猪的生长性能和肉质性状都是十分重要的经济指标,近几十年来,通过遗传育种、营养水平的改进和饲养环境的改善,猪的生长性能得到了显著提高,但随之出现的肉质下降却引起了消费者的普遍不满。研究表明,通过营养调控手段可以改善肉质[1]。低蛋白氨基酸平衡日粮是指将日粮的粗蛋白水平在NRC的标准上降低2~4个百分点,并补充合成氨基酸以满足动物对于蛋白质和氨基酸的需要,从而达到维持动物生长性能不发生改变的日粮[2]。以往的研究主要集中在单纯降低蛋白水平或添加个别必需氨基酸对肉质的影响,有报道指出,低蛋白水平日粮不添加合成氨基酸会增加生长猪肌内脂肪含量,改善嫩度,但是显著降低了日增重,增加了料重比[3]。N. Tous等[4]研究发现,降低日粮蛋白水平,同时补充赖氨酸可以增加育肥猪肌内脂肪含量且不影响生产性能。然而,在低蛋白日粮中添加合成氨基酸以满足猪对赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸8种必需氨基酸营养需要的报道较少,是否能更好的改善肉品质还有待研究。
半胱胺 (Cysteamine, CS) 是动物体内重要的生物活性物质,主要是通过抑制生长抑素的活性,进而影响生长激素的释放来调控动物生长[5],并且半胱胺的促生长作用与动物的生长发育阶段有关[6]。研究表明,添加CS显著增加了育肥猪平均日增重和瘦肉率,降低了料重比,提高了生产性能[5, 7]。然而半胱胺的添加能否对肉质产生影响,目前报道尚不相一致。因此,本试验旨在研究低蛋白氨基酸平衡日粮添加半胱胺对生长猪肉质的影响,为在猪生产上合理配置日粮提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料半胱胺盐酸盐 (含量30%) 购自上海华扩达生化科技有限公司;赖氨酸盐酸盐 (含量99%) 和蛋氨酸 (含量99%) 购自南京北星牧业有限公司;苏氨酸 (含量99%)、色氨酸 (含量99%)、亮氨酸 (含量99%)、异亮氨酸 (含量99%)、缬氨酸 (含量99%) 和苯丙氨酸 (含量99%) 均购自南京瑞泰生化技术有限公司。
1.2 试验设计试验采用2×2因子试验设计,选取120头初始体重为 (42.18±0.70) kg的阉公猪 (大×长×梅),随机分为4个处理,每个处理5个重复,每个重复6头猪,分别饲喂正常蛋白水平日粮 (NP)(CP=16%)、正常蛋白水平日粮+半胱胺 (NP+CS)、低蛋白水平日粮 (LP)(CP=12%)、低蛋白水平日粮+半胱胺 (LP+CS)。CS以半胱胺盐酸盐的形式添加,添加量为100 mg·kg-1(纯计)。
基础日粮采用净能体系,参考美国NRC (2012)[8]猪营养标准进行设计且满足等能原则,添加合成氨基酸以满足日粮8种必需氨基酸的标准回肠可消化氨基酸水平[9]。基础日粮的饲料配方及营养成分见表 1。
试验在江苏省农科院六合动物科学基地养猪场进行,饲养期为31 d。猪舍内为水泥地面,舍内温度维持在16~30 ℃,每天打扫猪舍两次,通风良好,试验期间采用常规免疫。每天06:30、12:30和18:30各喂料一次,自由采食和饮水。
饲养试验结束后,每个重复随机挑选两头体重接近的猪运送到屠宰场,经过电击晕、放血、褪毛、标记、去内脏、劈半后,采集背最长肌组织样品用于肉品质的测定,另取10 g背最长肌样品于冻存管中,立即置于液氮中冻存,以备后续试验。
1.4 肉品指标的测定 1.4.1 pH测定测定屠宰后肌肉45 min和24 h的pH,使用便携式pH计 (HI 9125, Hanna, 意大利) 测定,每块肌肉在不同位置测定3次,计算平均值,记为pH45 min和pHu。
