, LIU Xin-chao, SUN Xiao-ni, WANG Shuai, XU Li-xin, SONG Xiao-kai, YAN Ruo-feng, LI Xiang-rui
刚地弓形虫，最早在1908年由C. Nicolle等发现[1]，是一种专性细胞内寄生性原虫，能够感染几乎所有温血动物 (包括人、猫、鸡等[2]) 引发弓形虫病，具有重要的兽医学和公共卫生意义。弓形虫通常表现隐性感染，但对于免疫缺陷者及AIDS患者却具有致命威胁。有关弓形虫的治疗与防控工作不断深入，药物方面，磺胺氯吡嗪表现出良好的抗弓形虫效果[3]，但磺胺类药物对人体存在副作用；传统疫苗有弱毒活疫苗等[4]，亚单位疫苗、DNA疫苗为近几年的新型疫苗，并表现出良好的免疫保护性[5-6]；新型佐剂、细胞因子等分子也被用以加强疫苗的免疫保护力[7]。巨噬细胞是机体非特异性免疫反应的重要细胞，具有吞噬外源性抗原、抗原递呈、分泌细胞因子等功能，在机体抗弓形虫免疫中同样发挥重要作用。近年来有关弓形虫代谢酶功能的研究越来越多，其中弓形虫钙依赖蛋白激酶 (CDPK) 是一类催化蛋白质磷酸化反应的酶，能够促进虫体的入侵，在弓形虫释放过程中的Ca2+信号通路中也有着关键作用[8-9]。并且它在不同基因型之间变异较小，而与人源蛋白激酶同源性差异较大，因此适合作为弓形虫药物的靶位点及疫苗候选分子[10]。
笔者选择弓形虫钙依赖蛋白激酶9(CDPK9) 与小鼠巨噬细胞进行作用，检验其对小鼠巨噬细胞活性及免疫功能的影响，分析其在弓形虫免疫中的作用，对于评价其作为弓形虫候选疫苗的潜力具有重要参考意义。
1 材料与方法 1.1 试验材料SD大鼠，购自扬州大学实验动物中心。
弓形虫RH株由本实验室保种传代。
小鼠巨噬细胞系Ana-1，购自中国科学院上海细胞库。CCK-8试剂盒及总一氧化氮检测试剂盒购自碧云天生物公司。Annexin V-FITC kit细胞凋亡检测试剂盒及FITC-dextran购自南京福麦斯公司。免疫荧光染色试剂盒购自南京诺唯赞公司。小鼠TNF-α、TGF-β1、IL-10、IL-1β ELISA试剂盒购自武汉博士德公司。
1.2 试验方法 1.2.1 目的基因克隆纯化RH株速殖子，提取总RNA进行反转录PCR获得cDNA。根据GenBank登录的Tg-CDPK9基因的完整的开放阅读框 (ORF) 序列 (序列号：XM_018779775)，利用Primer5.0软件设计一对特异性引物：上游引物F：5′-CGCGGATCCATGCCGGAGACAAAGGGAG-3′，下游引物R：5′-CCGCTCGAGCTAAGAGGTCATCAAATCGCAGA-3′，上下游引物的酶切位点分别为BamHⅠ和XhoⅠ。以反转录所得cDNA为模板进行PCR反应，对目的片段进行回收纯化。扩增目的片段长度约2 001 bp。
1.2.2 载体构建、蛋白质表达与纯化将回收后的目的片段，与经过BamHⅠ和XhoⅠ双酶切的pET-32a表达载体连接构建重组质粒。筛选经鉴定成功的阳性菌接种于含1 μg·mL-1氨苄霉素的1 000 mL LB培养基中，加入终浓度为0.1 mmol·L-1 IPTG诱导表达。通过镍柱吸附对蛋白质进行纯化；通过去内毒素试剂盒 (金斯瑞公司) 去除蛋白内毒素。
1.2.3 大鼠抗血清制备及Western blot分析用纯化后的CDPK9蛋白免疫SD大鼠。一免，1 mL (300 μg) CDPK9蛋白与1 mL弗氏完全佐剂混合乳化，皮下免疫2只大鼠，每只1 mL。一免后2周二免，1 mL (300 μg) CDPK9蛋白与1 mL弗氏不完全佐剂混合乳化，皮下免疫大鼠，并分别于首免后第4、6、8周进行三免、四免、五免，方法同二免。五免后大鼠眼眶采血，分离血清[11]。以弓形虫速殖子可溶性蛋白 (soluble tachyzoite antigen，STAg) 为抗原进行SDS-PAGE电泳，以免疫CDPK9蛋白的大鼠血清为一抗 (1:100稀释)，以HRP标记的羊抗大鼠IgG (1:6 000稀释) 为二抗，进行Western bolt分析，曝光拍照。
1.2.4 Ana-1巨噬细胞的复苏、传代细胞从液氮中取出，42 ℃水浴复苏，接种到含10%胎牛血清的DMEM培养液中进行培养传代，选择处于对数生长期的细胞用于后续试验。
