捻转血矛线虫 (Haemonchus contortus) 隶属毛圆科 (Trichostrongylidae) 血矛属 (Haemonchus)，是牛、羊等反刍动物一种常见的胃肠道寄生性线虫，主要寄生于皱胃，偶见于小肠，以吸食宿主血液为生[1]，可引起宿主皱胃黏膜的出血、损伤、发炎，影响宿主物质代谢，进而导致患畜贫血、腹泻、消瘦，严重者甚至可致患畜死亡[2]，给我国畜牧业的发展带来巨大经济损失。
排泄分泌抗原 (excretory and secretory products，ESPs) 是虫体的代谢分泌产物[3]，包括多种蛋白质[4]，能与宿主免疫系统直接接触[3]，本实验室J. A. Gadahi博士对捻转血矛线虫ESPs与山羊外周血单个核细胞 (peripheral blood mononuclear cells，PBMCs) 体外结合蛋白进行鉴定，通过LC-MS/MS共鉴定得到146种结合蛋白[5]，对它们的功能进行深入分析，有助于进一步了解虫体与宿主免疫系统的作用机制。
笔者从146种结合蛋白中选取NADH:泛醌氧化还原酶结构域包含蛋白 (NADH:ubiquinone oxidoreductase domain containing protein，NDUDC) 对其基因进行克隆表达，NADH:泛醌氧化还原酶 (NADH:ubiquinone oxidoreductase，NDU) 是生物体内呼吸链上参与电子传递的第一个也是最大的功能酶复合体[6]，由多个亚基组成[7]，在氧化磷酸化过程中起着重要作用[6]，这提示NDUDC蛋白与虫体的能量代谢过程可能存在密切联系；此外作为虫体的一种排泄分泌抗原，对宿主免疫细胞可能也会产生一定影响，笔者主要就这一方面内容进行研究，以期对该蛋白质在虫体与宿主免疫系统相互作用方面有新的认识。
1 材料与方法 1.1 实验动物健康山羊，购自南京郊区某山羊养殖场，驱虫后经检查无寄生虫感染，体况良好。
雌性标重清洁级大鼠，购于扬州大学兽医学院比较医学实验动物中心。
1.2 虫体捻转血矛线虫虫株由本实验室长期保存。
1.3 质粒及菌种大肠杆菌DH5α、BL21；pET-32a (+) 质粒均由本实验室保存。
1.4 主要工具酶和试剂LA Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl2、10×PCR Buffer、限制性核酸内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、克隆载体pMD-19T、T4DNA连接酶均购自大连宝生物 (TaKaRa) 工程有限公司；TRIzol® Reagent试剂购自Invitrogen公司；淋巴细胞分离液为天津灏洋生物公司产品；RPMI1640培养基、DMEM培养基为Gbico公司产品；青链霉素溶液与胎牛血清购自Life technologies公司；12孔、24孔、96孔Costar®细胞培养板购自Corning公司；Cy3标记山羊抗大鼠IgG (H+L)、DAPI染色液、Cell Counting Kit-8(CCK-8) 试剂盒、总一氧化氮检测试剂盒均购自碧云天公司；Millcell® Hanging Cell Culture Inserts迁移小室购自Merck-Millipore公司；其余试剂为国产分析纯。
1.5 RT-PCR用捻转血矛线虫第三期幼虫经口人工感染山羊35 d后剖杀，从其皱胃挑取并收集成虫。向装有虫体的离心管中加入TRIzol试剂，在冰上充分研磨后，按Inviotrgen TRIzol说明书的方法进行虫体总RNA的提取，然后用oligodT-18为引物进行反转录合成cDNA。
根据捻转血矛线虫NDUDC基因序列 (GenBank登录号：HF964261)，利用Primer 5.0软件设计引物，P1:5′-CGGAATTCATGGGTGTCATGGAGTTGCT-3′，P2:5′-AACTCGAGTTGCTGTTTCTTCTGTCCCG-3′，酶切位点分别是EcoRⅠ和XhoⅠ(如下划线所示)，引物由苏州金唯智生物公司合成。
以cDNA为模板，P1和P2为引物进行PCR扩增。PCR总体系50 μL：10×PCR缓冲液5 μL，LA Taq DNA聚合酶0.5 μL，MgCl2 5 μL，dNTP 8 μL，cDNA模板4 μL引物P1和引物P2各2 μL，双蒸水23.5 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环，72 ℃再延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
1.6 NDUDC基因的克隆表达 1.6.1 NDUDC基因的克隆扩大PCR反应体系至200 μL，使用OMEGA公司的Gel extraction kit回收PCR产物，与克隆载体pMD-19T连接，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，12 h后随机挑取单克隆，提取质粒，用EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切鉴定，阳性克隆送至苏州金唯智生物公司测序，将测序正确的阳性质粒命名为pMD-19T-NDUDC，并应用软件对序列进行分析。
