2. 中国科学院亚热带农业生态研究所, 亚热带农业生态过程重点实验室, 湖南省畜禽健康养殖工程技术中心, 农业部中南动物营养与饲料科学观测实验站, 长沙 410125;
3. 中国科学院大学, 北京 100049;
4. 湘潭大学, 湘潭 411105
2. Key Laboratory of Agro-ecological Processes in Subtropical Region, Hunan Provincial Engineering Research Center of Healthy Livestock, Scientific Observing and Experimental Station of Animal Nutrition and Feed Science in South-Central of Ministry of Agriculture, Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China;
3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
4. Xiangtan University, Xiangtan 411105, China
当动物机体受到细菌、病毒及饲料变质等因素的干扰时，机体为抵抗其对脏器的损伤将作出相应的一系列应答，随即产生免疫应激。免疫应激轻则导致畜禽采食量和动物产品沉积率降低，重则引发死亡，给畜禽养殖业造成巨大的经济损失。近些年研究表明，谷氨酰胺 (Gln) 在机体免疫系统和肠道正常功能的维持中发挥重要作用，已在人医临床和动物营养领域得到广泛的应用。同时，谷氨酰胺作为机体内数量最多的游离氨基酸[1]，是新陈代谢中多种活性分子合成的必要前体、各类核心代谢途径的中间体，也是肠道细胞主要的能量来源[2]。研究证实谷氨酰胺虽然能够由机体合成，但在严重应激或疾病的条件下易缺乏，继而影响和减弱动物机体免疫系统，因此Gln被定义为条件性必需氨基酸。也有相关研究指出免疫应激将导致断奶仔猪自身合成的谷氨酰胺不足以供给机体正常需求[3]。哺乳期仔猪从液态奶中摄取Gln，断奶后仅从难以消化的固体饲料中获得，故Gln水平将迅速下降，从而产生应激反应，表现为仔猪采食量下降、肠形态改变并发生腹泻[4]，仔猪免疫力会持续降低。这就揭示在实际生产中断奶仔猪饲料中应尽早补充Gln[5]，以减缓仔猪的断奶应激和抵抗外界其他有害刺激，从而促进其健康发育[6-7]，降低成本投入。因此，本试验以断奶仔猪腹腔注射大肠杆菌型脂多糖 (LPS) 建立免疫应激模型，研究谷氨酰胺干预断奶仔猪肠道黏膜受损中免疫能力的作用，为动物提高免疫力以抵抗外界刺激奠定一定的理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料谷氨酰胺购自武汉远成共创科技有限公司，其有效成分含量为99.5%。
选用型号为E. coli serotype055:B5的脂多糖 (美国Sigma Chemica公司)，用无菌生理盐水配制为100 μg·mL-1的浓度，然后将溶液超滤除菌，现配现用。
1.2 试验动物与设计选取28日龄，平均体重 (6.24±0.25) kg健康的三元杂交 (杜×长×大) 断奶仔猪24头，按公母各半、体重相近的原则随机分为3个组，每组8个重复，每个重复1头猪。其中对照组和应激对照组饲喂常规基础饲粮，试验组饲喂添加1%谷氨酰胺饲粮。试验期为30 d，在试验期第22、25、28、30天时，应激对照组和试验组分别以体重 (BW) 为计量单位，于仔猪腹腔注射脂多糖 (LPS，100 μg·kg-1), 对照组以相同的方式腹腔注射同体积生理盐水。
1.3 试验饲料基础日粮由长沙粒丰饲料科技有限公司提供，饲料配制时其组成成分与营养水平参考美国NRC (2012) 中5~10 kg体重断奶仔猪营养需要标准。日粮组成及营养水平见表 1，饲料中氨基酸含量实测值见表 2。
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表 1 基础饲粮成分及营养水平 (风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) |
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表 2 饲料中几种重要氨基酸实测值 (风干基础) Table 2 Measured value of several important amino acids in the diets (air-dry basis) |
