2. 石河子大学动物科技学院, 石河子 832003
, HU Guang-dong2, WANG Hong-hong1, JIA Mi-la2, XU Jin-feng1, CHEN Chuang-fu2
, SAI Wu-jia-fu2
2. College of Animal Science and Technology, Shihezi University, Shihezi 832003, China
哺乳动物精子受精前在雌性生殖道内需进一步成熟，当形态和生理发生特定的变化时，才能具备受精能力，这个过程称之为获能[1-3]。精子及时获能和产生顶体反应在自然受精过程中很重要，同样维持精子在受精前未获能状态也非常关键[4]。研究表明，精子经过附睾成熟后，其表面被覆有对获能有抑制作用的去能因子[5](Decapacitation factor，DF)，已经被鉴定的包括DF糖蛋白、磷脂酰乙醇胺结合蛋白[6]、质膜脂肪酸结合蛋白以及内源性的NYD-SP27[7]，这些去能因子对受精的顺利进行至关重要。
NYD-SP27基因是南京医科大学运用人睾丸cDNA表达芯片，经高通量差异杂交筛选所获得的新基因，它属于PLCζ家族的成员[8-9]。NYD-SP27作为一种生理性的磷脂酶C (Phospholipase C, PLC) 的抑制剂，能够抑制精子过早获能和自发性的顶体反应。在精子的获能和顶体反应过程中PLC扮演着重要的角色[10]，当PLC被激活时引起细胞膜上一系列反应最终导致精子膜溶解和顶体反应的发生[11-12]。因此，抑制PLC的活性和PLC偶联的信号通路就能阻止精子获能和顶体反应的提前发生。近期研究发现丝氨酸蛋白酶也有抑制顶体反应发生的功能[13-15]。在囊性纤维病中，NYD-SP27基因在胰腺组织中高表达，它通过抑制PLC的活性从而使胰腺分泌功能降低[16]。
目前国内外对于内源性去能因子鲜有发现，NYD-SP27基因作为内源性去能因子值得深入研究，这有助于人们深入了解精子获能的相关机制。有研究对小鼠的该基因进行原核表达并以此来制作抗体，对该蛋白在精子中的表达进行定位，发现该基因从未获能, 在获能产生顶体反应的过程中逐渐丢失[4]，但是针对该基因的真核表达却未见报道。本研究拟构建由P2A连接的绵羊NYD-SP27、红色荧光多顺反子的真核表达载体。2A肽，称为“顺式作用元件水解酶”，含有18~22个氨基酸[17]，能够有效介导核糖体跳跃，通过自我切割实现上下游两个蛋白单独翻译[17]。因此，本研究旨在通过真核表达和2A肽的切割作用，获得活性更好的蛋白，通过转染和筛选获得稳定的细胞系，实现NYD-SP27基因在细胞中的稳定表达，可以更好地了解该蛋白的表达特征，为进一步深入研究该蛋白的功能奠定基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 菌株、细胞、载体及动物组织DH5α感受态细胞由新疆生产建设兵团动物重大疫病防控重点实验室保存，BHK-21细胞 (乳仓鼠肾细胞) 由石河子大学人畜共患病实验室保存，pDsRed1-C1载体由西北农林科技大学农业部动物生物技术重点实验室惠赠，绵羊睾丸组织由石河子大学动物科技学院动物实验站提供。
1.1.2 主要试剂Transzol up RNA提取试剂盒、TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase购自北京全式金公司，PrimeScriptTM RT reagent Kit购自TaKaRa，无内毒素质粒大提试剂盒购自北京天根生化公司；Lipofectamine®2000 Transfection Reagent转染试剂购自Invitrogen公司，DMEM basic、G418和胎牛血清 (FBS) 均购自Gibco，Monoclonal Anti-FLAG M2抗体购自Sigma，β-actin (1I102) 抗体购自Bioworld。
1.2 试验方法 1.2.1 绵羊睾丸组织总RNA提取将采集的绵羊睾丸组织剪成小块分装在2 mL冻存管中，保存于液氮中待用，将组织块从液氮中取出，在研钵中充分研磨后，按照Transzol up RNA提取试剂盒说明书提取组织中总RNA，并检测RNA的浓度。
1.2.2 绵羊NYD-SP27基因的克隆将提取的绵羊睾丸组织中的总RNA，按照PrimeScriptTM RT reagent Kit说明书反转录为cDNA，根据GenBank中人NYD-SP27序列 (登录号：AY035866.1) 利用Primer5.0软件设计引物 (表 1)，扩增该基因完整的ORF区。使用TransStart FastPfu Fly高保真酶扩增目的基因，扩增体系：cDNA 2 μL，上、下游引物各2 μL，dNTP 5 μL，Mg2+ 2 μL，FastPfu 1 μL，Buffer 10 μL，ddH2O 26 μL，反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s；61 ℃ 40 s；72 ℃ 2 min；30个循环；72 ℃ 8 min。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增出来的目的条带，之后用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，将回收产物加上polyA尾巴，连接pMD19-T载体测序，经过分析比对，得到绵羊NYD-SP27的基因序列 (登录号：KX905090)。
