球虫病是集约化养鸡业中最重要的疾病，会严重降低肉仔鸡的生长速率，每年给养鸡业造成大约30亿美元的损失[1]。盐霉素是1968年[2]从白色链霉菌ATCC21838菌株的培养液中发现和提取的一元羧酸聚醚类离子载体型抗生素，是一种高效、广谱、低耐药的抗球虫药物[3-5]，目前主要用于防治家禽球虫病和提高反刍动物的饲料吸收率[6]。盐霉素常因使用剂量过大、拌料不均、联合用药或误服导致靶动物和非靶动物中毒，并且有报道显示，在盐霉素生产过程中，因防护不当导致工人中毒[5-8]。盐霉素中毒最常见的临床症状包括厌食、腹泻、呼吸困难、两肢瘫痪、运动失调等[9]。剖检常见明显的心外膜出血、心肌扩张及出血，胸肌、腿肌不同程度出血，肺充血，肝淤血肿胀呈花斑状等病变[10-11]。组织病理学检查发现盐霉素中毒可以引起严重的心肌和骨骼肌病变，显示心肌纤维空泡变性，心肌线粒体受损[12]，骨骼肌纤维玻璃样变及颗粒变性，坏死肌纤维周围伴有严重的巨噬细胞和异嗜细胞浸润[1]。
目前，在医学临床上，大量的研究表明盐霉素能抑制多种癌细胞的生长及转移，并诱导癌细胞凋亡[13-15]，但盐霉素对靶动物的毒性作用机制尚未见报道。为进一步研究盐霉素对靶动物的毒性作用及其机制，笔者以鸡原代心肌细胞为模型，初步探究盐霉素对鸡原代心肌细胞的毒性作用及其分子机制，为深入研究盐霉素毒性机制及盐霉素中毒的防治提供理论依据和思路。
1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器盐霉素标准品 (K0141106) 购自中国兽医药品监察所。二甲基亚砜 (DMSO)、高糖培养基 (DMEM)、胎牛血清 (FBS) 购自Gibco。5-溴脱氧尿嘧啶核苷 (Brdu)、Ⅰ型胶原酶购自Biosharp公司。α-actinin抗体购自博士德公司。MTT、台盼蓝、0.25%胰蛋白酶、双抗 (青、链霉素) 购自索莱宝公司。LDH (乳酸脱氢酶) 试剂盒购自碧云天。线粒体膜电位JC-1试剂盒购自上海翊圣。ROS、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9检测试剂盒购自南京凯基公司。Annexin-FITC/PI细胞凋亡试剂盒购自BD公司。肌酸激酶 (CK) ELISA试剂盒购自江苏绿叶生物公司。qRT-PCR相关试剂购自TaKaRa。
倒置荧光显微镜 (Carl Zeiss)、酶标仪 (Bio-Rad)、流式细胞仪FCM BD Accuri C6。
1.2 细胞培养取13日龄SPF鸡胚，采用Ⅰ型胶原酶，4 ℃消化心肌组织，用含20% FBS的DMEM培养液终止消化，采用差速贴壁法和化学法纯化心肌细胞后，置37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h后观察细胞形态，每48 h换液[16]。
1.3 心肌细胞鉴定及形态学观察取对数期细胞，以5×105·mL-1接种至预先放有无菌盖玻片的24孔板内，制备细胞爬片，经多聚甲醛固定液固定，0.2% Tritonx-100打孔通透后，滴加1:100稀释的200 μL α-actinin抗体至细胞爬片上，4 ℃过夜，PBS漂洗3次，滴加二抗，室温避光孵育60 min，用DAPI染液进行染核，室温避光孵育3~5 min，PBS漂洗3次，封片液封片后，荧光显微镜下观察并拍照。
1.4 MTT法检测细胞活性取对数生长细胞，调整密度为2.5×105·mL-1，每孔180 μL接种至96孔板，培养24 h后，分别加入盐霉素1、5、10、20、50 μg·mL-1，同时设0.1%DMSO对照孔和空白对照组，每组设置5个重复孔，置37 ℃、5% CO2 培养箱分别培养24、48、72 h。到达设定时间后，严格按照试剂盒说明书进行操作，用酶标仪在490 nm波长测定吸光度 (A) 值。
1.5 检测乳酸脱氢酶 (LDH) 释放取对数生长细胞，调整密度为2.5×105·mL-1接种至96孔板，培养24 h后，加入不同浓度的盐霉素处理24 h，同时设置样品对照孔，每组4个重复孔。到达预定的检测时间后，严格按照试剂盒说明进行操作，于490 nm处测定吸光度。
1.6 检测肌酸激酶 (CK) 活性取对数生长期细胞，加入不同浓度盐霉素分别处理6、12、24 h，同时设置样品对照孔，每组3个重复孔。到达设定时间后，冰上提取细胞总蛋白质，蛋白质样品严格按照CK-ELISA试剂盒说明书进行操作，于450 nm处测量各孔的吸光度。根据标准曲线计算出各样品中肌酸激酶的实际浓度。
1.7 Annexin V-PI双染测定细胞凋亡取对数生长期的心肌细胞，加入不同浓度盐霉素处理24 h，同时设置样品对照组，严格按照试剂盒使用说明进行操作，细胞样品在1 h内上流式细胞仪检测，使用488 nm激发波长，525 nm发射波长检测细胞凋亡率[17]。