1.6.2 原核表达载体的构建和重组蛋白质的获得用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切重组质粒pMD-19T-NDUDC和表达载体pET-32a (+)，然后分别回收目的基因片段和载体片段，用T4连接酶过夜连接，将连接产物转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中，随机挑取单菌落，提取质粒用EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切鉴定，阳性质粒命名为pET-32a-NDUDC。阳性克隆接种于含氨苄抗生素 (终质量浓度为50 μg·mL-1) 的LB液体培养基中，37 ℃振荡培养过夜，次日按1:100的比例接种于新的LB培养基中，37 ℃振荡培养至菌液A600 nm值达0.4~0.6，加入IPTG至终浓度为1 mmol·L-1，继续培养6 h，离心收集菌体沉淀，超声破碎，将上清和包涵体进行SDS-PAGE，确定重组蛋白质的分布情况。
1.6.3 重组蛋白质的纯化参照说明书使用His蛋白纯化柱对重组蛋白质进行纯化，经SDS-PAGE检测后，将纯化好的重组蛋白质放入含梯度浓度尿素 (0、2、4、6 mol·L-1) 的复性缓冲液中透析复性，PEG20000浓缩后，测定浓度，过滤除菌分装-70 ℃冻存。
1.6.4 重组蛋白质抗血清的制备选用两只雌性标重大鼠，制备重组蛋白质抗血清：首次免疫取300 μg重组蛋白质与等体积的弗氏完全佐剂乳化，背部皮下多点注射；两周后取等量重组蛋白质与等体积的弗氏不完全佐剂乳化免疫大鼠；三免和四免方法与二免相同，均间隔一周；四免一周后大鼠眼眶采血，分离血清，-20 ℃保存备用。
1.7 重组蛋白质的功能分析 1.7.1 重组蛋白质的反应原性分析以感染捻转血矛线虫的山羊血清作为一抗，未感染山羊的血清作为阴性对照，进行Western blot分析。取适量重组蛋白质进行SDS-PAGE，电泳结束后，将凝胶上的蛋白质转印到硝酸纤维膜，5%脱脂奶粉4 ℃封闭过夜，将膜浸没在一抗 (按1:100稀释) 中37 ℃孵育1 h，TBST清洗3次，每次5 min，将膜浸没在兔抗山羊IgG-HRP (第二抗体，1:5 000稀释) 中37 ℃作用1 h，TBST清洗5次，每次5 min，加入DAB显色，拍照。
1.7.2 重组蛋白质对单个核细胞免疫功能影响的分析 1.7.2.1 山羊外周血单个核细胞的分离与培养无菌采集山羊颈静脉抗凝血，用等体积PBS稀释后平铺在淋巴细胞分离液上，水平转子600×g (半径15 cm) 离心20 min后收集环状乳白色淋巴细胞层，用PBS缓冲液清洗两遍后，台盼蓝染色检测细胞活力，确定细胞活力均在95%以上，将细胞重悬于含10%灭活胎牛血清、1%双抗的1640培养液中，调整细胞浓度至1×106·mL-1，用于试验。
1.7.2.2 重组蛋白质与单个核细胞的结合试验取12孔细胞培养板，每个孔加入PBMCs悬液1 mL，再分别加入重组蛋白质 (终质量浓度为10 μg·mL-1)、空载体蛋白质以及相同体积的PBS对照液，37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养1 h后，PBS洗涤细胞3次，最后用400 μL PBS重悬细胞，滴加到防脱载玻片上，室温放置15 min，用4%多聚甲醛 (PBS配制) 室温固定30 min，PBS洗涤3次，每次5 min，用含2%BSA、0.5%Tween-20(PBS配制) 封闭液37 ℃封闭30 min，移除封闭液，滴加含有大鼠抗血清的封闭液 (1:100稀释)4 ℃孵育过夜，PBS洗涤3次，滴加Cy3-山羊抗大鼠IgG (1:500稀释)，37 ℃避光孵育1 h，PBS洗涤3次后用DAPI室温复染5 min，PBS洗涤3次，滴加抗淬灭剂，树脂封片，激光共聚焦显微镜观察拍照。
1.7.2.3 重组蛋白质对PBMCs增殖的影响取96孔板，每孔接种细胞悬液100 μL，再向每孔中加入10 μg·mL-1的ConA和不同质量浓度的rNDUDC (10、20、40 μg·mL-1)，同时设空载体对照和空白对照，37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养48 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培养箱内避光孵育4 h，反应结束后用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。按照公式“细胞增殖指数=试验组OD450 nm/对照组OD450 nm”计算增殖指数。
