我国是世界上的养兔大国之一，目前我国家兔饲养量已达7亿多只，占世界上饲养量的40%以上[1]。家兔的饲养主要集中在山东、四川、重庆、河北、江苏、浙江、河南、安徽、山西、黑龙江、福建等省区[2]，这些地区跨越不同的气候类型，且中间有许多山川和河流阻挡。这些地区所饲养的兔品种较多，根据经济类型可分为肉兔、獭兔、毛兔、毛肉兼用兔以及皮肉兼用兔。兔痒螨病是我国养兔业中常见的外寄生虫病之一，兔的感染率可高达70.0%[3]，该螨病可造成兔体重减轻、饲料转化率降低、免疫功能低下等，严重的甚至死亡，给养兔业造成巨大的经济损失[4-5]。
近年来，随着分子生物学的迅速发展，核糖体和线粒体基因常作为分子标记，被应用于各物种的系统发育和种类鉴定研究。核糖体DNA因有高度保守性的特点，很难区分同种异株[6]，而线粒体DNA具有母系遗传，进化速度快，相对于核糖体基因有较高的突变率的特点，常用于分析亲缘关系较近的种、亚种及地理种群间的系统关系[7-8]。目前，已报道用于痒螨种类鉴定的基因有ITS-2、18S和COI基因，认为源自不同地区或同一地区兔和羊的痒螨虫株属于同一虫种[9-11]，而我国四川地区兔和水牛来源的痒螨虫株属于不同种[12-13]。痒螨可寄生于多种宿主体上，且分布广泛[14-15]，目前尚未见不同宿主和不同地理来源兔痒螨虫株的遗传变异研究。据研究发现，寄生虫和宿主在漫长的进化过程中，面对外界环境的变化或隔离，使一个分布相对较广的原始物种破裂，可能形成两个姊妹种[16]。因此，本研究将对采自我国温带和亚热带的6个省份共68株獭兔来源 (陕西、河北、河南和湖北) 和肉兔来源 (山东和四川) 的痒螨虫株的线粒体cytb基因全序列进行扩增，探讨我国不同兔品种、不同温度带和不同地域来源的兔痒螨之间的遗传变异程度，以期待获得我国兔痒螨遗传多样性和遗传结构资料。
1 材料与方法 1.1 兔痒螨的采集从我国6个省10个地区采集兔痒螨虫株68个，具体采集地点和样本数如下：四川省31个 (成都11个、雅安3个、资阳7个、眉山3个、西昌7个)、陕西省宝鸡市8个、湖北省荆州市9个、河南省开封市5个、河北省保定市8个和山东省济南市7个。虫体均采自临床上自然感染痒螨病的肉兔或獭兔 (表 1)。采样点的6个省属于温带和亚热带气候，且采集点之间的地理距离340~1 760 km。收集的痒螨经形态学鉴定后[17]，置于70%的酒精中，存于－20 ℃待用。
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表 1 兔痒螨样品采集情况和遗传多样性指数 Table 1 Samples collection and genetic diversity indexes of Psoroptes cuniculi |
采用OMEGA公司的节肢动物DNA提取试剂盒 (DNA Mollusc Kit) 提取单个螨虫的基因组DNA。据兔痒螨线粒体基因组序列 (GenBank No.:KJ957822)[18]设计扩增cytb全序列的特异性引物 (P1：5′-TACCCAAGATGACGAGGAAATTG-3′；P2：5′-AAGTCACTTTCTTGTCCACAGT-3′)。PCR扩增体系为25 μL：包括模板DNA 4 μL，上、下引物 (20 pmol) 各1 μL，2× Taq PCR Master Mix 12.5 μL和灭菌双蒸水6.5 μL。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；最后72 ℃ 10 min。同时以灭菌双蒸水代替DNA模板作为空白对照。反应结束后扩增产物经1%的琼脂凝胶电泳检测，随后将阳性PCR产物送至生工生物工程 (上海) 股份有限公司进行正反双向测序，以保证测序结果的准确性。
1.3 数据的处理与分析测序结果根据峰图进行人工校对，利用BLASTn和DNAMAN 6.0.3软件对序列进行比对、拼接、剪切，生成对应的cytb全序列文件。将这些序列输入到MEGA 5.0软件后运行Clustal W程序比对核苷酸序列[19-20]，分析碱基组成和种群间遗传距离；采用DnaSP 5.10软件[21]对变异位点数、单倍型数、核苷酸多样性 (π) 和单倍型多样性 (Hd) 进行统计，并计算错配分布以及基因流Nm=1/4(1/Fst-1)；采用Arlequin 3.5软件[22]对种群间的遗传差异 (Fst) 和分子变异 (AMOVA) 进行分析以了解我国兔痒螨的遗传结构，并对各种群进行中性检验 (Tajima’s D和Fu’s Fs) 分析；以屋尘螨 (Dermatophagoides pteronyssinus) 的cytb基因 (GenBank No.GQ469891.1) 为外群，采用NJ法构建系统发育树，并用bootstraps (重复1 000次) 检验聚类树的置信度；Network 5.0软件[23]构建单倍型网络图。
