随着鸡人工授精技术的广泛应用，在生产中对鸡精液的要求也越来越高。与猪和牛等畜种相比，鸡射精量少，约0.2~0.7 mL，密度高，可达 (3~7)×109个·mL-1[1]。研究表明，在保证精子密度的前提下，对鸡精液进行适当的稀释，一方面可以增加精液量，提高人工授精的配种母鸡数，另一方面可以冲淡精液中有害物质，防止细菌滋生[2]。因此在人工授精前对精液进行适当处理可以提高种公鸡种用效率，降低种鸡的饲养成本，能保证母鸡群健康，经济效益显著[3-4]。此外，在生产或者科学研究中，有时会需要异地输精，对精子的短期保存提出了一定的要求。研究表明，鸡精液采集后如果不进行任何处理，30 min内不输精，精子会发生凝结、死亡，导致受精率下降[5]。
鸡精液保存的方法有3种：常温保存 (15~25 ℃)、低温保存 (0~5 ℃) 和冷冻保存 (-196~-79 ℃)。常温保存时，精液不经处理或经过生理盐水稀释，在30 min内完成输精是最适宜的[6]，且受精率差异不显著[7]。冷冻保存可以较长时间保存精液，但是鸡精液冷冻保存技术目前还不成熟[6]。国外研究鸡精液经过冷冻保存后受精率可以达到70%[8]，国内冷冻复融的精子活力也可以达到8.5，但是受精率很低[9]。冷冻保存对鸡精液的伤害是不可逆的，与鲜精相比冷冻精液的受精率显著下降。经过稀释的精液低温保存后，精液品质要优于未稀释的精液[10]，景栋林[11]和许月英[12]的研究表明，经过稀释的鸭和鹅精液在2~5 ℃时保存效果最好。而鸡精液4 ℃保存24 h后，受精率可以达到50%[13-14]。现在也有通过向低温保存的精液中添加卵磷脂、番茄红素等来提高精子活力和受精能力[15-16]。低温保存的温度处于常温和冷冻保存之间，抑制精子的代谢活动，延长精子受精能力的维持时间，有利于精液的短期保存和运输[17]。精浆中存在影响受精率的小颗粒物质，在低温保存中会降低精子运动能力，从而影响受精率，因此需要对原精进行适当处理。本试验通过比较不同稀释和处理方式对精液品质和受精能力的影响，探索鸡人工授精精液的预处理方案，为提高鸡受精率提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物选用中国农业科学院北京畜牧兽医研究所昌平实验基地，31周龄体重接近的健康北京油鸡，包括30只公鸡 (体重为2.25±0.23 kg) 和160只母鸡 (产蛋率为75%左右)。
1.2 稀释液配制选用BPSE (Blesville Poultry Semen Extender) 为鸡精液稀释液，主要成分包括六水氯化镁0.34 g·L-1、乙酸钠2.59 g·L-1、柠檬酸钾6.06 g·L-1、谷氨酸钠8.67 g·L-1、磷酸氢二钾9.69 g·L-1、磷酸二氢钾0.65 g·L-1和D-果糖0.50 g·L-1[18]。
1.3 精液采集和处理采用背腹式按摩采精法[19]，采集30只公鸡精液于同一离心管中，缓慢混合均匀。将混合精液等量分为4个组，A组精液不处理作为对照，B组用BPSE稀释液按照1:1比例稀释，C组精液离心 (2 000 r·min-1，10 min) 后去除上层精浆，加入与精浆等体积的BPSE稀释液重新混匀，D组在C组处理的基础上，再用BPSE稀释液按照1:1比例稀释。每组精液分为两份，一份用于直接输精和精液品质测定，另一份在4 ℃保存24 h，期间每隔8 h检测一次精液品质，24 h后进行输精 (定义为组A’、B’、C’和D’)，每组收集种蛋120枚左右，统计受精率和孵化率等指标。
1.4 精液品质评价精液品质评价的指标包括精子活力、精子活率和精子形态，精子形态分为形态正常、头部肿胀、颈部弯曲和尾部断裂[20]。每组均采用3份精液样本测定作为3次生物学重复，每份样本每个指标测定重复3次。
1.4.1 精子活力精液与37 ℃生理盐水按照1:100的体积比例混匀后滴于预热的细胞计数板上，盖上盖玻片，在400倍显微镜下，观察300个左右精子的运动轨迹。精子活力以10分制表示，例如所有的精子都进行前进运动的情况设定为10分，80%的精子进行直线运动时定为8分[21]。