1.7.2.4 重组蛋白质对PBMCs细胞迁移的影响取24孔板，每孔接种细胞1 mL并加入相应浓度的重组蛋白质，同时设置空载体对照和空白对照，放入细胞培养箱培养24 h，计数细胞；将迁移小室嵌入24孔板细胞培养板，在迁移小室的下室加入500 μL含10%灭活胎牛血清的1640培养基，上室加入200 μL经过计数的细胞混合物，然后置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱培养，2 h后取出收集迁移至下室中的细胞，进行计数，计算迁移细胞占总上样细胞的百分比。
1.7.2.5 重组蛋白质对PBMCs分泌一氧化氮的影响取24孔板，每孔加入细胞悬液1 mL以及相应浓度的重组蛋白质，并设置空载体对照和空白对照，细胞培养箱培养24 h后，离心取细胞上清，按照碧云天总NO检测说明书进行测定。
2 结果 2.1 捻转血矛线虫NDUDC基因的克隆RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳可见438 bp处有一条特异性条带 (图 1A)，回收纯化PCR产物，与载体pMD-19T连接，重组质粒经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后，得到大小约为438 bp的目的片段和2 800 bp左右的载体片段 (图 1B)
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A.RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳；B.重组质粒pMD-19T-NDUDC双酶切鉴定；M. DL2000 DNA相对分子质量标准；1.RT-PCR扩增产物；2.重组质粒经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切 A. Agarose gel electrophoresis of NDUDC RT-PCR products; B. Identification of recombinant plasmid pMD-19T-NDUDC by restriction enzyme digestion; M. DL2000 DNA marker; 1. Products of RT-PCR; 2. Recombinant plasmid digested by double enzymes 图 1 NDUDC基因的克隆及鉴定 Figure 1 Cloning and identification of NDUDC gene |
用DNAMAN对NDUDC的ORF序列进行分析，全长438 bp，共编码145个氨基酸 (见图 2)，相对分子质量1.73×103，理论等电点9.20。将氨基酸序列通过NCBI的blastp以及Conserved Domain Serch进行在线分析，发现捻转血矛线虫NADH:泛醌氧化还原酶结构域包含蛋白与Ancylostoma ceylanicum(EPB69473.1)、Ascaris suum(ERG86986.1) 的NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex subunit 12(NDUFA12) 具有较高相似性，分别是85%、74%，说明该蛋白质所含结构域较保守且属于NDUFA12家族。NDUFA12是NADH:泛醌氧化还原酶复合体中一个17.2 ku左右的亚基，功能尚不清楚。
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方框内为NDUFA12保守结构域序列 The sequences in the boxes are conserved domain of NDUFA12 图 2 捻转血矛线虫NDUDC基因及其编码的氨基酸序列 Figure 2 The sequences of Haemonchus contortus NDUDC gene and coded amino acids |
重组表达质粒pET-32a-NDUDC经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，结果显示有一条5 900 bp左右的载体片段和一条大约438 bp的目的片段，与预期结果一致 (图 3)。
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M. DL2000 DNA相对分子质量标准；1.重组质粒经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切 M. DL2000 DNA marker; 1. Recombinant plasmid digested by EcoRⅠand XhoⅠ 图 3 重组表达质粒pET-32a-NDUDC的鉴定 Figure 3 Identification of recombinant expression plasmid pET-32a-NDUDC |
