玉米赤霉烯酮 (Zearalenone，ZEN) 又称F-2毒素，是一种酚的二羟基苯酸的内酯结构，与雌二醇结构相似，主要是禾谷镰刀菌产生的具有类雌激素作用的真菌毒素[1]，0.03 nmol·L-1的ZEN即可促进雌激素依赖性MCF-7细胞的增殖[2]。ZEN能对人和动物造成极大的危害，使机体连续动情并导致假孕、不育、卵巢畸形和流产等一系列的生殖障碍，此外，一些研究证实玉米赤霉烯酮还具有遗传毒性[3]、细胞毒性[4]、免疫毒性[5]和致癌性[6]。饲料原料受ZEN的污染较普遍，长期中毒造成动物抵抗力降低，生产水平下降，增加对多种病原的易感性，给养殖业造成严重损失，同时对动物性食品安全产生危害。戎晓平等[7]通过对2014年9月—2015年5月北京、山东、河南、四川等地区的部分饲料公司和养殖场调查发现，大猪料ZEN污染较为严重，阳性平均值为510.42 μg·kg-1，为中度污染，玉米和DDGS中ZEN含量最高，阳性平均值分别为477.14和417.67 μg·kg-1，超标率分别为23.21%和13.33%。此外，饲料经加工后存放条件不当，也极易导致ZEN含量超标。
目前，去除ZEN的方法主要有物理、化学和微生物三大类。物理脱毒方法有热处理法、辐照法、吸附等。化学方法包括氨化法、碱法、臭氧处理、双氧水处理等。然而，传统的物理化学脱毒方法不仅不能彻底去除ZEN的毒性，一定程度上还能造成谷物营养成分的流失，并产生潜在不确定的危害因素，不能被广泛应用。微生物降解法通过破坏毒素分子结构中的毒性基团而将毒素降解为无毒物质，具有高效性、高特异性、无毒副作用等优点。粉红粘帚菌 (Clonostachys rosea IFO 7063) 能将ZEN分解成无雌激素作用的物质[2]；枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis ANSB01G) 可有效减轻后备母猪雌激素中毒症状，并使机体处于正常和健康的状态[8]；H. Tan等[9]从土壤中分离的假单胞菌 (Pseudomonas) TH-C1和TH-L1对ZEN (2 μg·mL-1) 的降解率分别为 (68±0.85)%和 (57±0.73)%；此外，蜡样芽孢杆菌[10]、黏滞塞氏杆菌[11]、红球菌属[12]等具有降解ZEN的能力。
大多数具有益生功能的微生物饲喂动物后，具有调整肠道健康缓解真菌毒素的致病作用，但其不能针对毒素进行降解。本研究从微生物含量丰富的草食动物粪便中，以玉米赤霉烯酮为唯一碳源进行高通量筛选，以期筛选出能够有效降解ZEN的菌株，为玉米赤霉烯酮污染问题提供一种解决方案。
1 材料与方法 1.1 主要仪器和试剂酶标仪，细胞破碎仪，低温离心机，无酚红高糖DMEM培养基 (gibco)，营养肉汤，营养琼脂，胎牛血清 (四季青)，ZEN标准品 (Pribolab)，ZEN ELISA检测试剂盒 (Pribolab)，甲醇，硫酸铵，蛋白酶K，SDS。
样品来源：动物园部分草食动物粪便和某肉种兔场种兔粪便。
初筛培养基 (g·L-1):1.52 g KH2PO4，2.44 g Na2HPO4，0.5 g (NH4)2SO4，0.2 g MgSO4·7H2O，0.05 g CaCl2，pH 7.0，121 ℃，灭菌20 min。
1.2 降解ZEN菌株的初筛分别称取5 g粪便，加入灭菌的250 mL锥形瓶中，用100 mL无菌生理盐水溶解。于37 ℃，170 r·min-1的条件下振荡2 h。取上清500 μL加入4.5 mL以ZEN (终质量浓度为2 μg·mL-1) 为唯一碳源的初筛培养基中，在37 ℃、170 r·min-1条件下培养5 d后，取500 μL转接于4.5 mL含ZEN (2 μg·mL-1) 的初筛培养基中，在37 ℃、170 r·min-1条件下培养5 d，连续转接3次。最后在含有2 μg·mL-1 ZEN的营养琼脂平板上涂布，保留存活菌株。
1.3 降解ZEN菌株的复筛将分离菌株于营养琼脂平板上活化后，挑取单菌落于50 mL·250 mL-1的营养肉汤中培养8 h后，以6%的接种量接种于100 mL·250 mL-1营养肉汤中培养24 h。培养结束后，取900 μL发酵液与100 μL ZEN (终质量浓度为1 μg·mL-1) 于37 ℃、180 r·min-1培养72 h，以不接菌的营养肉汤加ZEN作为空白对照。按照ELISA试剂盒说明书，用酶联免疫检测仪检测ZEN的含量。ZEN降解率 (%)=(对照组含量-试验组含量)/对照组含量×100%。
1.4 菌株的鉴定根据《常见细菌系统鉴定手册》中的试验方法[13]，将筛选得到的ZEN降解菌株划线接种于LB琼脂培养基，37 ℃倒置培养24 h，观察菌落形态，并对菌体进行革兰氏染色。参照金晶等[14]的简便酚/氯仿法提取菌株基因组总DNA，以引物5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′扩增菌株16S rRNA片段。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，随后对其16S rRNA扩增产物进行测序。测序结果与NCBI中的GenBank数据库进行BLAST比对，以分析序列同源性。
