哺乳动物受精是一个极其复杂的、有序的生理过程，包括精子依次穿透卵丘细胞层和卵子透明带，随后与卵子质膜融合并最终完成受精^[1-5]。成熟的卵母细胞是以卵子-卵丘细胞复合体 (Oocyte-cumulus complex, OCC) 形式被排出。卵丘细胞对于卵母细胞正常发育和成功受精具有非常重要的作用^[6]。体外受精时某些物种去除卵丘细胞会导致受精率显著降低^[1]。而Adam3敲除 (Adam3 KO) 小鼠的体外研究也表明，精子不能结合到无卵丘细胞的裸卵透明带而导致受精失败^[7]。A.N.Fatehi等^[8]和R.Li等^[9]研究发现，卵丘细胞不仅能够增加卵母细胞的体外受精率，还有助于防止多精受精，提高胚胎后续发育能力。因此，卵丘细胞的存在对于受精至关重要。

排卵前，在促排卵素LH作用下卵丘细胞间形成大量细胞外基质，主要包括透明质酸^[10-11]及其各种结合蛋白, 如TSG6^[12]、HAS2^[13]等，这些成分的显著增加使OCC迅速膨胀，从而引发排卵反应^[14]。自然受精过程中，精子首先必须要侵入并穿透卵丘细胞层。长期以来，人们一直认为具有透明质酸分解活性的透明质酸酶是受精所必须的。在小鼠精子中，已经鉴定出至少3种透明质酸酶SPAM1(也称PH-20)^[15]、HYAL2^[16]和HYAL5^[17]，它们均通过糖基磷脂酰肌醇 (Glycosylphosphatidylinositol, GPI) 锚定在精子顶体膜上，且均具有能够分解透明质酸的酶活性^[15-19]。PH-20/SPAM1被透明质酸酶抑制剂或抗氨基端活性部位的抗体封闭后，小鼠精子无法穿透卵丘细胞层到达卵子透明带^[20-21]；而在猪上，添加抗-SPAM1多克隆抗体也能够抑制受精过程中的精/卵相互作用^[22]。但基因敲除研究表明，Spam1敲除 (Spam1 KO)^[18-19]和Hyal5敲除 (Hyal5 KO)^[19]小鼠精子均能够穿透卵丘细胞层并使卵母细胞受精，揭示这两种透明质酸酶均非受精所必需。其中，Spam1 KO小鼠表现为精子穿透和分散卵丘细胞能力下降、受精延迟，并有大量精子蓄积在卵丘细胞层表面或外部边缘^{[18-19, 23]}。揭示SPAM1在精子穿透卵丘细胞层过程中具有更为重要的功能，但具体机制尚不清楚。因此，本研究通过对Spam1 KO小鼠精子在IVF早期阶段的精卵互作进行观察，以初步探讨透明质酸酶SPAM1在精子侵入和穿透卵丘细胞层过程中的作用机制，为进一步阐释受精机理以及医学临床研究奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试验动物

野生型 (WT) ICR系小鼠 (雄性：3~5月龄；雌性：8~10周龄) 购自日本SLC公司；Spam1 KO小鼠自制于筑波大学T.Baba教授实验室。小鼠的饲养管理和使用，严格按照筑波大学实验动物管理委员会的管理条例执行。

1.1.2 试剂及仪器

所有化学药品除特别说明外均购自Sigma公司。抗-SPAM1^[18]、抗-HYAL5^[19]、抗-PRSS21^[24]、抗-ADAM3^[7]多克隆抗体由T. Baba教授实验室自制；抗-IZUMO1^[25]单克隆抗体由大阪大学M. Okabe教授惠赠；HRP标记的羊抗兔IgG、HRP标记的羊抗大鼠IgG、Alexa Fluor 488标记的羊抗大鼠IgG购自CST公司。Bio Rad蛋白免疫印迹及成像系统；Hamilton Thorne计算机辅助精液分析 (CASA) 系统；Olympus IX71倒置荧光显微镜。

1.2 试验方法 1.2.1 引物设计与小鼠基因型鉴定

根据Spam1基因序列，针对WT和KO小鼠的基因型分别设计2对引物:Spam1：5′-GGTATTCAGAGGTACGATCAG-3′和5′-TTGAAGTCCAATCGACCAGCT-3′(扩增片段大小145 bp)；Spam1 mutation：5′-TCGTGCTTTACGGTATCGCCGGCTCCCG-3′和5′-TTGAAGTCCAATCGACCAGCT-3′(扩增片段大小254 bp)，用于筛选子代基因敲除小鼠。剪取小鼠尾尖，添加500 μL鼠尾组织裂解液，55 ℃恒温过夜，苯酚/氯仿法抽提小鼠尾部DNA，进行PCR扩增反应。PCR反应程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 60 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 1 min。