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表 1 引物信息 Table 1 Primers information |
通过设计引物将P2A和Flag标签加入到目的基因上 (表 1)，扩增得到P2A-Flag-NYDSP基因，以连接T载体后测序正确的菌液为模板，扩增P2A-Flag-NYDSP基因，反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s；68 ℃ 40 s；72 ℃ 2 min；30个循环；72 ℃ 8 min。连接pMD19-T载体后，送生工生物工程 (上海) 股份有限公司测序。
1.2.3 绵羊NYD-SP27真核表达载体的构建及鉴定提取1.2.3中测序正确的重组质粒，用限制性内切酶Bgl Ⅱ和Sal Ⅰ分别对pDsRed1-C1和P2A-Flag-NYDSP-T进行双酶切，将目的条带用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，用T4连接酶连接回收产物，16 ℃连接过夜，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，Kan抗生素筛选阳性重组子后对其进行菌液PCR和双酶切鉴定，将经过鉴定的样本测序验证。
1.2.4 重组质粒的转染BHK-21细胞将1.2.3中鉴定正确的重组质粒pDsRed-P2A-Flag-NYDSP按照无内毒素质粒大提试剂盒说明书提取质粒，然后测定浓度备用。转染前将BHK-21细胞 (3×105个·孔-1) 接种12孔板，置于细胞培养箱中培养，待细胞汇合度达到90%时，按照Lipofectamine® 2000 Transfection Reagent转染试剂说明书进行转染，24 h后用荧光显微镜观察细胞红色荧光蛋白表达情况，48 h后在培养基中添加G418进行阳性克隆细胞筛选。
1.2.5 稳定转染细胞阳性克隆的筛选在筛选阳性克隆前，应先确定最佳筛选浓度。具体方法：将BHK-21细胞接种于24孔板待细胞汇合度达到60%时加入不同量的G418溶液，使培养液终浓度为100~1 000 μg·mL-1，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，根据细胞状态3~4 d换1次培养液，共培养10 d，将能够全部杀死细胞的浓度作为筛选浓度。转染24 h后，荧光显微镜观察转染效果，转染48 h后，将培养基更换为含有最佳筛选浓度的G418筛选培养基，持续筛选7~10 d后，开始出现抗性细胞集落，将每孔中的抗性细胞按照有限稀释法在96孔板中进行单克隆细胞筛选，将单克隆细胞以逐步通过48孔板、24孔板、12孔板、6孔板和10 cm细胞培养板进行扩大培养。
1.2.6 RT-PCR鉴定单克隆细胞提取扩大培养至6孔板中的单克隆细胞总RNA，用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板，以P2A-Flag-NYDSP的特异性引物进行PCR扩增，用1%琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。
1.2.7 间接免疫荧光 (Indirect immunofluorescence assay，IFA) 鉴定稳定细胞系将1.2.6中鉴定出来的阳性细胞培养15代，通过RT-PCR鉴定无误，将细胞传至6孔板中，待细胞汇合度达到30%~50%时，弃掉培养液，PBS冲洗3次，用4%的多聚甲醛固定细胞1 h，PBS清洗两次，用含1% BSA和0.1% Triton X-100的PBS室温处理细胞1 h，PBS清洗3次，用含0.05% Triton X-100和0.5% BSA的PBS稀释Monoclonal ANTI-FLAG M2一抗4 ℃过夜孵育，PBS清洗3次，用含1% BSA和0.1% Triton X-100的PBS稀释绿色荧光标记的二抗，室温避光孵育1 h，PBS清洗3次后，荧光显微镜下观察结果。
1.2.8 Western blot鉴定稳定细胞系将1.2.7中所用细胞用RIPA裂解，然后用超声破碎仪超声破碎15 min，4 ℃，13 000 r·min-1离心5 min，上清经SDS-PAGE分离后，半干法转膜至PVDF膜上，5%的脱脂奶粉37 ℃封闭1 h，TBST清洗3次，加入一抗Monoclonal Anti-FLAG M2(1:1 000)4 ℃过夜孵育，TBST清洗3次，之后加入二抗山羊抗鼠IgG (1:5 000)37 ℃孵育1 h，TBST清洗后进行化学显色。
2 结果 2.1 绵羊NYD-SP27基因的克隆以提取的绵羊睾丸组织中的总RNA反转录的cDNA为模板，以特异性引物NYD-F和NYD-R扩增目的基因，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，出现特异性条带 (图 1)，经测序分析，确认该基因大小为1 617 bp。
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M. DL2000;1. NYD-SP27 图 1 绵羊NYD-SP27基因的PCR扩增 Figure 1 PCR amplification of ovine NYD-SP27 gene |
在目的片段中引入P2A和Flag标签序列后，连接到表达载体上，获得重组质粒pDsRed-P2A-Flag-NYDSP (图 2A)。用限制性内切酶BglⅡ和Sal Ⅰ对重组质粒进行双酶切，然后通过1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定 (图 2B)，将鉴定正确的进行测序，结果表明，目的片段成功插入pDsRed1-C1载体中，开放阅读框测序正确，重组质粒pDsRed-P2A-Flag-NYDSP构建成功。