1.8 电子显微镜观察盐霉素对心肌细胞超微结构的影响取对数生长期细胞，盐霉素处理24 h后，消化收集细胞。加入预冷的2.5%戊二醛，4 ℃固定30~60 min，再用预冷的1%锇酸4 ℃固定1 h，PBS浸洗2次。样品经丙酮/醋酸异戊酯 (1:1) 脱水后，浸入不同浓度梯度的乙腈溶液中进行干燥。将干燥后的样品抽低真空，样品进行真空喷镀法导电处理，完成处理后样品在电子显微镜下观察。
1.9 检测细胞线粒体膜电位 (ΔΨm)取对数生长细胞，加入盐霉素处理24 h后，消化收集细胞，加入500 μL JC-1 (10 mg·L-1) 染色液重悬细胞，37 ℃孵育20 min，离心3 min，沉淀细胞，加入1 mL JC-1染色缓冲液洗涤2次，用流式细胞仪检测细胞的ΔΨm。
1.10 检测细胞内活性氧 (ROS)取对数生长细胞，加入盐霉素处理24 h后，用PBS洗涤2次，加入1 mL DCFH-DA染色液，37 ℃孵育20 min，用无血清培养液洗涤细胞3次，以充分除去未进入细胞内的DCFH-DA，使用荧光显微镜观察荧光强度并拍照。
1.11 检测Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性取对数生长期的细胞加入盐霉素处理24 h后，按照试剂盒说明收集细胞，提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度后，加入Caspase检测试剂，37 ℃避光孵育4 h，用酶标仪测定其405 nm处吸光度，通过计算OD诱导组/OD阴性对照的倍数来确定诱导组Caspase的活化程度。
1.12 荧光定量PCR检测凋亡相关基因mRNA转录取对数生长期的细胞，盐霉素处理24 h，每孔加入Trizol提取细胞总RNA，通过测定样品OD260 nm/OD280 nm的比值确定RNA浓度及纯度，并通过琼脂凝胶糖电泳确定RNA的完整性。提取的RNA反转为cDNA，-20 ℃保存备用。相关引物根据GenBank中发表鸡的Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Cyt-C、Bax和Bcl-2的全基因序列，应用Prime5.0软件设计引物，具体见表 1。严格按照SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒说明书进行实时荧光定量PCR (qRT-PCR) 操作，测定并计算以上基因的mRNA转录水平。
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表 1 qRT-PCR引物序列 Table 1 qRT-PCR primers |
数据以“x±s”表示，应用SPSS15.0统计软件分析数据，采用单因素方差分析 (ANOVA)，分析各组间差异的显著性，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 心肌细胞鉴定及盐霉素对心肌细胞形态的影响在荧光显微镜下可见，在细胞质中辅肌动蛋白 (α-actinin) 特异性染成绿色为免疫荧光染色阳性，DAPI染色的细胞核呈蓝色，证实是心肌细胞；细胞质不着色，细胞核呈蓝色的为非心肌细胞，见图 1。
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A、D.绿色为辅肌动蛋白特异性染色；B、E.蓝色为DAPI染色的细胞核；C、F.辅肌动蛋白特异性染色与细胞核DAPI染色重叠图片 A, D. α-actinin specific staining (Green); B, E. DAPI-stained cell nucleus (Blue); C, F. Overlapping image of specific staining with α-actinin and DAPI-stained cell nucleus 图 1 鸡胚心肌细胞免疫荧光照片 (100×) Figure 1 Immunofluorescence identification of the cardiomyocytes (100×) |
倒置显微镜下观察可见，贴壁后的心肌细胞呈中部稍宽，两端较窄的梭形，48 h后大部分细胞已贴壁，呈三角形、不规则星形等多形性，细胞体大，细胞质丰富，细胞核大，一般3~5 d可汇合成单层。盐霉素处理24 h后可见贴壁心肌细胞数量明显减少，1 μg·mL-1组细胞即可观察到细胞内颗粒感增强，细胞内有空泡出现，随着药物浓度增加，可见到细胞逐渐圆缩，从培养皿上脱落并漂浮于培养液中，见图 2。