1.2.2 精子蛋白Western blot检测与酶活性分析

将雄性小鼠的新鲜附睾尾部精子回收, 置于磷酸盐缓冲液 (PBS) 中，2 000 r·min^-1离心10 min, 弃上清液，用PBS重悬后，重复离心洗涤3次。沉淀物用裂解缓冲液 (20 mmol·L^-1 Tris/HCl，1% Triton X-100，0.15 mol·L^-1 NaCl，pH 7.4) 重悬洗涤1次，然后加入200 μL含有1%蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液，冰上裂解6 h。裂解后的精子上清液于12 000 r·min^-1离心10 min, 回收备用。参照C.Zhou等^[23]的方法，对目的蛋白SPAM1、HYAL5、PRSS21、ADAM3和IZUMO1进行Western blot检测；参照W.J.Kang等^[26]的方法，对精子蛋白分解透明质酸的酶活性进行分析。

1.2.3 精子运动性分析

附睾尾部精子回收于200 μL TYH液滴中分散培养5 min，吸取液滴上方的精子添加到含有4 mg·mL^-1 BSA的TYH液滴中，37 ℃、5% CO₂和100%湿度培养箱中获能培养2 h。获能后的精子采用计算机辅助精液分析 (CASA) 系统进行检测，CASA主要参数：总运动活力 (TM)、前向运动 (PM)、急速运动 (RM)、平均速度 (APV)、侧摆幅度 (ALHD)、超活化运动 (HA)。各项参数检测设定值参照C.Zhou等^[23]方法。

1.2.4 体外受精 (IVF)

将雌鼠腹腔注射PMSG (日本ASKA制药公司，东京) 和hCG (日本ASKA制药公司) 各5 IU，2次注射间隔48 h。hCG注射后14 h，于输卵管壶腹部收集含有M II期卵母细胞的OCC，并移至含有BSA的TYH液滴中。获能后的精子添加到TYH液滴中 (终浓度为1.5×10²·μL^-1)，使其与卵母细胞受精。分别观察IVF 2和6 h卵丘细胞分散状况，并统计受精率。

1.2.5 精子/卵丘细胞穿透分析

为了标记精子核，小鼠附睾尾部精子在含有Hoechst 33342(2.5 μg·mL^-1) 的TYH液滴中分散培养10 min，然后在含有4 mg·mL^-1 BSA的TYH液滴中37 ℃、5% CO₂和100%湿度培养箱中获能培养2 h。获能后的精子添加到TYH液滴中 (终浓度为1.5 × 10²·μL^-1)，与OCC相互作用30 min。互作后，带有精子的OCC用4%多聚甲醛 (PFA) 固定15 min，然后用含有0.5%聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) 的PBS洗涤2次。加入1:100稀释的抗-IZUMO1单克隆抗体，4 ℃作用2 h。用0.5% PVP的PBS洗涤3次，加入1:200稀释的Alexa Fluor 488标记的羊抗大鼠IgG，4 ℃作用1 h。用0.5% PVP的PBS洗涤3次，装载到载玻片，倒置荧光显微镜下观察。

1.2.6 数据分析

用Student’s t-检验进行统计分析试验数据。当P＜0.05表示差异显著；当P＜0.01表示差异极显著。

2 结果 2.1 Spam1 KO小鼠基因型鉴定与精子运动性分析

对子代小鼠尾部DNA进行PCR扩增检测Spam1基因型，选择仅有KO条带的小鼠作为试验组，选择仅有WT条带的小鼠作为对照组。Western blot的结果表明，经鉴定获得的KO小鼠精子中未检测到SPAM1蛋白存在，而HYAL5、PRSS21、ADAM3和IZUMO1 4种蛋白质则正常表达。KO小鼠由于缺失SPAM1而引起精子蛋白分解透明质酸的酶活性极显著变化 (P＜0.01)，仅降为WT的50.3%(图 1)。CASA分析结果表明，小鼠获能精子的各项运动参数在KO和WT之间差异不显著 (P＞0.05)(表 1)。

2.2 SPAM1对精子穿透卵丘细胞层的影响

精子/卵丘细胞穿透试验结果表明，与WT相比，KO小鼠精子缺失透明质酸酶SPAM1后，导致精子穿透卵丘细胞层的能力极显著降低 (P＜0.01)，到达卵子透明带 (ZP) 的精子数量显著减少，而大部分精子极易黏附于OCC表面或外部边缘 (P＜0.01)，且极显著地影响卵丘细胞层基质中精子顶体反应的发生比率 (P＜0.01)(图 2)。