1.2.5 细胞结合试验及共同培养处理将细胞按1×105·mL-1浓度接种于6孔细胞培养板 (每孔2 mL)，加入20 μg·mL-1 CDPK9蛋白20 μL，与细胞共孵育1 h，并转移至1.5 mL的Eppendorf管中，5 000 r·min-1离心5 min，弃上清，PBS漂洗，重复2次。PBS重悬细胞，将细胞悬液滴加到防脱玻片，用4%的多聚甲醛室温固定30 min，PBS漂洗3次，滴加含5% BSA的PBS室温封闭1.5 h，移除封闭液，滴加大鼠抗CDPK9血清 (1:500稀释) 为一抗，4 ℃孵育过夜，PBS漂洗3次，滴加Cy3标记的山羊抗大鼠IgG (1:500稀释) 为二抗，37 ℃避光孵育1 h，PBS漂洗3次，DAPI室温复染4 min，PBS漂洗3次，用DIO (细胞膜染液) 室温复染6 min，PBS漂洗3次，抗荧光淬灭封片液封片，激光共聚焦显微镜观察、拍照。设置PBS与细胞共作用组为对照组。另外接种浓度为5×105·mL-1的细胞于12孔细胞培养板 (每孔2 mL)，每孔加入不同浓度的CDPK9(终质量浓度分别为0、5、10、20、40、80 μg·mL-1) 与细胞共同培养48 h，pET-32a载体蛋白处理组设置为对照组。每组设3个重复。
1.2.6 CCK-8检测细胞增殖调整细胞浓度为5×105·mL-1并接种至96孔细胞培养板，每孔100 μL，分别加入不同浓度的CDPK9(终质量浓度分别为0、5、10、20、40、80 μg·mL-1) 轻柔混匀。10 μg·mL-1 LPS刺激组设置为阳性对照组。培养24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续孵育2 h，在450 nm测定吸光度。每组设3个重复。
1.2.7 流式细胞术检测细胞凋亡及吞噬作用收集“1.2.4”中的细胞 (约1×106个) 于1.5 mL Eppendorf管中，用细胞凋亡试剂盒中1×Binding Buffer洗涤，5 000 r·min-1离心5 min，重复2次；100 μL 1×Binding Buffer重悬细胞；加入10 μL Annexin V-FITC；轻轻混匀，避光孵育15 min；1×Binding Buffer洗涤，5 000 r·min-1离心5 min，重复2次，弃上清，500 μL 1×Binding Buffer重悬细胞；加入5 μL PI溶液，轻轻混匀，转入流式管中，上机检测细胞凋亡。
同样收集“1.2.4”中细胞，用预冷的PBS洗涤，5 000 r·min-1离心5 min，重复2次，重悬计数。然后分别取100 μL细胞悬液，加入100 μL FITC标记的葡聚糖 (FITC-dextran，质量浓度为1 mg·mL-1)，轻轻混匀。分别置于4和37 ℃条件下孵育1 h，用含2%FBS的预冷PBS洗涤，5 000 r·min-1离心5 min，重复2次，弃上清，最后加入500 μL PBS重悬细胞，上机检测细胞吞噬。
1.2.8 总一氧化氮试剂盒检测NO收集“1.2.4 ”中的细胞，5 000 r·min-1离心5 min收集上清。试验前1 h将试剂于冰上融化。试验设样品组、标准品组、空白对照组，每组3个重复。于96孔细胞培养板中，每孔分别加入样品、标准品、样品稀释液60 μL，然后依次加入2 mmol·L-1NADPH各5 μL，FAD各10 μL，Nitrate Reductase各5 μL，轻轻混匀，37 ℃孵育30 min，然后依次加入LDH buffer，LDH各10 μL，轻轻混匀，37 ℃孵育30 min，然后依次加入Griess ReagentⅠ、Griess ReagentⅡ各50 μL，混匀后室温孵育10 min测定A540 nm。
1.2.9 细胞因子分泌水平检测收集“1.2.4”中的细胞，5 000 r·min-1离心10 min收集细胞上清，并将细胞上清按照博士德公司小鼠TNF-α、TGF-β1、IL-10、IL-1β ELISA试剂盒操作说明测定细胞因子表达量。
1.3 数据分析使用GraphPad Prism 5软件进行数据统计分析，组间差异显著性使用One-way ANOVA进行比较，P < 0.05为差异性显著。