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A.对照组细胞; B.1 μg·mL-1组细胞; C.5 μg·mL-1组细胞; D.10 μg·mL-1组细胞; E.20 μg·mL-1组细胞; F.50 μg·mL-1组细胞；a.正常心肌细胞呈三角形、不规则星形；b.细胞内出现空泡，胞内颗粒感增强；c.细胞圆缩，脱落 A. Control group; B.1 μg·mL-1 group; C.5 μg·mL-1 group; D.10 μg·mL-1 group; E.20 μg·mL-1 group; F.50 μg·mL-1 group; a. Normal cardiomyocytes were triangular and irregular; b. Vacuoles; c. Cells contraction, shedding 图 2 盐霉素处理后心肌细胞形态变化 (100×) Figure 2 Morphological changes of cardiomyocytes (100×) |
盐霉素处理心肌细胞后，细胞生长被抑制，呈浓度和时间依赖性。盐霉素处理24 h，最高浓度组50 μg·mL-1细胞存活率降低至 (10.70±3.91)%，盐霉素作用48 h，50 μg·mL-1组细胞存活率降低至 (3.64±3.29)%，盐霉素作用72 h，50 μg·mL-1组细胞存活率降低至 (4.22±3.07)%，见图 3。
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相同时间，与对照组 (0 μg·mL-1) 相比，*.差异显著 (P＜0.05)，**.差异极显著 (P＜0.01)。下图同 At the same time, compared with control (0 μg·mL-1), *. Significant difference (P < 0.05), **. Very significant difference (P < 0.01). The same as below 图 3 盐霉素抑制心肌细胞生长 Figure 3 Inhibitory effect of salinomycin on cardiomyocytes |
心肌细胞经不同浓度盐霉素分别处理24、48、72 h，随着药物浓度和作用时间的增加，细胞活性逐渐降低，呈浓度与时间相关性。药物质量浓度从1 μg·mL-1增加至50 μg·mL-1，处理24 h后细胞活性由 (91.70±2.58)%降低至 (53.11±7.63)%，同上药物浓度处理48 h后细胞活性由 (68.60±5.40)%降低至 (25.67±2.88)%，半数抑制浓度 (IC50) 为20~50 μg·mL-1，处理72 h后细胞活性由 (60.45±4.62)%降低至 (11.75±3.62)%，半数抑制浓度 (IC50) 为10~20 μg·mL-1，见图 4。
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图 4 盐霉素降低心肌细胞活性 Figure 4 Salinomycin reduce the activity of cardiomyocytes |
盐霉素对心肌细胞LDH释放的影响具有浓度依赖性。0.5 μg·mL-1处理组的细胞释放至培养液中的LDH极显著高于阴性对照组，为对照组的1.16±0.06倍，最高浓度组50 μg·mL-1 LDH释放浓度为对照组的1.47±0.72倍，见图 5。
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图 5 盐霉素对心肌细胞LDH释放的影响 Figure 5 The measurement of LDH by different concentration of salinomycin |
盐霉素分别处理心肌细胞6、12、24 h，心肌细胞内的CK酶浓度随时间和药物浓度的增加而升高，呈时间和浓度相关性。盐霉素处理6 h，细胞内CK质量浓度由1 739.129 ng·L-1升高至2 327.288 ng·L-1；盐霉素作用12 h，细胞内CK质量浓度由1 338.248 ng·L-1升高至3 214.293 ng·L-1；盐霉素作用24 h，细胞内CK质量浓度由1 000.203 ng·L-1升高至2 993.390 ng·L-1。盐霉素分别处理心肌细胞6~24 h，其中作用12 h后，心肌细胞内的CK酶浓度整体高于6和24 h组，见图 6。
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图 6 盐霉素对心肌细胞内CK酶活性的影响 Figure 6 The measurement of CK by different time and concentration of salinomycin |
盐霉素处理心肌细胞24 h，药物处理组和对照组相比，细胞凋亡率随着药物浓度的升高而增加，呈浓度依赖性，细胞凋亡率 (早期凋亡率和晚期凋亡率之和) 由对照组 (7.13±0.81)%增加至50 μg·mL-1组 (42.50±6.16)%，10、20和50 μg·mL-1组细胞凋亡率极显著高于空白对照组 (P < 0.01)，见图 7。