1.5 菌株发酵液降解不同浓度的ZEN取900 μL发酵液与100 μL ZEN，使ZEN质量浓度分别为5、10、15和20 μg·mL-1，37 ℃、180 r·min-1培养72 h，以不接菌的营养肉汤加ZEN作为空白对照。
1.6 不同降解时间降解率的测定取900 μL发酵液与100 μL ZEN (终质量浓度1 μg·mL-1)，37 ℃、180 r·min-1培养12、24、36、48、60和72 h，以不接菌的营养肉汤加ZEN作为空白对照。
1.7 菌株各活性组分的制备及降解ZEN参考S. Guan等[15]的方法，分别制得上清液、菌悬液、菌体胞内液、上清液+蛋白酶K、上清液+蛋白酶K+SDS和热处理上清。分别取上述液体900 μL与100 μL ZEN (终质量浓度1 μg·mL-1)，37 ℃、180 r·min-1培养72 h，以营养肉汤加ZEN作为空白对照。
1.8 粗蛋白质液的制备及降解ZEN分别取发酵上清液50 mL，边搅拌边缓慢加入100%饱和硫酸铵溶液 (pH=7.4)，使硫酸铵饱和度分别为65%、70%、75%和80%，将其置于4 ℃冰箱中过夜后，4 ℃、1 000 r·min-1条件下离心15 min，收集沉淀物，沉淀物用1.5 mL PBS复溶后，将其置于无菌蒸馏水中透析24 h。取透析后的蛋白质液900 μL与100 μL ZEN (终质量浓度1 μg·mL-1)，37 ℃、180 r·min-1培养72 h，以PBS加ZEN作为空白对照。
1.9 活性蛋白质相对分子质量的确定对沉淀之后的蛋白质进行12%的SDS-PAGE电泳检测，待测样品与样品缓冲液等比例混合，100 ℃水浴5 min，冷却后5 000 r·min-1离心，上样。初始电压80 V，待样品进入分离胶后，将电压调高至100 V。当溴酚蓝指示剂迁移到接近凝胶底部时停止电泳。考马斯亮蓝R-250染色2 h，脱色15 h。
1.10 去雌激素胎牛血清制备 (CD-FBS)向FBS中加入葡聚糖40 000(25 mg·100 mL-1)，待其完全溶解后再加活性炭 (250 mg·100 mL-1)，55 ℃水浴45 min，3 000 g离心10 min，取上清液，以此方法连续处理2次，处理后的血清依次用0.45和0.22 μm滤器过滤除菌[16]，于-20 ℃保存备用。使用时加入胰岛素 (终质量浓度3 μg·mL-1)。
1.11 MTT比色法测定细胞增殖乳腺癌细胞系MCF-7细胞在无酚红高糖DMEM培养基 (含10% CD-FBS) 中培养5 d，以耗尽细胞内储存的雌激素，调整细胞浓度为5×104 ·mL-1，取100 μL单细胞悬液接种于96孔培养板中培养24 h后，弃去培养液，加入199 μL无酚红DMEM培养基 (含10% CD-FBS) 和1 μL的待测样品，设置ZEN组 (20 μg·mL-1 ZEN与营养肉汤37 ℃、180 r·min-1条件下共同培养72 h后，用无水乙醇稀释2倍) 和ZEN降解组 (20 μg·mL-1 ZEN与菌株发酵液37 ℃、180 r·min-1条件下共同培养72 h后，用无水乙醇稀释2倍) 以及空白对照组，每个处理组6个重复孔，于36和72 h时，每孔加入25 μL的MTT (5 mg·mL-1)，继续孵育4 h后，弃去培养液，每孔加入100 μL二甲基亚砜，用酶标仪检测570 nm吸光度值 (A)，细胞增殖率 (%)=[(A570 test/A570 blank)-1]×100。
1.12 数据处理采用SPSS 20.0统计软件进行分析。
2 结果 2.1 菌株的筛选以ZEN为选择压力，从种兔、羊、牛和长颈鹿粪便混合物中筛选到能够生长的菌株分别为10、10、12和8株，共40株。复筛得到5株对ZEN具有降解能力的菌株，其中从种兔粪便中分离的H6菌株对ZEN的降解率最高，可达95.6%，见表 1。因此选择H6菌株进行进一步的研究。
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表 1 分离自不同样品的降解ZEN的菌株 Table 1 Strains of ZEN-degrading isolate from various samples |
H6菌株菌落呈圆形，浊白色，隆起，边缘锯齿状，革兰阳性，镜检菌体为短杆状，有芽孢。经PCR扩增得到16S rRNA基因序列，全长约1 500 bp (图 1)。测序后，在NCBI使用Blast比对，从GenBank数据库中获得相关序列进行系统发育分析，由图 2可知，H6与解淀粉芽孢杆菌 (Accession No.KT961125)16S rRNA相似性达到99%，结合遗传距离和培养特征，可以鉴定H6为解淀粉芽孢杆菌。
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图 1 H6菌株16S rRNA PCR产物电泳 Figure 1 Electrophoresis of the 16S rRNA PCR product of the H6 strain |
