑屏障的完整性良好，能够阻挡静脉注射的GABA通过血液循环进入脑内；而高温饲养环境下，静脉注射GABA显著升高了脑组织内GABA含量，说明高温下鸡血脑屏障的完整性受到破坏、通透性增大，使得GABA进入脑内，电镜下观察到高温对照组鸡血脑屏障结构受损也与此相符。这些结果验证了作者先前的推断：高温破坏了淮南麻黄鸡的血脑屏障。饲喂的外源性GABA吸收进入血液后有可能穿过受损的血脑屏障，进入脑组织内发挥对HPA轴的调控作用。
位于脑血管内皮细胞中的GABA转氨酶可使GABA降解转化, 构成酶屏障阻止GABA入脑[2]。本试验结果显示GABA穿过了血脑屏障，但是进入脑内的GABA如果被GABA转氨酶破坏，就不能发挥其调控HPA轴的作用，因此，下一步将深入研究：GABA进入血脑屏障后脑组织内GABA转氨酶活性的变化及脑内GABA受体的表达情况，以进一步明了进入脑组织内的GABA代谢情况及作用机制。
3.2 高温对紧密连接蛋白ZO-1和Occludin基因表达的影响紧密连接是相邻细胞膜间互相融合，形成的密切接触，主要起屏障和黏连作用，它与脑毛细血管内皮细胞膜共同组成血脑间交换的第一道屏障，有效阻止物质通过[29]。ZO-1和Occludin是构成细胞间紧密连接复合体的重要结构蛋白[30]。Occludin作为跨膜蛋白，在相邻细胞的细胞膜上伸出环状结构紧密相连“封闭”细胞间隙，位于细胞质内Occludin的氨基和羧基末端与ZO-1紧密相连，从而使紧密连接在细胞膜上得以固定[31]。据报道，遭受热应激动物的紧密连接蛋白Occludin、ZO-1表达水平降低，血脑屏障完整性受到破坏[23]。陈祎招等研究发现高温能破坏血脑屏障内皮细胞间的紧密连接，ZO-1表达水平降低可能是其重要的分子机制之一[32]。J. Y. Zhao等和R. F. Xu等的试验证明，降低Occludin的合成能够破坏血脑屏障的完整性[33-34]。本试验结果显示，高温使鸡脑组织ZO-1 mRNA和Occludin mRNA的相对转录量显著降低，蛋白质相对表达量也极显著降低，这可能是高温破坏鸡血脑屏障的部分机制。
4 结论高温破坏了淮南麻黄鸡的血脑屏障，脑组织中ZO-1和Occludin表达下降可能是其原因之一。
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