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A.对照组; B. 1 μg·mL-1组; C. 5 μg·mL-1组; D. 10 μg·mL-1组; E. 20 μg·mL-1组; F. 50 μg·mL-1组; G.各组凋亡情况 A. Control group; B.1 μg·mL-1 group; C.5 μg·mL-1 group; D.10 μg·mL-1 group; E.20 μg·mL-1 group; F.50 μg·mL-1 group; G. Apoptosis of different group 图 7 盐霉素对心肌细胞凋亡的影响 Figure 7 Salinomycin induces apoptosis in cardiomyocytes |
电子显微镜下观察，对照组细胞膜清晰完整，细胞质内线粒体丰富，线粒体嵴清晰，核膜完整，核内染色质分布均匀。5 μg·mL-1组细胞内线粒体颜色变深，线粒体嵴模糊；20 μg·mL-1组细胞内线粒体明显肿胀，呈现空泡化，线粒体嵴模糊、溶解甚至消失；50 μg·mL-1组细胞线粒体数量明显减少，线粒体嵴严重肿胀、溶解，线粒体染色质固缩，细胞质空泡增多，细胞器模糊不清，细胞内出现疑似自噬体的囊泡状结构，内含有未消化的细胞器，见图 8。
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A、B.对照组; C、D. 5 μg·mL-1组; E、F. 20 μg·mL-1组; G、H.50 μg·mL-1组；a.正常细胞线粒体；b.线粒体嵴模糊不清；c.线粒体肿胀、空泡化；d.内含未消化细胞器的囊泡状结构；e.细胞质空泡化 A, B. Control; C, D. 5 μg·mL-1 group; E, F. 20 μg·mL-1 group; G, H.50 μg·mL-1 group; a. Normal mitochondria; b. Cristae blurred; c. Mitochondria swollen and vacuolated; d. Autophagosomes containing only partially digested material; e. Cytoplasmic vacuole 图 8 盐霉素对心肌细胞超微结构的影响 Figure 8 Effect of salinomycin on the ultrastructural morphology of cardiomyocytes |
心肌细胞经盐霉素处理24 h，线粒体膜电位 (ΔΨm) 随药物浓度增加而逐渐下降，与药物浓度呈负相关性。盐霉素处理后，1 μg·mL-1处理组心肌细胞ΔΨm已极显著下降，随着药物浓度增高，ΔΨm下降率由对照组的 (4.90±0.53)%上升至50 μg·mL-1组的 (38.96±1.38)%，见图 9。
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A.对照组; B.1 μg·mL-1组; C.5 μg·mL-1组; D.10 μg·mL-1组; E.20 μg·mL-1组; F.50 μg·mL-1组; G.各组线粒体膜电位下降率 A. Control group; B.1 μg·mL-1 group; C.5 μg·mL-1 group; D.10 μg·mL-1 group; E.20 μg·mL-1 group; F.50 μg·mL-1 group; G. Decline rate in mitochondrial membrane potential of different group 图 9 盐霉素对心肌细胞线粒体膜电位的影响 Figure 9 Effect of salinomycin on mitochondrial membrane potential |
盐霉素处理心肌细胞24 h后，处理组细胞内ROS水平显著升高，对照组细胞ROS荧光强度极低，随着盐霉素浓度增加，细胞荧光强度逐渐增强，细胞内产生ROS呈药物浓度依赖性增加，其中50 μg·mL-1组细胞内ROS荧光最强，见图 10。
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A.对照组; B.1 μg·mL-1组; C.5 μg·mL-1组; D.10 μg·mL-1组; E.20 μg·mL-1组; F.50 μg·mL-1组 A. Control group; B.1 μg·mL-1 group; C.5 μg·mL-1 group; D.10 μg·mL-1 group; E.20 μg·mL-1 group; F.50 μg·mL-1 group 图 10 盐霉素对心肌细胞内活性氧水平的影响 Figure 10 The effects of salinomycin on intracellular ROS |