2.3 SPAM1对IVF过程中卵丘细胞分散和受精率的影响

小鼠精子在IVF过程中对卵丘细胞分散的状况，如图 3所示。与WT相比，KO小鼠精子对卵丘细胞分散能力显著降低。IVF 2 h时，可观察到卵丘细胞仍附着于卵母细胞，几乎未被分散；IVF时间延长至6 h，卵丘细胞虽被分散并脱离卵母细胞，但仍可观察到尚未完全分散的卵丘细胞团块。受精卵去除精子并继续培养至6 h，观察雌雄原核 (箭头) 并统计受精率。结果显示，KO小鼠精子的体外受精率呈现显著延迟 (表 2)。IVF 2 h，KO小鼠精子的体外受精率显著低于WT (P＜0.05)；随着IVF时间延长至6 h，两者之间没有显著差异 (P＞0.05)。

3 讨论

透明质酸酶于1929年由D.Reynals首次发现并命名为扩散因子^[27]，随后被鉴定并更名为透明质酸酶，其功能主要是水解透明质酸，在受精等诸多生命活动中都发挥重要作用。大量的研究资料表明，受精时获能精子释放透明质酸酶，分解OCC中蓄积的大量透明质酸并穿透卵丘细胞层到达卵子透明带^{[1, 4-5]}。然而利用基因敲除小鼠精子分析表明，无论是SPAM1还是HYAL5均非受精所必需^[18-19]。小鼠精子缺失SPAM1，会导致精子穿透和分散卵丘细胞能力下降、受精延迟，并有大量精子蓄积在卵丘细胞层表面或外部边缘^{[18-19, 23]}，但原因不明。因此，进一步探索精子缺失SPAM1为何会对精/卵互作造成影响，并探讨其可能的作用机制显得十分必要。

本研究使用Ph-20/Spam1基因敲除杂合子 (Spam1^+/-) 小鼠用于群系维持^[23]，所以产生的子代小鼠可能出现Spam1^+/+(WT)、Spam1^+/-、Spam1^-/-(KO)3种表型。通过PCR反应和Western blot方法分别对小鼠尾部基因组DNA和精子蛋白进行了鉴定，筛选获得的Spam1 KO小鼠精子中不存在SPAM1蛋白。而Spam1 KO小鼠在精子形态、数量、大小^[19]以及获能后精子运动性^[23]等方面与WT没有显著差异，这一结果在本研究中也得到了印证。此外，Spam1 KO小鼠精子的透明质酸分解活性显著降低，并造成IVF时精子分散卵丘细胞能力下降，说明精子的透明质酸酶活性和卵丘细胞分散密切相关。这与S.Yoon等^[22]和W.J.Kang等^[26]的研究结果相似。成熟卵母细胞是以OCC的形式被排出。卵丘细胞层是受精时精子要穿越的第一道屏障。卵丘细胞能够参与精-卵之间的相互识别、引导和控制精子趋向卵母细胞、维持精子运动活力、诱导精子获能以及提高精子穿卵能力^{[1, 28-30]}。Spam1 KO小鼠精子在IVF时表现为穿透卵丘细胞层能力下降、受精延迟。本研究还发现Spam1 KO小鼠精子缺失Spam1后，导致精子极易黏附于OCC表面或外部边缘。小鼠精子透明质酸酶SPAM1在精子侵入和穿透卵丘细胞层时，可能具有某种非常重要但又非必需的功能。笔者前期的研究结果表明，利用透明质酸酶抑制剂Apigenin完全抑制精子的透明质酸分解活性，精子仍能正常侵入和穿透卵丘细胞层并完成受精^[26]。综上表明，由于小鼠精子缺失SPAM1，而非缺失透明质酸酶活性造成的。因此，SPAM1在精子穿卵过程中除了具有分解透明质酸的酶活性外，可能还存在信号转导等其它的非酶活性功能。

受精时卵丘细胞及其细胞外基质也能诱导精子发生顶体反应^[31]。已经发生顶体反应的精子仍然能够二次穿透ZP与卵母细胞完成受精^[32]。体外受精时，某些物种在去除卵丘细胞条件下会导致受精率显著下降^[1]。利用Cd46 KO小鼠研究证明，精子发生自发性顶体反应的比率与受精能力呈正相关^[33]。本研究发现，相比于WT小鼠，Spam1 KO小鼠精子在TYH培养液中的获能及随后自发性顶体反应呈现显著延迟 (数据未发表)。穿卵30 min后，卵丘细胞层基质中的Spam1 KO小鼠精子发生顶体反应的比率显著低于WT。这些因素可能是导致Spam1 KO小鼠体外受精延迟的原因，揭示精子获能及随后发生顶体反应比率和受精能力密切相关。

4 结论

Spam1 KO小鼠精子缺失透明质酸酶SPAM1后，OCC中精子发生顶体反应的比率显著降低，导致KO精子穿透卵丘细胞层能力下降、受精延迟，大部分精子极易黏附于OCC表面或外部边缘。揭示SPAM1在穿卵过程中除了具有分解透明质酸的作用外，还存在其它的非酶活性功能。