2 结果 2.1 CDPK9蛋白的表达与纯化经过反转录PCR克隆出CDPK9 ORF (长度2 001 bp)，连接至pET-32a表达载体，经测序鉴定，与GenBank登录的原始序列相似性达99.5%。经诱导表达，得到了相对分子质量大小约95 ku的条带，与预期的蛋白质相对分子质量大小一致 (图 1)。通过镍柱吸附对蛋白质进行纯化，获得了较高纯度的CDPK9蛋白 (图 1)。
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M.蛋白质相对分子质量标准；0~5.pET-32a (+)-CDPK9诱导0~5 h后细菌裂解产物；6~7.pET-32a (+) 诱导0、5 h后细菌裂解产物；8.pET-32a (+)-CDPK9纯化 M. Protein molecular weight marker; 0-5. pET-32a (+)-CDPK9 induced by IPTG for 0-5 h; 6-7. pET-32a (+) induced by IPTG for 0 and 5 h; 8. pET-32a (+)-CDPK9 after-purification 图 1 SDS-PAGE分析pET-32a (+)-CDPK9的诱导表达及纯化 Figure 1 SDS-PAGE analysis of the expression and purification of pET-32a (+)-CDPK9 |
以弓形虫速殖子可溶性蛋白为抗原进行SDS-PAGE电泳，以免疫CDPK9蛋白的大鼠血清为一抗，以HRP标记的羊抗大鼠IgG为二抗，进行Western bolt验证，出现了与预期蛋白质大小一致的条带，而空白血清无识别条带，证明大鼠抗血清能够识别弓形虫天然蛋白质 (图 2)。
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M.蛋白质相对分子质量标准；1.弓形虫速殖子可溶性抗原与大鼠抗CDPK9血清Western blot分析；2.弓形虫速殖子全虫可溶性抗原与大鼠空白血清Western blot分析 M. Standard protein molecular weight marker; 1. Sonatic extract of T. gondii tachyzoites probed by rat anti-CDPK9 serum as primary antibody; 2. Sonatic extract of T. gondii tachyzoites probed by serum of normal rat as primary antibody 图 2 大鼠抗血清Western blot分析 Figure 2 Western blot of the rat anti-CDPK9 serum |
激光共聚焦对三种荧光分别拍照，并将各通道荧光进行叠加，结果显示CDPK9组有红色荧光，而PBS对照组无红色荧光，表明CDPK9能够与Ana-1巨噬细胞结合 (图 3)。
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利用Cy3标记的羊抗大鼠IgG (红色) 进行间接免疫荧光染色，细胞核和细胞膜分别用DAPI (蓝色)、DIO (绿色) 进行复染，激光共聚焦显微镜分别拍照，将三个通道荧光进行叠加 All cells were fixed and incubated with rabbit anti-CDPK9 antibody followed by Cy3 labeled goat anti-rabbit IgG (red). The nuclei and membranes of the corresponding cells were visualized by DAPI (blue) and DIO (green) staining, respectively. The binding of CDPK9 to Ana-1 cells was visualized with a confocal laser scanning microscopy. Images are merged composites of red, green and blue channels 图 3 CDPK9与巨噬细胞的结合试验 Figure 3 Binding of CDPK9 to Ana-1 cells |