试验在中国科学院亚热带农业生态研究所动物饲养室进行，为全封闭式猪舍，漏缝金属材质地面，不锈钢可调式料槽，乳头式饮水器。仔猪单笼饲养，并按照猪场标准饲养管理程序对试验猪进行驱虫与免疫处理。每天对仔猪喂食3次，粉料饲喂，时间为07:30、12:00和18:30，自由饮水和采食，以食槽无剩料为原则。每天清扫圈舍2次，保持清洁。整个圈舍采取自然通风，在养殖期内对所有圈舍进行不定期消毒。
1.5 样品采集及试验指标测定 1.5.1 血清和肠道样品采集试验仔猪在第22天 (注射LPS前) 和第30天 (注射LPS后) 进行前腔静脉采血。用肝素抗凝真空管采血10 mL，静置15 min，以1 000 g离心15 min分离制备血清，－80 ℃保存待用。
第30天LPS处理12 h后，将仔猪麻醉处死，打开腹腔，取出十二指肠、空肠、回肠，用冰冻PBS轻轻冲净肠壁内容物，并用滤纸吸干肠段表面的水分，而后用玻璃载玻片刮取肠黏膜，使用锡箔纸将样品进行包裹，立即放入液氮中速冻，然后转移至－80 ℃冰箱中保存待测。
1.5.2 血清中指标检测采用全自动生化仪检测血清中IgG、IgM含量。采用酶联免疫反应ELISA试剂盒 (武汉华美生物工程有限公司CUSABIO) 检测血清中白细胞介素8(IL-8)、白细胞介素12(IL-12)、白细胞介素17(IL-17) 的含量。
1.5.3 各肠段炎症因子相关基因的检测采取荧光定量PCR方法。
1.5.3.1 引物设计与合成根据GenBank收录猪的相关基因序列，以Primer premier 5.0软件设计白细胞介素18(IL-8)、白细胞介素12β(IL-12β) 和白细胞介素17α(IL-17α) 三种基因序列的引物，并选取β-actin作为内参基因。所有引物由上海生工生物工程公司合成。引物序列见表 3。
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表 3 各引物序列及参数 Table 3 Primers sequence used for realtime-PCR |
使用RNAios Plus (TaKaRa, 9109) 等试剂提取总RNA，并且使用超微量紫外分光光度计 (ND2000，美国NnaoDro) 测定总RNA的纯度和浓度。OD260 nm与OD280 nm比值在1.8~2.2之间的RNA纯度较好。将纯度较好的RNA，经1%的琼脂糖凝胶电泳后，以28S rRNA和18S rRNA的灰度值比2:1为依据，评判提取RNA的质量。使用TaKaRa反转录试剂盒 (RR047A) 对提取的RNA进行反转录合成cDNA。
1.5.3.3 实时荧光定量PCR采用10 μL荧光定量PCR反应体系，包括5.0 μL SYBR® Premix Ex TaqTM II，0.4 μL Forward Primer，0.4 μL Reverse Primer，3.2 μL RNase Free dH2O和1.0 μL cDNA。
反应程序：95 ℃变性5 s，60 ℃延伸30 s，共40个循环；溶解程序：95 ℃变性15 s，60 ℃延伸15 s，95 ℃变性15 s。
1.6 数据统计分析实时荧光定量数据采用2-△△Ct法计算基因的相对表达量。所有数据应用Excel软件进行归纳整理，采用SPSS 17.0软件对数据进行统计，采用邓肯式法进行单因素方差分析 (one-way ANOVE)，LSD法验证差异显著性，其中P < 0.05表示组间差异显著。所有数据均以“x±sx”形式列出。
2 结果 2.1 谷氨酰胺对免疫应激仔猪血清中IgG和IgM含量的影响由表 4可知，与对照组相比，LPS注射与否和Gln补充对断奶仔猪血清中IgG含量均无显著影响 (P>0.05)。但LPS处理后对于血清中IgM含量，与对照组比较，LPS组与Gln组中的含量均显著升高 (P < 0.05)，并分别提高40.00%和62.86%，且Gln组较LPS组IgM含量提高16.32%(P>0.05)，但是LPS处理前，三组间无显著差异 (P>0.05)。
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表 4 LPS与Gln对免疫应激仔猪IgG与IgM的影响 (x±sx) Table 4 Effects of glutamine on the concentration of serum IgG and IgM in the weaned piglets (x±sx) |