1.4.2 精子活率将5%伊红与1%苯胺黑溶液按照1:4体积比例制备染色混合液，取3 μL精液加入装有100 μL混合染色液的离心管中，混合均匀，取10 μL精液-染色液混合液制备精液涂片，混合液将均匀地附着在载玻片上，自然风干，在400倍光学显微镜视野下，观察300个精子，计数300个精子中活精子个数，结果用百分率表示[22]。
1.4.3 精子形态用生理盐水将精液稀释50倍，混合均匀，取20 μL于载玻片上，无水乙醇固定2 min，5%的龙胆紫溶液混匀染色2 min，去离子水冲片，脱掉片膜上的浮色，干燥，在400倍光学显微镜视野下，观察300个精子，计数形态正常、头部肿胀、颈部弯曲和尾部断裂精子数，并计算各占总精子数的百分比[22-23]。
1.5 输精与受精率和孵化指标检测将稀释和处理后的4组精液 (组A、B、C和D) 和4 ℃保存24 h的4组精液 (组A’、B’、C’和D’) 分别人工输精20只母鸡。第1次连续输精两天，以后每隔3 d输精1次，输精后第3天开始收集种蛋并按处理组入孵，入孵第10天照蛋检测受精率，继续孵化至出雏，统计入孵蛋孵化率和受精蛋孵化率。
1.6 数据分析数据经过Excel预处理后，采用SAS 8.0统计软件对精子活力等精液品质指标进行方差分析，结果以“平均值±标准差”表示；对受精率和孵化率进行卡方检验；P＜0.05表示差异显著, P＜0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 不同稀释处理和低温保存对精子活力的影响不同稀释处理和低温保存对精子活力的影响如表 1所示。未经低温保存的精液，与A组对照相比 (即采精后未稀释，直接输精)，B组 (原精用BPSE稀释一倍) 没有显著差异，然而C组 (用等量的BPSE稀释液代替精浆) 和D组 (在C组的基础上再用BPSE稀释一倍) 极显著低于A组 (P＜0.000 1)。随着各组精液在4 ℃保存时间的延长，精子活力也极显著下降 (P＜0.000 1)。
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表 1 鸡精液不同稀释处理组在低温保存不同时间后精子活力差异 Table 1 Sperm motility of semen at 0, 8, 16 and 24 hours post dilution with different methods |
不同稀释处理和低温保存对精子活率的影响如表 2所示。稀释处理未经低温保存时，各组精子活率与鲜精无显著差异 (P>0.05)。
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表 2 鸡精液不同稀释处理组在低温保存不同时间后精子活率差异 Table 2 Sperm vitality of semen at 0, 8, 16 and 24 hours post dilution with different methods |
随着4 ℃保存时间的延长，除未经任何稀释处理的A组对照在24 h后的活率极显著降低 (P＜0.01)，各组精子活率无显著变化 (P>0.05)。且24 h后，A组和B组的精子活率显著低于C组和D组 (P＜0.05)。
2.3 不同稀释处理和低温保存对精子形态的影响鸡精子的形态随着保存时间的增加而改变。由表 3可见，随着保存时间的增加，4组形态正常的精子比例总体上呈现降低趋势。头部肿胀、颈部弯曲和尾部断裂等其他问题的精子比例基本随着保存时间的增加而增加。在不同时间点，C和D组的正常形态精子的比例显著低于A和B组 (P＜0.05)。C和D组头部肿胀的精子比例在8 h时显著高于A组 (P＜0.05)，在其他时间点4组差异不显著。低温保存前 (0 h)，A组颈部弯曲精子比例显著高于其他3组 (P＜0.05)，随着低温保存时间的增加，C和D组显著增加且高于A组 (P＜0.05)。4组精子随着保存时间的增加，尾部断裂精子比例都显著增加 (P＜0.05)，且C和D组的精子尾部断裂的精子比例基本都显著高于A和B组 (P＜0.05)。
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表 3 鸡精液稀释和低温保存对精子形态的影响 Table 3 The effect of dilution and hypothermic preservation on sperm morphology |