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图 2 H6菌株16S rRNA序列的同源性系统进化树 Figure 2 Phylogentic tree of 16S rRNA sequence of H6 strain |
解淀粉芽孢杆菌H6的发酵液对不同质量浓度ZEN (5、10、15和20 μg·mL-1) 的降解率分别为91.38%、93.64%、88.6%和85.8%(图 3)。
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图 3 H6菌株发酵液对不同质量浓度ZEN的降解率 Figure 3 Degradation rate of H6 strain broth on various concentrations of ZEN |
菌株发酵液与1 μg·mL-1的ZEN于37 ℃、180 r·min-1共孵育，分别在12、24、36、48、60和72 h测其降解率。如图所示 (图 4)，随着时间的增加，降解率一直在增加，在12 h时的降解率可达86.69%，在24、36、48和60 h时，降解率分别为89.34%、91.4%、93.55%和94.26%，在72 h，降解率达到最高，为95.6%。
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图 4 不同反应时间的ZEN降解率 Figure 4 The ZEN degradation rate of different reaction time |
菌株H6发酵后的发酵液制备上清液、菌悬液及胞内液，然后分别与ZEN (1 μg·mL-1) 在37 ℃、180 r·min-1条件下共培养72 h，并对其ZEN的降解率进行检测。结果如图 5所示：上清液降解率为68.93%，菌悬液的降解率为28.70%，细胞内液降解率为6.13%。
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图 5 菌株发酵液的不同组分对ZEN的降解率 Figure 5 The ZEN degradation rate of different components of H6 strain broth |
H6菌株发酵后的上清液经过蛋白酶K、蛋白酶K+SDS、热处理后，分别与ZEN (1 μg·mL-1) 在37 ℃、180 r·min-1条件下共培养72 h，测得其降解率分别为8.31%、3.52%和9.13%。结果表明，发酵液上清液经上述处理后，对ZEN的降解能力明显降低 (图 6)。
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图 6 H6发酵上清液经蛋白酶K、蛋白酶K+SDS、热处理后对ZEN的降解率 Figure 6 Degradation rate of H6 culture supernatant treated with Prok K, Prok K plus SDS and heat |
用65%、70%、75%、80%等不同浓度的硫酸铵沉淀菌株H6上清液，SDS-PAGE电泳图 (图 7) 表明，这四种浓度硫酸铵沉淀的效果差别不大。本研究选用80%硫酸铵沉淀的胞外蛋白酶做后续降解试验，结果表明，ZEN (1 μg·mL-1) 经胞外酶降解后，含量减少到381.17 ng·mL-1，而PBS对照组ZEN含量为945.37 ng·mL-1，胞外酶对ZEN的降解率为59.68%(图 8)。
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M. Marker (12-120 ku); A1. 65%硫酸铵; A2. 70%硫酸铵; A3. 75%硫酸铵; A4. 80%硫酸铵 M. Marker (12-120 ku); A1. 65% ammonium sulfate; A2. 70% ammonium sulfate; A3. 75% ammonium sulfate; A4. 80% ammonium sulfate 图 7 胞外酶SDS-PAGE Figure 7 SDS-PAGE of extracellular enzymes |
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图 8 80%硫酸铵沉淀的胞外酶对ZEN的降解率 Figure 8 The ZEN degradation rate of extracellular protein precipitated with 80% ammonium sulfate |
乳腺癌MCF-7细胞为雌激素依赖性，在无雌激素的环境中培养，其增殖活力受到抑制。MTT比色法测定ZEN降解产物的类雌激素作用，在36 h时，ZEN组细胞增殖率为49.2%，ZEN降解产物组对细胞的增殖率为19.59%；在72 h时，ZEN组与ZEN降解产物组细胞增殖率分别为95.64%和31.86%。在36和72 h时，与ZEN组相比，ZEN降解产物组细胞增殖率明显降低 (图 9)。