2 结果 2.1 cytb基因的序列组成及单倍型分布成功获得68个兔痒螨虫株的cytb基因全序列 (登录号：KY242513~KY242580)，经剪切和比对后获得长度均为1 100 bp的同源序列。68条序列的平均A、T、C、G碱基的含量分别为34.0%、31.3%、13.8%和20.9%。A+T含量占65.3%，有明显的AT偏倚性。68个序列有96个变异位点 (8.7%)，包括32个简约性信息位点和64个单变异位点，无碱基的缺失和插入；68个序列共检测出46个单倍型 (H1~H46)，其中H3、H9、H13、H19和H22为共享单倍型，其余均为各群体所特有的单倍型。
2.2 遗传多样性和种群动态分析从表 1可见，6个地理种群的单倍型多样性 (Hd) 和核苷酸多样性 (π) 分别为0.892 9~1.000 0和0.001 5~0.013 9，我国整体种群的Hd和π分别为0.959 2和0.012 0，表明我国兔痒螨具有较为丰富的单倍型和较高的核苷酸多样性。中性检验值分析显示 (表 1)，从单个地理种群看，河北、山东、陕西和四川种群的Tajima’s D和Fu’s Fs值为一正一负，只有河南和湖北种群的这两个值都为负，表明河南和湖北种群可能发生过突增长事件；从整体种群来看，其中性检验结果为负值 (Tajima’s D=－0.444 01，Fu’s Fs=－1.454 25)，且错配分布曲线显示为多峰现象 (图 1)，表明我国兔痒螨可能因为湖北和河南种群的突增长而导致我国整体兔痒螨也经历了较弱的突增长过程。
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图 1 基于cytb基因分析我国68株兔痒螨虫株的错配分布曲线 Figure 1 The mismatch-distribution of 68 Psoroptes cuniculi isolates, basing on cytb gene |
从表 2可见，我国兔痒螨的遗传距离范围值为0.000~0.011，其中山东与湖北的遗传距离最大 (0.011)；采样的6个省间地理距离为340~1 760 km，以四川和河北的地理距离最大 (1 760 km)，可见种群间的遗传距离大小与地理距离的远近无关；根据分子变异分析 (AMOVA)(表 3)，种群内和种群间的遗传变异分别为82.51%和17.49%，这表明兔痒螨的遗传变异主要发生在种群内部。此外，我国各种群间的基因流 (Nm) 为0.164 3至无限大，遗传分化指数 (Fst) 值为－0.020 1~0.603 5(表 4)，从各种群之间看，以河北与四川和陕西、四川与陕西的基因流趋于无限大，表明它们之间的基因交流较为频繁，遗传分化不明显；我国整体兔痒螨种群的Nm和Fst分别为0.7和0.262 2，表明我国兔痒螨基因流水平较低，存在一定的遗传分化。
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表 2 我国兔痒螨各地理种群间的地理距离 (上三角) 和遗传距离 (下三角) Table 2 Pairwise comparisons of the geographical distances (km) (above diagonal) and genetic distance (below diagonal) between geographical populations of Psoroptes cuniculi |
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表 3 我国兔痒螨种群cytb序列变异及方差分析 Table 3 Analysis of molecular variance (AMOVA) of Psoroptes cuniculi basing on cytb gene |
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表 4 不同兔痒螨种群间的基因流 (Nm)(上三角) 和遗传分化指数 (Fst)(下三角) Table 4 Gene flow (Nm) (above diagonal) and population pairwise fixation index (Fst) values (below diagonal) values among different Psoroptes cuniculi populations |