盐霉素处理心肌细胞24 h后，随着药物浓度的升高，细胞内Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白酶活性极显著增加，呈浓度依赖性 (P＜0.01)。其中，50 μg·mL-1组细胞内Caspase-3蛋白酶活性约为对照组的3.5倍，Caspase-8蛋白酶活性为对照组的1.62倍，10 μg·mL-1组Caspase-9蛋白酶活性为对照组的1.36倍，见图 11。
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图 11 盐霉素对心肌细胞中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白活性的影响 Figure 11 Active Caspase-3, Caspase-8 and Caspase-9 protein levels for cardiomyocytes treated by salinomycin |
盐霉素处理心肌细胞24 h，细胞凋亡关键基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax及Cyt-C mRNA表达水平显著上调，Bcl-2基因mRNA表达水平下调。在表达上调的基因中，5 μg·mL-1处理组的Caspase-3、Caspase-9的mRNA水平最高，分别为对照组的14.58倍和4.86倍，20 μg·mL-1盐霉素处理组的Caspase-8和Cyt-C基因mRNA水平最高，分别为对照组的3.08倍和3.80倍，50 μg·mL-1处理组的Bax基因mRNA水平最高，为对照组的2.34倍 (P < 0.01)；盐霉素处理心肌细胞24 h，随着药物浓度增加，Bcl-2基因mRNA水平极显著下调 (P＜0.01)，其中50 μg·mL-1组Bcl-2下调最显著，基本呈浓度依赖性，见图 12。
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图 12 盐霉素对心肌细胞Caspase-3、8、9以及Bax、Bcl-2、Cyt-C基因转录的影响 Figure 12 The effects of salinomycin on transcription of Caspase-3, Caspase-8, Caspase-9, Bax, Bcl-2 and Cyt-C genes |
盐霉素为聚醚类离子载体抗生素之一，长期添加于饲料中用于肉鸡球虫病的预防及促生长，在世界范围内广泛应用[17]。由于盐霉素安全范围较窄，临床上常因剂量过大、拌料不均、联合用药等导致肉鸡中毒，国内外已有大量文献报道[18-20]，关于其毒性机制鲜有研究。本研究以鸡原代心肌细胞为模型，深入探讨盐霉素毒性作用及可能的分子机制。
研究结果表明，盐霉素以时间和浓度依赖的方式抑制鸡心肌细胞生长并引起细胞死亡，这与盐霉素诱导人肺腺癌、卵巢癌等肿瘤细胞死亡的研究结果一致[14-15, 21]。同时，心肌细胞CK和LDH升高提示盐霉素破坏心肌细胞膜进而降低细胞活性，导致细胞内容物释放，这与盐霉素中毒后患畜或患者的血清CK及LDH水平异常增加高度相关[22]。我们前期研究显示同类药物马度米星铵可以诱导小鼠骨骼肌细胞C2C12和大鼠心肌细胞H9C2发生凋亡[17]，盐霉素是否通过该方式引起鸡心肌细胞死亡引起我们的兴趣。流式细胞仪检测结果表明心肌细胞凋亡率随盐霉素浓度的升高而增加，同时凋亡效应蛋白Caspase-3活性显著增加，证实了我们的假说，即盐霉素可以诱导鸡心肌细胞凋亡。
为探究盐霉素诱导鸡心肌细胞凋亡的分子机制，笔者进一步测定线粒体膜电位ΔΨm及细胞内活性氧ROS水平，结果表明二者均显著升高。结合透射电镜观察结果，线粒体肿胀、空泡化，嵴模糊、溶解甚至消失，说明盐霉素可能通过线粒体途径诱导心肌细胞凋亡，并且氧化应激参与了该过程，这与前人的报道一致[23-24]。细胞凋亡是一种高度复杂的过程，涉及多种信号分子[25-29]，笔者进一步研究了凋亡相关基因和蛋白质的表达变化。凋亡启动分子Caspase-8、Caspase-9 mRNA和蛋白质表达水平的显著升高以及Bax和Cyt-C mRNA水平的提高表明死亡受体途径和线粒体途径可能共同参与了盐霉素引起的心肌细胞凋亡作用，但仍需要进一步研究与证实。
本研究结果表明，盐霉素可以通过细胞凋亡引起鸡心肌细胞死亡，线粒体途径和死亡受体途径可能共同参与了盐霉素诱导的心肌细胞凋亡。该结果为进一步探究盐霉素的毒性机制及盐霉素中毒的防治提供了一定的理论依据，但其具体的毒性机制尚需深入研究。
4 结论盐霉素抑制鸡原代心肌细胞生长，损伤细胞线粒体，对鸡心肌细胞具有明显的细胞毒性作用，致毒机制可能为氧化损伤作用和促细胞凋亡作用，并且线粒体途径和死亡受体途径可能共同参与了盐霉素诱导的心肌细胞凋亡。
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