1.4.2 肉色测定在4 ℃条件下放置24 h后用色差仪 (CR-400, Minolta, 日本) 进行肉色测定,每块肌肉每个指标测定3次,分别记录肉样的亮度值 (L*)、红度值 (a*)、黄度值 (b*),计算平均值。
1.4.3 滴水损失测定在4 ℃条件下放置24 h后,参照B. S. Bidner等[10]的方法,称取30 g左右的肉样,悬挂在泡沫箱中,放入4 ℃冷库自然滴水24 h,称重,计算重量损失的百分率。
1.4.4 蒸煮损失和剪切力测定在4 ℃条件下放置72 h后进行蒸煮损失和剪切力测定。蒸煮损失参照H. C. Bertram等[11]的方法,取20 g左右的肉样,密封于塑料袋中,置于恒温水浴锅至肉的中心温度为70 ℃,冷却至室温,称重,计算重量损失的百分率。剪切力参照刘洋等[12]的方法,沿肌纤维垂直方向切取肉样 (1 cm×1 cm×2 cm),用嫩度仪 (C-LM3A, 东北农业大学) 测定,每个样品每个性状测定3次,计算平均值。
1.4.5 肌内脂肪含量测定采用索氏抽提法测定肌内脂肪含量,每个样品测定3次,计算平均值,结果以肌肉湿重表示[13]。
1.5 质构的测定取背最长肌并去除外周的脂肪和结缔组织,用直径为1 cm的圆形取样器顺肌纤维方向取样,用质构剖面分析仪 (TMS-Pro, FTC, 美国) 测定样品的硬度、弹性、内聚性、胶黏性和咀嚼性。每个样品每个性状测定3次,结果取其平均值。
1.6 实时荧光定量PCR测定总RNA的提取:取50~100 mg肌肉样品,按照RNAiso Plus试剂盒说明书 (TaKaRa) 提取总RNA,利用核酸蛋白分析仪 (NANODROP-2000) 检测总RNA浓度和纯度,A260 nm/A280 nm为1.8~2.0。采用PrimeScript@ RT Master Mix Perfect Real Time试剂盒说明书进行操作 (TaKaRa),反应体系为20 μL:10 μL SYBR Primerx Ex Taq,0.4 μL上游引物 (10 μmol·L-1),0.4 μL下游引物 (10 μmol·L-1),0.4 μL ROX Reference Dye,2 μL cDNA以及6.8 μL的dH2O。扩增条件:95 ℃预变性30 s;95 ℃变性5 s,60 ℃退火延伸34 s,95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,40个循环;60 ℃检测荧光信号。每个样品做3个重复。每个样品目的基因的相对mRNA表达水平可以用以下公式计算:相对mRNA表达=2-ΔΔCt[14]。
扩增引物由上海生物工程公司合成,引物序列如表 2所示。
试验数据利用SPSS软件中的一般线性模型进行双因素方差分析。数据分析模型包括日粮蛋白水平和半胱胺添加水平以及二者之间的互作。当存在显著互作时,利用LSD多重比较法进行显著性检验。结果以“平均数±标准误”表示。P<0.05表示差异显著。所有指标以重复 (圈) 为单位进行统计 (n=5)。
2 结果 2.1 低蛋白氨基酸平衡日粮添加半胱胺对生长猪背最长肌肉品质的影响由表 3可知,低蛋白氨基酸平衡日粮显著降低了生长猪背最长肌的剪切力 (P<0.05),显著增加了肌内脂肪含量 (P<0.05)。对pH45 min、pHu、L*、a*、b*、滴水损失及蒸煮损失均无显著影响 (P>0.05)。而CS的添加对生长猪肉品质无显著影响 (P>0.05),且蛋白水平和添加CS之间不存在交互作用 (P>0.05)。