SDS-PAGE结果显示重组蛋白质抗原性产物大小约为34 ku左右，表达量随着时间的延长不断增长，并在IPTG诱导6 h时达到最大 (图 4A)。将诱导表达后的菌体超声破碎，对上清和包涵体进行SDS-PAGE，结果显示重组蛋白质抗原性以包涵体的形式表达 (图 4B)。利用His蛋白纯化柱对重组蛋白质进行纯化，SDS-PAGE表明重组蛋白质纯化效果较好 (图 4C)。
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A.重组蛋白质的时相表达；B.重组蛋白质的分布情况；C.重组蛋白质的纯化；M.蛋白质相对分子质量标准；1~7.重组蛋白质诱导表达1~6 h的细菌裂解产物；8.表达产物上清；9.表达产物包涵体；10.纯化后的重组蛋白质 A. Expression of recombinant protein in BL21 induced by IPTG in different time; B. Distribution of recombinant protein; C. Purification of recombinant protein; M. Protein molecular weight marker; 1-7. Recombinant protein induced by IPTG for 1-6 hours; 8. Supernatant of expression products; 9. Precipitate of expression products; 10.Purified recombinant protein 图 4 重组蛋白质NDUDC的表达与纯化 Figure 4 Expression and purification of recombinant protein NDUDC |
以感染山羊血清作为第一抗体，未感染山羊血清作为阴性对照，兔抗山羊IgG-HRP作为第二抗体对重组蛋白质进行Western blot分析，结果显示在34 ku左右有一条特异性条带，而阴性对照没有条带出现 (图 5)，说明NDUDC蛋白具有良好的反应原性，能被宿主免疫系统识别。
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M.蛋白质相对分子质量标准；1.重组蛋白质与感染山羊血清的Western blot分析；2.阴性对照 M. Protein molecular weight marker; 1.Recombinant protein recognized by serum from infected goat as primary antibody; 2. Negative control 图 5 重组蛋白质的Western blot分析 Figure 5 Western blot analysis of recombinant protein |
如图 6所示，试验组细胞周围可见一圈红色的荧光，而对照组没有观察到红色荧光，说明重组蛋白质能够与单个核细胞表面结合 (图 6)。
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山羊PBMCs与rNDUDC (10 μg·mL-1) 共孵育1 h，加入大鼠抗重组蛋白血清后用Cy3标记的羊抗大鼠IgG (红色) 进行染色，细胞核用DAPI (蓝色) 复染，用激光共聚焦显微镜进行观察和拍照。Merge为红色和蓝色荧光通道叠加 Goat PBMCs were left untreated or treated with recombinant protein (10 μg·mL-1) for 1h at 37 ℃. All cells were fixed and incubated with rat anti-recombinant proteins antibody followed by Cy3 labeled goat anti-rat IgG (red). The nuclei of the corresponding cells were visualized by DAPI (blue) staining. The binding of recombinant proteins to cells was visualized with a confocal laser scanning microscopy. Merge: overlap of red and blue channels 图 6 重组蛋白质与PBMCs的结合 Figure 6 Binding of rNDUDC to PBMCs |
试验证明，rNDUDC能够有效促进外周血单个核细胞的增殖活性，并且随着蛋白质质量浓度的增加，细胞增殖能力逐渐提高，如图 7所示。