由表 5可知，LPS刺激后，与对照组相比，LPS组血清中IL-8含量显著提高7.11%(P < 0.05)，但Gln组含量无显著变化 (P>0.05)，且略低于对照组。未注射LPS前，Gln组较对照组仔猪血清中IL-12含量升高18.31%，但未达到显著水平 (P>0.05)。相比空白对照组，LPS刺激提高了仔猪血液中IL-12浓度，但差异不显著 (P>0.05)。LPS攻毒前后，三组间血清中IL-17的含量均有显著差异性 (P < 0.05)。在攻毒前，Gln组血清中IL-17含量较对照组显著提升83.54%(P < 0.05)；免疫应激处理后三组血清中IL-17含量均下降，但Gln组仍然显著高于其他两组 (P < 0.05)，且较其他两组分别提高46.40%与53.10%。
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表 5 谷氨酰胺对断奶仔猪血清中白细胞趋化因子的影响 (x±sx) Table 5 Glutamineon the content of serum chemotactic factors in the weaned piglets (x±sx) |
由表 6可知，在十二指肠内，LPS组和Gln组中IL-8 mRNA表达丰度较对照组均显著下降 (P < 0.05)，分别降低35.06%和44.16%。但在空肠与回肠内三组间IL-8基因的表达水平无显著差异 (P>0.05)，但是Gln组和对照组均比LPS的表达水平要低。对于IL-12β mRNA的表达丰度，在各个肠段中三组间均无显著性差异 (P>0.05)。在十二指肠和空肠中，三组间IL-17α的相对表达水平均呈现显著差异 (P < 0.05)，回肠中差异不显著，但是其与十二指肠具有相同的表达趋势，呈现Gln组>空白对照组>LPS组的特点。特别地，注射LPS后，极显著降低IL-17α在十二指肠的表达丰度 (P < 0.01)，但是Gln的添加则使其水平恢复至略高于正常组，两者未达到显著水平 (P>0.05)。仔猪空肠内，LPS组与Gln组中IL-17α基因的相对表达量较正常组显著降低 (P < 0.05) 了58.16%与56.07%。回肠中，Gln组的IL-17α的相对表达量最高。
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表 6 谷氨酰胺对断奶仔猪各肠段炎症因子相关基因相对表达水平的影响 (x±sx) Table 6 Effects of glutamine on the mRNA expression of intestinal inflammatory cytokine of the weaned piglets (x±sx) |
免疫球蛋白由B淋巴细胞系浆细胞分泌，主要存在于血液及其他体液 (淋巴液等) 中，在抗原刺激下与抗原特异性结合而发挥作用[8-9]。研究表明血清免疫球蛋白的浓度是反映机体免疫力的关键指标，其含量越高，说明机体的免疫状况越好[10]。生物进化过程中，IgM是最早出现的免疫球蛋白，胚胎发育晚期的胎儿便有能力产生，并且IgM普遍存在于血管内，是抗血管内感染的第一线抗体，也是机体初次免疫应答的主要抗体。在抗原刺激下，IgM通常最先产生，而抗体出现得愈早对机体保护也愈有效，因此IgM在早期免疫中占有重要地位[11-12]，有“免疫先锋”的美誉。本研究结果显示，断奶仔猪受到LPS刺激后，可能迅速引发免疫应激，启动体液免疫应答，表现为血清中IgM分泌量显著提高。特别地，同样经LPS刺激，相比空白对照组，Gln组仔猪机体可以迅速而高效地分泌更大量IgM抗击炎症，可促进仔猪更快恢复。这一结果的可能原因是机体内抗体的合成需要充足的氨基酸与能量供应，日粮中添加外源性谷氨酰胺可通过转氨基和脱氨基作用转变为其他多种氨基酸 (鸟氨酸、精氨酸、脯氨酸等)，也能为相关免疫细胞提供充足的能量，还能够为这些细胞合成DNA和mRNA提供嘌呤、嘧啶、核苷酸等前体物质[5]，从而促使淋巴细胞增殖。因此，谷氨酰胺提升了断奶仔猪机体对LPS的敏感性，从而增强了断奶仔猪的免疫能力。另外，本研究结果也表明无论是否注射LPS或添加谷氨酰胺，仔猪血清中IgG含量均无明显变化。IgG是血清中免疫球蛋白的主要成分，约占总量的75%，分布范围广，于体液免疫中发挥持续性作用[8]，是机体抵抗感染的主要作用物质。I. T. Yu等[13]研究发现，断奶仔猪日粮中补充谷氨酰胺能显著增加仔猪血液中IgA、IgG的含量；X. Zhong等[14]研究发现，添加谷氨酰胺能显著提高仔猪IgG的含量。本研究与以上结论不一致，造成这一结果的原因可能是由于不同的免疫应激模型所致，具体原因有待进一步的研究。