如表 4所示,不同日粮蛋白水平对生长猪背最长肌硬度、弹性、内聚性、胶黏性、咀嚼性均无显著影响 (P>0.05);CS的添加对生长猪背最长肌硬度、弹性、内聚性、胶黏性、咀嚼性均无显著影响 (P>0.05),且二者在生长猪背最长肌质构方面不存在交互作用 (P>0.05)。
如表 5所示,低蛋白氨基酸平衡日粮显著增加了生长猪背最长肌SREBP-1c、FAS、SCD的mRNA表达水平 (P<0.05),显著降低了HSL和CPT-1的mRNA表达水平 (P<0.05);CS的添加对生长猪背最长肌脂代谢基因的mRNA表达量无显著影响 (P>0.05),且两者在脂代谢相关基因的mRNA表达水平上无互作效应 (P>0.05)。
由表 6可知,低蛋白氨基酸平衡日粮显著提高了生长猪背最长肌μ-钙蛋白酶基因的mRNA表达水平 (P<0.05),显著降低了钙蛋白酶抑制蛋白基因的mRNA表达水平 (P<0.05);CS的添加显著降低了生长猪背最长肌钙蛋白酶抑制蛋白基因的mRNA表达水平 (P<0.05),两者在μ-钙蛋白酶基因和钙蛋白酶抑制蛋白基因的mRNA表达上不存在交互作用 (P>0.05)。
目前关于日粮蛋白水平对猪肉品质影响的研究报道结果不一致,有些研究认为日粮蛋白水平对肉pH、肉色、滴水损失均无显著影响[3, 10]。与此类似,在本研究中,低蛋白氨基酸平衡日粮对生长猪pH、肉色、滴水损失、蒸煮损失均无显著影响。然而也有些研究认为,随着日粮蛋白水平的降低,滴水损失、蒸煮损失均逐渐降低[15-16]。这可能与日粮蛋白水平及不同生长阶段有关。J. D. Wood等[17]将生长猪日粮蛋白水平从21%降低到18%发现,肌内脂肪的含量从1.7%显著增加到2.9%,而皮下脂肪的含量无显著变化,表明日粮蛋白水平影响脂肪的沉积与组织特异性有关。O. Doran等[18]指出,低蛋白水平日粮可以增加脂肪在肌肉中的沉积而不是皮下沉积,这与硬脂酰辅酶A脱氢酶在肌肉中特异性表达有关。本试验日粮蛋白水平从16%降低到12%,结果发现肌内脂肪的含量显著增加,这可能与日粮蛋白水平调控肌肉中相关基因的表达有关。而肌内脂肪含量和剪切力之间存在显著的相关性 (r=-0.86)[19-20],这与本试验中,生长猪饲喂低蛋白氨基酸平衡日粮显著降低了肌肉剪切力结果相一致。本研究还发现,半胱胺的添加对肉品质无显著影响,这可能与半胱胺的添加量有关。X. Z. Lv等[7]研究不同半胱胺添加量对育肥猪生产性能及肉品质的影响发现,与添加140 mg·kg-1半胱胺相比,添加70 mg·kg-1的半胱胺对滴水损失和pH均有改善的趋势,但两者对肉质影响均不显著。
肌内脂肪的主要成分是甘油三酯,肌内脂肪的沉积是由甘油三酯合成与降解的平衡来决定的。肌内脂肪沉积所需的脂肪酸大部分来自脂肪酸的从头合成,脂肪酸合成酶 (FAS) 是脂肪酸从头合成的限速酶,催化乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A转变成甘油三酯[21]。硬脂酰辅酶A脱氢酶 (SCD) 是单不饱和脂肪酸合成的限速酶,可以促进C16:0、C18:0生成C16:1、C18:1,C16:1、C18:1是肌内甘油三酯中含量最丰富的脂肪酸[22],SCD表达量的增加有助于甘油三酯在肌肉中的沉积[23]。有报道指出,降低日粮蛋白水平,C16:1和C18:1的含量显著升高,提示降低日粮蛋白水平有助于甘油三酯的生成[17]。固醇调节元件结合蛋白1c (SREBP-1c) 作为重要的转录因子,可以促进脂肪酸合成相关基因FAS、SCD的转录[24]。J. Wang等[25]研究不同生长阶段乌金猪的肌内脂肪代谢相关基因表达发现,在生长猪阶段,降低日粮蛋白水平显著升高FAS、SCD、SREBP-1c的mRNA表达水平。