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图 9 ZEN降解产物对MCF-7细胞增殖的影响 Figure 9 Effects of ZEN degradation products on proliferation of MCF-7 cells |
ZEN是世界上污染范围最广泛的一种镰刀毒素，对动物健康和畜牧业生产造成巨大的危害，因此，有许多科技工作者为解决这一问题不断探索。微生物是自然界物质的分解者，几乎能够分解自然界所有的物质，X. Sun等[17]筛选到一株可以去除玉米浆中60.1%的ZEN (29 μg·mL-1) 的黑曲霉 (Aspergillus niger strain FS10)；K. J. Cho等[18]研究发现，枯草芽孢杆菌 (B. Subtilis) 与ZEN共培养36 h时，能够清除95.8% LB培养基中的ZEN，在玉米粉培养基中，可降解98%的ZEN。利用解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens) 降解ZEN，已经有一些报道，王宏杰[19]从长期受小麦赤霉病原菌污染的土壤中分离到一株解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens) 可在96 h内完全降解5 μg·mL-1的ZEN；刘阳等[20]取10 μL解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens NS2) 菌悬液于1 mL新鲜培养基中 (ZEN终浓度5 μg·mL-1) 在72 h时内降解率为95.99%。本研究以玉米赤霉烯酮为唯一碳源，从草食动物粪便中筛选能够生长的微生物，最终从种兔粪便中筛选出降解率最高的菌株，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌H6(Bacillus amyloliquefaciens H6)，其发酵液对ZEN (1 μg·mL-1) 的降解率在12 h时达86.69%，在72 h时，降解率达最大为95.6%；72 h时对20 μg·mL-1的ZEN的降解率在85%以上，对5 μg·mL-1 ZEN降解率为91.38%，降解能力稍微低于解淀粉芽孢杆菌NS2，分析原因可能是本研究直接使用菌株发酵液，细菌老化，产酶能力下降，而刘阳等则是直接取菌悬液于新鲜的培养基中。之所以能够从家兔的粪便中筛选出降解率最高的菌株，我们分析认为可能与家兔的食粪性对菌株具有富集作用有关。
微生物产生的酶作为饲料添加剂在动物养殖中已广泛使用，通过微生物产生的酶对ZEN进行降解是可行的方案。O. Molnar等[21]从白蚁尾肠分离到的酵母菌株 (Trichosporon)，能高效降解饲料中的玉米赤霉烯酮；谭辉[22]从牛瘤胃中分离出一株假单胞菌 (Pseudomonas otitidis TH-N1) 与2 μg·mL-1 ZEN共培养72 h后，能去除59%的ZEN，并证明主要发挥降解作用的活性成分是一种胞内酶。本研究中，上清液对ZEN的降解率达68.93%，菌悬液的降解率为28.70%，80%硫酸铵沉淀的胞外活性物质降解率为59.68%。上清液经蛋白酶K、蛋白酶K+SDS、热处理后，降解能力明显降低，表明发挥降解作用的活性物质是一种胞外蛋白酶。
ZNE及同分异构体 (α-ZOL和β-ZOL) 具有雌激素活性[23-24]，ZEN能与胞内雌激素受体结合，促进雌激素依赖性MCF-7细胞的增殖[25]。Y. Yu等[26]分离到的一株不动杆菌 (Acinetobacter sp. SM04)，ZEN被其胞外提取物降解后，对MCF-7细胞的增殖作用显著降低；解毒毛孢酵母 (Trichosporon mycotoxinivorans) 降解ZEN后的产物中，没有ZEN及ZEN异构体 (α-ZOL、β-ZOL) 的存在[21]。本试验中，降解之后的ZEN在36和72 h时，MCF-7细胞的增殖率为19.59%和31.86%，而ZEN组在36和72 h时细胞增殖率为49.2%和95.64%，表明降解之后的ZEN雌激素活性降低，证明降解之后的ZEN转变成毒性更大的α-ZOL和β-ZOL的可能性极低。
4 结论本研究以ZEN为唯一碳源进行初筛，以菌株发酵液对ZEN的降解率为复筛指标，从草食动物粪便中分离到一株能有效降解ZEN的菌株，命名为H6，经16S rRNA测序和培养特征鉴定为解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens)。该菌株发酵液能在12 h内降解89.34%的1 μg·mL-1的ZEN，在72 h降解率达到94.6%。降解ZEN的活性物质主要存在于发酵上清液中，经鉴定是一种胞外酶；细胞增殖试验表明ZEN降解产物在MCF-7细胞上的雌激素活性显著降低。该研究为畜牧养殖中玉米赤霉烯酮的污染治理提供了一种有效的解决方案。
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