如表 4所示，精液经过稀释处理后直接输精时 (0 h)，B和C组的受精率、入孵蛋的孵化率和受精蛋的孵化率与对照A组无显著差异，但是D组的3个指标均极显著低于A组 (P＜0.000 1)。精液经过24 h的低温保存，A、B和C组的受精率和入孵蛋的孵化率都极显著降低 (P＜0.01)，D组的受精率和入孵蛋的孵化率与低温保存前无显著差异 (P>0.05)。低温保存24 h后，B、C和D组的受精率极显著高于A组对照 (P＜0.000 1)。
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表 4 鸡精液稀释和低温保存24 h前后受精率和孵化率 Table 4 Fertility and hatching performance of semen of before and after 24 h storage at 4 ℃ with different methods |
随着低温保存时间的增加，精子形态发生改变[24-25]，A. Siudzin′ska等[20]和V. Douard等[26]研究表明，利用精液稀释液，低温保存鸡精液和火鸡精液24 h，精子畸形率都显著增加 (P＜0.05)。随着低温保存时间的增加和温度的降低，畸形率会显著增加[27]，精液品质下降会影响受精率[28]。本研究中精子畸形主要表现为头部肿胀、颈部弯曲以及尾部断裂等，精子畸形率的升高导致精液品质的下降。C和D组的精子畸形率总体上较A和B组高，可能是由于在精液稀释处理时，C和D组精液样本在进行离心和重新悬浮操作时对精子造成一定的机械损伤，导致精子畸形率增加。
鸡精液精子密度高，可达 (3~7)×109个·mL-1[1]。但是精子密度过大也会引起精液保存过程中精子代谢产物的大量积累和精子凝集，对精子本身产生毒害作用，使精子丧失活力和受精能力[29]。因此精子活力随着精液保存时间的延长而下降，但是适当的稀释处理可以降低精子活力下降的幅度[14]。E. Blesbois等[29]研究表明, 精浆中存在的小颗粒物质，会降低精子的运动，影响受精能力，因此可以考虑在低温保存之前去除精浆。胡艳娟等[14]、张守全等[16]和J. Mohan等[30]研究均表明鸡精液低温保存24 h后，精液仅经稀释保存24 h后受精率在50%左右。在本研究中，不进行低温保存直接输精时，与进行稀释了的B、C和D组相比，未经稀释的A组的精子活力和受精率都较高。但是在低温保存了24 h后，A组的精子活率显著降低，A、B、C和D组的精子活力分别下降了66%、65%、41%和37%，A、B和C组的受精率分别下降了56%、32%和30%，D组无显著变化。唐光昕[31]研究表明，正常人的精子在体外离心处理过程中会产生过量活性氧导致精子过氧化损伤。在本研究中对D组精液进行了离心处理，精子受到一定的刺激，可能会影响受精蛋的孵化；而低温保存过程中可能精液中本身存在的抗氧化物质会一定程度上清除由于瞬时离心所产生的活性氧，反而降低了精子损伤。这可能是D组受精蛋的孵化率在低温保存24 h后显著高于0 h保存的原因。此外，种蛋的蛋重、蛋壳强度以及蛋黄品质可能也有一定的影响[32]。C组和D组的处理过程都包含去除精浆步骤，D组进一步稀释精液，精子活力下降幅度最小。
随着低温保存时间的增加，C和D组精子的畸形率显著高于A和B组 (P＜0.05)，精子的活力和活率也显著高于A和B组 (P＜0.05)。当精子活率和畸形率在一定范围内，精子活力可能是影响受精率的主要因素，在本研究中，C和D组的精子畸形率显著高于A和B组，但是仍在正常范围内，并不足以显著降低受精率。因此精子活力在本试验中是影响受精率的主要因素。
4 结论本研究的结果表明，应根据鸡人工输精的实际需要选择恰当的精液稀释处理方法。在采精后即刻输精时，可以用BPSE进行1:1稀释，增加精液量，在不影响受精率的同时提高优秀种公鸡的配种能力。当需要异地输精，精液需要短期保存时，建议去除精浆并以BPSE进一步稀释，提高低温保存精液的受精率。
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