3.2 谷氨酰胺对仔猪血液白细胞介素的影响白细胞介素8(interieukin-8，IL-8) 也称趋化因子CXCL8，具有多种免疫学效应：可加快炎性细胞分化、特异性促使中性粒细胞进入炎症组织、促血管生成以及刺激有丝分裂和诱导细胞增殖等[15]，免疫学相关研究还推测IL-8可能是炎性与肿瘤疾病的有效干预靶点[16]。本研究结果显示，LPS攻毒后断奶仔猪机体受到损伤，LPS组IL-8的分泌量显著提升并进入炎症部位发挥效用。而Gln组仔猪血清中IL-8的含量与空白对照组相比无显著变化，处于非应激状态。造成这一结果可能有以下几个原因：①仔猪受到LPS应激后引起体内各项指标，尤其是相关免疫系统神经信号紊乱，谷氨酰胺可使部分神经信号传递保持正常，从而保证IL-8正常分泌，有利于减轻应激带来的损害。②谷氨酰胺的添加已经使断奶仔猪机体免疫力提升，LPS入侵仔猪时并没有造成强烈的炎症反应，故IL-8的分泌量低于LPS组，甚至与空白对照组中IL-8的水平保持一致。
白细胞介素12(interieukin-12，IL-12) 是效应最强的NK细胞激活因子与T淋巴细胞诱导因子[17]，对于个体早期的非特异性免疫与随后建立的特异性免疫均具有免疫活性。它的分泌主要用于清除胞内菌，作用范围广、时间长，在机体主动防御与免疫调节过程中发挥着重要作用[18]。笔者的试验结果显示，谷氨酰胺的添加对断奶仔猪血清中IL-12的含量无显著影响，但无论是否进行LPS处理，相比空白对照组，均一定程度上提高了血清中IL-12的水平，表明饲料中补充的谷氨酰胺已经在仔猪体内发挥了生物学效应，通过提高自身免疫力来应对外界各类刺激。
白细胞介素17(interieukin-17，IL-17) 在炎症反应中对白细胞的活化与迁移发挥重要作用，可调控粒细胞形成，对细胞外病原体的产生起阻断作用。研究发现它的分泌与疾病的发病早期密切相关，在个体天然免疫与宿主防御中有特别作用[19]。笔者的研究结果指出，饲喂添加谷氨酰胺的日粮后，无论是否进行LPS攻毒，血清中IL-17的含量均有显著提升，说明谷氨酰胺的添加可刺激相关淋巴细胞增殖分化，从而促使IL-17分泌量增加，进而提高仔猪对炎症的敏感性与抵抗力。另外有相关研究表明，IL-8与IL-17会表现拮抗作用[20]，而这点在试验结果中也得到充分的验证：无论是否进行LPS攻毒，二者在含量上均呈对立的特征。
3.3 谷氨酰胺对仔猪肠道炎症因子相关基因表达水平的影响肠道不仅是消化与吸收的主要场所，也是机体最大最重要的免疫组织。肠道可对细菌、病毒、饲料中毒素与抗原进行监控和清理[21]，J. M. Rhoads等证实，谷氨酰胺在小肠部位具有抗炎症效果[1, 22-23]，特别是对肠道组织中相关的炎症因子的基因表达有一定的影响。许多研究指出炎症因子基因相对表达量的高低通常可以反映机体内免疫系统的强弱[13]。本研究结果显示，比较断奶仔猪血清中白细胞介素的含量与其基因在肠道表达的相对水平，两者呈现出基本一致的状态，说明血清中炎症因子的分泌与肠道中炎症因子基因的相对表达量有很强的相关性。具体表现为：LPS刺激断奶仔猪后显著影响十二指肠中IL-8 mRNA和十二指肠及空肠中IL-17α mRNA的相对水平，但对各肠段中IL-12β的水平无显著影响。IL-8是一种趋化因子，进行LPS攻毒后，LPS组仔猪体内IL-8被大量合成、分泌、释放，空肠和回肠中IL-8 mRNA也相对增加。Gln组仔猪空肠和回肠肠道中IL-8基因表达却受到相对抑制，保持正常水平，有利于减轻机体应激反应。有研究表明，前期一些药物的添加已可在机体细胞水平发挥保护作用，尤其是肠道内，当外源或内源性毒素进入体内刺激相关位点时，会进一步提升肠道中IL-12β基因的相对表达及血液中IL-12的分泌量，有利于免疫应激后肠道健康的恢复[24]，笔者的试验与这一研究结果保持一致，意味着谷氨酰胺具有改善肠道免疫和维护肠道健康的功能。由于早期断奶仔猪免疫系统尚未发育完全，腹腔注射LPS后，肠道各段IL-17α基因的表达丰度受到抑制，血液中IL-17的分泌量也偏低，因此细菌脂多糖造成的机体损害难以得到缓解。而本研究日粮中谷氨酰胺的添加则可极大程度地解除这种抑制，尤其在十二指肠中，IL-17α的相对表达量得到迅速提升，血液中IL-17的含量随之显著增加，有利于肠道在早期便开始做好抵御外界刺激的准备。相关研究也表明IL-17主要集中于小肠的前端发挥作用[25]，这一结果与本研究中IL-17α相对表达量在肠道前端更显著提升是一致的，也充分说明了谷氨酰胺在肠道免疫系统和维持肠道健康方面发挥着重要作用。
4 结论LPS诱导机体损伤后仔猪血液IgM含量显著提高，饲粮中添加1%谷氨酰胺可进一步提高IgM含量。饲粮中1%谷氨酰胺的添加使仔猪受LPS刺激后，血液中已升高的IL-8恢复至正常水平，而显著提高了IL-17的含量。日粮中1%谷氨酰胺的添加降低了IL-8 mRNA的相对表达丰度，提高了IL-12β与IL-17α mRNA的相对表达丰度。添加1%谷氨酰胺能够在一定程度上增强LPS诱导肠道损伤后仔猪的免疫力，有助于减轻应激带来的机体损伤，从而促进仔猪恢复健康。
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