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**表示与对照组 (0 μg·mL-1) 相比，差异显著 (P < 0.01)；***表示与对照组 (0 μg·mL-1) 相比，差异极显著 (P < 0.001)，下表同 **means significance difference versus the control (0 μg·mL-1) group (P < 0.01); ***means highly significance difference versus the control (0 μg·mL-1) group (P < 0.001), The same as below 图 7 重组蛋白质对细胞增殖的影响 Figure 7 Effects of rNDUDC on the proliferation of PBMCs |
结果显示，三种质量浓度的rNDUDC均能显著提高细胞的迁移能力，与对照组 (0 μg·mL-1) 相比，试验组的迁移率都具有显著差异。如图 8所示。
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图 8 重组蛋白质对细胞迁移的影响 Figure 8 Effects of rNDUDC on the migration of PBMCs |
图 9所示，与对照组相比，不同质量浓度的rNDUDC刺激细胞能够促进NO的分泌，且呈剂量依赖性。
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图 9 重组蛋白质对细胞NO分泌的影响 Figure 9 Effects of rNDUDC on the NO secretion of PBMCs |
目前，对捻转血矛线虫病的防治主要依赖药物，但随着化学药物的大量使用，耐药虫株的不断出现给疾病防治带来困难[8]，因此采用疫苗手段防治捻转血矛线虫病受到大家的关注。寻找具有免疫保护效果的虫体特异性抗原是研制寄生虫疫苗的重要方法[9]，研究表明，捻转血矛线虫排泄分泌抗原可与宿主免疫细胞发生广泛的作用[4]，具有较强免疫原性[10]，因此对这些蛋白质的研究有助于深入了解虫体与宿主免疫系统的作用机制，对筛选出抗捻转血矛线虫疫苗候选分子具有重要意义。
笔者选取捻转血矛线虫NADH:泛醌氧化还原酶结构域包含蛋白质的基因进行克隆表达，对其序列分析发现含有NDUFA12家族的保守结构域，目前该结构域的研究资料比较少，功能尚不清楚。之后得到纯化的重组蛋白质NDUDC，一方面通过Western blot分析其抗原反应原性，结果显示，NDUDC蛋白具有良好的反应原性；另一方面，重组蛋白质与PBMCs的体外结合试验对蛋白质与单个核细胞的结合进行了验证，蛋白质与细胞的结合有助于对细胞功能的调节[11]，但本试验未给出重组蛋白质所结合细胞的种类以及相应的细胞受体，这需要进一步的研究。
虽然本试验中去除标签蛋白质后的重组蛋白质偏小，但抗原大小不是影响机体免疫应答的唯一因素[12]，而且包涵体蛋白质通过梯度浓度的尿素溶液重折叠能够恢复复杂的空间构象，此外在免疫过程中可以加入佐剂以增强免疫效果，所以NDUDC蛋白作为抗原免疫接种实验动物的免疫效果不会受太大影响。
山羊外周血单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，是免疫系统的重要组成部分，通过对经重组蛋白质刺激的PBMCs部分免疫指标的测定，可以了解该重组蛋白质对PBMCs免疫功能的影响，从而明确重组蛋白质与宿主免疫系统的作用关系，为寻找具有高效免疫保护作用的抗原奠定基础。笔者主要从细胞增殖、细胞迁移以及NO分泌三个方面研究了rNDUDC对免疫细胞功能的影响，结果显示，重组蛋白质能够刺激细胞增殖，显著提高细胞迁移能力以及增加NO的分泌。当受到病原刺激时，细胞的大量增殖以及向感染部位发生迁移是PBMCs参与免疫防御的基本表现[13]，另外大量研究表明由巨噬细胞及白细胞产生的NO在抗寄生虫感染中发挥一定作用[14]，说明该重组蛋白质与宿主免疫细胞发生作用主要是刺激细胞活化、增殖、分化，发挥免疫功能，清除外来抗原，表明rNDUDC具有很强的抗原性，对促进免疫细胞功能具有重要作用。
本实验室一直致力于寻找能够有效防治捻转血矛线虫的疫苗候选分子，对虫体谷胱甘肽过氧化物酶重组蛋白质体外对山羊PBMCs细胞功能影响进行研究后发现可以有效提高外周血单个核细胞的多种免疫功能[15]，而免疫保护试验也表明其对山羊捻转血矛线虫具有部分保护作用[16]，这从侧面说明重组蛋白质对PBMCs细胞功能影响的研究有助于寻找具有免疫保护效果的抗原；另外有资料显示NADH:泛醌氧化还原酶复合体是治疗虫体感染一个具有前景的靶标[17]，结合本试验结果，我们有理由认为NDUDC蛋白在防治捻转血矛线虫感染方面可能会成为有力的疫苗候选抗原，值得继续深入研究。
4 结论成功克隆表达捻转血矛线虫NADH:泛醌氧化还原酶结构域包含蛋白 (NDUDC)。重组NDUDC能够与山羊外周血单个核细胞 (PBMCs) 表面结合，有效刺激细胞增殖，显著提高细胞迁移能力，并促进NO的分泌。NDUDC蛋白具有较强的抗原性，可刺激细胞发挥免疫功能。
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