将不同浓度CDPK9蛋白与巨噬细胞作用48 h后，经CCK-8试剂盒检测，结果显示，与空白细胞组相比，质量浓度40及80 μg·mL-1CDPK9对巨噬细胞增殖产生抑制作用。其中40 μg·mL-1作用组差异性显著，80 μg·mL-1作用组差异性极显著 (图 4)。
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*.P < 0.05，***.P < 0.001 Proliferation index = OD450 nm(试验组) / OD450 nm (空白细胞组) 图 4 不同浓度CDPK9蛋白作用对巨噬细胞增殖活性的影响 Figure 4 Effect of CDPK9 on the proliferation of Ana-1 cells |
试验中，CDPK9蛋白刺激后，巨噬细胞的早期凋亡及晚期凋亡比例均显著上升 (图 5)。其中，细胞晚期凋亡的比例随着作用蛋白质质量浓度的升高而上升，而蛋白质质量浓度为40 μg·mL-1时，细胞早期凋亡比例最高 (图 5)。
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A. FITC-PI双染流式分析；B.细胞早期凋亡；C.细胞晚期凋亡。***.P < 0.001 A. The flow cytometry data showed double staining result; B. Early-stage (%) apoptosis; C. Late-stage (%) apoptosis.***.P < 0.001 图 5 CDPK9诱导Ana-1细胞凋亡 Figure 5 The apoptosis of Ana-1 cells induced by CDPK9 |
本试验中，用FITC标记的dextran (葡聚糖)，来评价CDPK9对巨噬细胞吞噬活性的影响。与CDPK9共同孵育后，巨噬细胞吞噬dextran的比例提高 (图 6)。
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***.P < 0.001 图 6 CDPK9对Ana-1细胞吞噬功能的影响 Figure 6 Effect of CDPK9 on the phagocytosis of Ana-1 cells |
细胞与CDPK9共作用后离心收集上清，按试剂盒方法操作，通过酶标仪测定，结果显示：与空白细胞组及pET-32a空载体蛋白组相比，不同浓度CDPK9作用使NO产量上升 (图 7)。
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***.P < 0.001 图 7 CDPK9对Ana-1巨噬细胞NO分泌的影响 Figure 7 Effect of CDPK9 on the NO production of Ana-1 cells |
ELISA试剂盒测定结果显示，与空白组及pET-32a空载体蛋白组相比，CDPK9作用组TNF-α分泌量极显著上升，IL-1β分泌量上升；而TGF-β1及IL-10分泌量极均极显著下降 (图 8)。
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*.P < 0.05, ***.P < 0.001 图 8 Ana-1巨噬细胞四种细胞因子分泌水平 Figure 8 Production of four cytokines in Ana-1 macrophages |
在机体抗弓形虫免疫中，多种类型的免疫细胞共同发挥作用，其中巨噬细胞的作用是不可替代的[12-13]，在不同情况下，不同类型巨噬细胞可相互转换来实现其功能调节[14]。巨噬细胞是重要的先天性免疫细胞，具有非特异性吞噬、抗原摄取及递呈等功能，并能通过分泌细胞因子、NO等来介导炎症反应[15]，因此探索宿主巨噬细胞的免疫机制对于弓形虫的研究具有重要的意义。