NJ树显示 (图 2)，68个兔痒螨虫株聚为A和B 2个明显的大支，但并未按兔品种、温度带和地域来源的不同分为几个明显聚类，而呈现为混杂的分布格局，表明我国兔痒螨各种群间未形成按兔品种、温度带和地域来源划分的种群结构。单倍型网络图呈星状分布，且各单倍型的聚类情况与NJ树类似，并未按兔品种、温度带和地域来源进行聚类 (未显示)。
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HN.河南；SC.四川；HE.河北；SD.山东；HB.湖北；SX.陕西 HN. Henan; SC. Sichuan; HE. Hebei; SD. Shandong; HB. Hubei; SX. Shaanxi 图 2 基于cytb基因的68株兔痒螨样本构建的NJ树 Figure 2 Neighbor-Joining (NJ) tree constructed for 68 Psoroptes cuniculi isolates, basing on cytb gene |
本研究首次从单个兔痒螨中成功扩增出了线粒体cytb基因全序列，克服了用大量螨虫提取DNA进行遗传变异分析的不准确性[18, 24]。寄生虫种群遗传结构受地理环境和宿主等因素的影响[25]，因此，本研究第一次从我国四川、陕西、河北、河南、湖南和山东等6个跨越不同温度带，且地理距离从相距340 km到1 760 km的地区，采集了来源于獭兔和肉兔身上的兔痒螨来研究其遗传变异情况，这些地方跨越我国最重要的南北分界线——秦岭-淮河，并且有黄河等河流的阻断，地形复杂多样，这些自然屏障在物种形成的地理隔离中起到了重要作用，从客观上构成了我国兔痒螨种群之间的基因交流屏障。
研究一个种群内的遗传变异有利于推断现有物种的起源和进化历史，而遗传变异的程度主要表现为遗传多样性的水平，因此一个种群的遗传多样性越高，则该种群的进化潜力和恢复能力就越大[26]。本研究中的68个兔痒螨分离株共有46个单倍型，各种群的单倍型多样性高达0.892 9到1.000 0，表明我国具有较为丰富的兔痒螨单倍型多样性水平；并且核苷酸多样性在0.001 5到0.013 9之间，表现出较高的核苷酸多样性水平。这种高的核苷酸多样性和单倍型多样性现象可能是因为我国兔痒螨采样地所分布的多样性环境、加之进化历史太长、从而增加了遗传变异在系谱内的积累而形成的[27]。再者，由于我国各地气候差异较大，加之兔品种繁多，导致兔痒螨为适应其寄生环境而发生了遗传变异[28]；此外，中性检验 (Tajima’s D和Fu’s Fs) 结果和错配分布曲线证明我国兔痒螨群体在历史上可能出现过较弱的突增长，加之表现出较大的核苷酸多样性和单倍型多样性，表明在发生突增长后经历了一个较长的进化史以达到遗传变异在系谱内的积累。
判断遗传分化程度最重要的两个指标就是遗传分化指数 (Fst) 和基因流 (Nm)[29]。从各种群看，本研究中河北与四川、河北与陕西、四川与陕西的Fst绝对值 < 0.05，具有较小的分化程度[30]，表明我国四川、河北和陕西3地之间兔痒螨的遗传分化不明显；Nm也可看出河北与四川、河北与陕西、四川与陕西的基因流绝对值趋于无穷大，证明这3地间的种群基因交流较频繁。地理分布是影响许多只具有微小迁移能力螨类遗传结构的主要因素[31-32]，本研究中四川、河北和陕西3地之间的地理距离在700~1 760 km，但遗传距离为0.000；而兔痒螨个体较小，脱离宿主存活时间有限，且自身移动速度较慢，但四川、河北和陕西3地间兔痒螨的基因交流较为频繁、遗传分化不明显，可见这种频繁的基因交流不可能是由兔痒螨自身运动而完成，更大的可能性是由于这3地之间频繁的兔贸易导致了各地兔痒螨间的基因交流而形成[28]。从我国整体种群看，Nm和Fst分别为0.7和0.262 2，表明我国兔痒螨基因流水平较低，存在一定的遗传分化，结合AMOVA分析的结果，也显示出变异主要发生在种群内部 (82.51%)，表明我国不同兔品种、温度带和地域来源的兔痒螨间存在着一定的遗传分化。
本研究构建的系统发育树 (NJ树) 显示：我国兔痒螨聚类并未按兔品种、温度带或地域来源的不同分为几个明显聚类，而是呈现为混杂的分布格局。通过我国兔痒螨的聚类情况，并结合遗传多样性和遗传结构看，可推测我国不同来源的兔痒螨种群间的基因渗入可能主要来源于对宿主的人为迁移，并且为验证寄生虫可能为适应其寄生环境而发生了遗传变异这一事实提供依据。
4 结论本研究首次对我国不同兔品种、温度带和地理来源的兔痒螨进行遗传变异分析。发现我国兔痒螨具有较高的遗传多样性，且有一定的遗传分化，但未形成以兔品种、温度带和地域来源划分的种群遗传结构。
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