本研究发现,饲喂低蛋白氨基酸平衡日粮FAS、SCD、SREBP-1c的mRNA表达水平显著升高。当SREBP-1c被敲除后,小鼠进食后的脂肪生成明显减缓,在脂肪中,SREBP-1c的表达量受到胰岛素的紧密控制[26],SREBP-1c也能抑制胰岛素受体底物的表达,暗示其对胰岛素信号有负调控作用[27]。D. Deng等[28]指出,降低日粮蛋白水平的同时补充合成氨基酸会导致血液胰岛素含量降低。因此,低蛋白氨基酸平衡日粮可能是通过胰岛素水平来调控SREBP-1c的表达量,进而影响脂肪的合成,其具体机制有待进一步研究。此外,激素敏感脂酶 (HSL) 是脂肪水解过程的限速酶,在调控脂肪降解方面起着重要作用。脂肪组织中的甘油三酯在HSL的作用下分解生成游离脂肪酸、甘油和少量甘油二酯[29]。背最长肌中HSLmRNA表达与肌内脂肪含量存在显著负相关[30-31],即随着HSLmRNA表达水平的升高,肌内脂肪含量降低。肉碱脂酰转移酶1(CPT-1) 位于线粒体外膜上,是长链脂肪酸进入线粒体进行β-氧化的限速酶[32]。H. B. Zhang等[33]研究发现,随着早期断奶牦牛日粮蛋白水平的降低,背最长肌中HSL和CPT-1的mRNA表达水平显著降低。同样的,在本研究中,饲喂低蛋白氨基酸平衡日粮,生长猪背最长肌中HSL和CPT-1的mRNA表达水平显著降低,表明肌内脂肪的降解受到抑制。因此低蛋白氨基酸平衡日粮增加肌内脂肪含量可能是通过上调肌肉中脂质合成相关基因的表达,促进肌内脂肪的沉积,同时下调肌肉中脂质降解相关基因的表达,抑制了肌内脂肪的降解,从而有利于肌内脂肪的沉积。在本研究中,半胱胺的添加对生长猪肌内脂肪代谢相关基因的表达均无显著影响,前人研究表明半胱胺的添加显著降低了育肥猪背膘厚[5],即降低了皮下脂肪的含量,表明半胱胺可抑制体脂沉积,而对肌内脂肪则无显著影响,其机制还有待于进一步研究。
肌肉嫩度还与肌原纤维蛋白的水解有关[34]。在肌肉组织中,钙蛋白酶系统控制着肌原纤维蛋白的降解,是肌肉蛋白降解的限速步骤,在肉的嫩化中起着重要作用。μ-钙蛋白酶和钙蛋白酶抑制蛋白是宰后肌肉嫩化的主要参与者,肌肉嫩度与μ-钙蛋白酶基因的表达量相关。张勇等[35]研究发现,钙蛋白酶抑制蛋白基因的mRNA在猪骨骼肌中的表达水平随着日粮蛋白水平的升高而升高,μ-钙蛋白酶基因的mRNA在猪骨骼肌中的表达水平随着日粮蛋白质水平的升高而降低。R. Y. Tang等[36]研究发现,低蛋白水平日粮改善猪肉嫩度可能与μ-钙蛋白酶基因的高表达水平有关。与前人结果一致,本试验也发现,降低日粮蛋白水平,提高了μ-钙蛋白酶基因的mRNA表达水平,同时降低了钙蛋白酶抑制蛋白基因的mRNA表达水平,有助于肌肉嫩度的改善。此外,我们还发现,半胱胺的添加下调了钙蛋白酶抑制蛋白基因的mRNA的表达量,这可能是因为由于半胱胺的添加促进了生长激素的释放,有报道指出,通过生长激素的处理,猪背最长肌钙蛋白酶抑制蛋白基因的mRNA的表达水平下降[37]。
4 结论本试验结果表明,低蛋白氨基酸平衡日粮,可能通过上调SREBP-1c、FAS、SCD、μ-钙蛋白酶基因的mRNA表达量,下调HSL、CPT-1、钙蛋白酶抑制蛋白基因的mRNA表达量,进而增加生长猪背最长肌肌内脂肪含量,降低肌肉剪切力,改善肌肉嫩度。半胱胺的添加,下调了钙蛋白酶抑制蛋白基因的mRNA表达量,但对猪肉品质无显著影响。日粮蛋白水平和半胱胺对生长猪肉质方面的影响不存在交互作用。
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