本研究发现，经过CDPK9的刺激，巨噬细胞的增殖活性受到明显抑制。已有文章报道，弓形虫培养上清对肝癌细胞的增殖产生抑制作用[16]。研究发现，某种酶抑制剂能够通过提高体内Ca2+离子的浓度来抑制细胞的增殖。细胞内Ca2+含量通常保持较低水平，以维持细胞稳态，Ca2+升高常伴随细胞增殖抑制及细胞凋亡的发生[17-18]。CDPK9作为弓形虫体内重要的代谢酶，可能通过提高细胞内Ca2+含量对宿主细胞的活性进行抑制，同时有利于虫体在宿主的入侵与转移。
吞噬功能是巨噬细胞的主要功能之一，它能够吞噬病原物质及坏死细胞。本研究发现，巨噬细胞与CDPK9共同孵育后，巨噬细胞的吞噬能力明显上升。推测经一定浓度CDPK9刺激后，巨噬细胞活性升高，吞噬能力增强。
细胞凋亡是细胞的一种程序性死亡，是机体面对病原入侵的一种保护机制，巨噬细胞可以通过介导自身或其他细胞凋亡实现免疫调节功能。目前的研究已经发现细胞凋亡存在3条信号通路：死亡受体通路、线粒体通路和内质网通路[19]。细胞凋亡往往伴随细胞质内Ca2+浓度的升高，而CDPK9活性与Ca2+浓度有关，本研究中推测CDPK9通过调控细胞内Ca2+浓度升高，诱发巨噬细胞凋亡。进一步分析认为，细胞早期凋亡及晚期凋亡比例均显著上升，衰老或突变的细胞得以清除，有助于维持细胞正常的生理功能及内环境稳态。而细胞凋亡受多种基因调控，其具体机制将有待深入研究。
通过对巨噬细胞NO生成量的检测发现CDPK9使巨噬细胞NO产量上升。已有大量文献报道，NO在机体杀灭弓形虫、球虫和疟原虫等寄生虫中均能发挥重要作用[15, 20]。催化NO的产生有神经型、内皮型、诱导型3种途径。机体内NO水平正常状态下维持稳定或较低水平，但当机体感染寄生虫等病理阶段，催化iNOS (诱导型一氧化氮合酶) 产生进而诱导NO合成，发挥正向杀伤作用，抑制虫体的增殖与扩散。一定浓度的CDPK9刺激巨噬细胞NO分泌，增强细胞的病理杀伤能力。
巨噬细胞能够分泌多种细胞因子、趋化因子，它们的含量与弓形虫的入侵及转移密切相关。巨噬细胞活化使促炎性细胞因子IL-1β和TNF-α、IL-6等的分泌增加，加强机体抵抗细菌或弓形虫感染的能力。IL-1表达量上升，能够与IL-12一起刺激巨噬细胞、NK细胞等通过先天性免疫途径分泌IFN-γ[21]。TNF-α可由巨噬细胞、树突状细胞、T细胞多种途径分泌，并且研究显示，宿主缺失TNF-α会导致其对弓形虫抵抗力下降[22]。并且TNF-α可诱导M1型巨噬细胞活化，诱导iNOS合成，被认为在吞噬病原及激发细胞免疫中发挥重要功能[23]。IL-1β和TNF-α表达量的上升，同时促进IFN-γ的表达，共同提高细胞对弓形虫的抵抗能力。
本试验中抗炎性细胞因子TGF-β1与IL-10分泌水平下降。以往研究表明，TGF-β1在抗弓形虫免疫中，可能发挥着双重作用，一方面能够促进某些炎症进程，例如诱导Th17型细胞的分化形成[24]。另一方面主要发挥对宿主的免疫抑制作用，作为重要的抗炎性细胞因子，TGF-β1通过抑制iNOS的产生及TNF-α、IFN-γ分泌，抑制机体的免疫状态[25]。此外R. T. Gazzinelli等的研究表明，在小鼠腹腔感染弓形虫试验中，IL-10对于IFN-γ的下调起到关键作用[26]。综合以上内容，笔者推测巨噬细胞对CDPK9刺激作出有利回应，因此这两种抗炎性细胞因子分泌下降，以应对弓形虫感染。
通过CDPK9与小鼠巨噬细胞的共同作用，本文首次在体外环境下证明CDPK9对小鼠巨噬细胞多种途径的调节，为后续深层次的研究奠定了基础。而弓形虫与宿主细胞之间作用机制复杂，不同免疫细胞之间的协作及细胞内的信号通路等还需更深一步的探究。
4 结论CDPK9能够与Ana-1巨噬细胞结合，对Ana-1巨噬细胞增殖具有抑制作用，较高浓度时抑制作用明显。CDPK9能够显著提高Ana-1巨噬细胞的凋亡比例，同时促进其吞噬能力。CDPK9可上调Ana-1巨噬细胞NO产量，上调细胞因子IL-1β和TNF-α的表达量，下调TGF-β1和IL-10的表达量。可见CDPK9能够与巨噬细胞结合并通过多种途径影响其活性及免疫功能。
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