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M. DNA相对分子质量标准；1. pDsRed-P2A-Flag-NYDSP质粒Bgl Ⅱ和Sal Ⅰ双酶切；2. Bgl Ⅱ单酶切；3. Sal Ⅰ单酶切 M. DL10000 DNA marker; 1. pDsRed-P2A-Flag-NYDSP digested with Bgl Ⅱ and Sal Ⅰ; 2. Recombinant plasmid digested with Bgl Ⅱ; 3. Recombinant plasmid digested with Sal Ⅰ 图 2 重组质粒pDsRed-P2A-Flag-NYDSP示意图 (A) 和酶切鉴定 (B) Figure 2 Sketch of recombinant plasmid pDsRed-P2A-Flag-NYDSP (A) and restriction enzyme cleave identification (B) |
转染前经过梯度筛查，最终确定G418最佳筛选浓度为400 μg·mL-1，维持浓度为200 μg·mL-1。用Lipofectamine® 2000转染将重组质粒pDsRed-P2A-Flag-NYDSP转入BHK-21细胞，24 h后通过荧光显微镜观察到红色荧光 (图 3A，B)，表明NYD-SP27基因在BHK-21细胞成功表达。对转染的细胞用G418筛选，7~10 d后出现单克隆 (图 3C)。
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A. pDsRed-P2A-Flag-NYDSP转染BHK-21细胞 (荧光)；B. pDsRed-P2A-Flag-NYDSP转染BHK-21细胞 (明场)；C.转染细胞经过G418筛选7 d后 A. pDsRed-P2A-Flag-NYDSP was transfected into BHK-21 cell in fluorescent; B. pDsRed-P2A-Flag-NYDSP was transfected into BHK-21 cell in bright filed; C. Transfected cell by G418 selection after 7 d 图 3 重组质粒转染BHK-21细胞及G418筛选后的细胞10× Figure 3 Recombinant plasmid pDsRed-P2A-Flag-NYDSP was transfected into BHK-21 cell and transfected cell under G418 selection 10× |
将筛选的6株抗性细胞提取RNA，RT-PCR进行扩增鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果显示特异性条带 (图 4)，证实阳性细胞株中存在目的基因。
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M. DNA相对分子质量标准；1~6. 6株筛选后的细胞RT-PCR扩增产物；7.阳性对照；NC.BHK-21细胞 M. DL2000 DNA marker; 1-6. 6 cell lines after G418 selection by RT-PCR amplification; 7. Positive control; NC. BHK-21 cell 图 4 RT-PCR鉴定稳定细胞系 Figure 4 Identification of stable cell lines by RT-PCR |
将培养15代后的单克隆细胞和正常的BHK-21细胞铺于6孔板，按照1.2.7中的方法进行操作，用荧光显微镜分别在明场和荧光条件下观测，结果显示，在细胞中可见绿色荧光 (图 5)，证明该蛋白可在细胞中表达。
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A.转染pDsRed1-C1-P2A-Flag-NYDSP的BHK-21稳定细胞系 (明场)；B.转染pDsRed1-C1-P2A-Flag-NYDSP的BHK-21稳定细胞系 (荧光)；C.正常BHK-21细胞 (明场)；D.正常BHK-21细胞 (荧光) A. BHK-21 stable cell line with pDsRed1-C1-P2A-Flag-NYDSP in bright filed; B. BHK-21 stable cell line with pDsRed1-C1-P2A-Flag-NYDSP in fluorescence; C. Normal BHK-21 cell in bright filed; D. Normal BHK-21 cell in fluorescence 图 5 免疫荧光鉴定稳定细胞系10× Figure 5 Identification of stable cell line by IFA 10× |
将培养15代后的单克隆细胞和正常的BHK-21细胞裂解、超声处理后，经SDS-PAGE电泳，转膜，抗体孵育，显色，结果显示，稳定表达Flag-NYD-SP27蛋白在63 ku处有特异性的条带，提示P2A高效的切割作用，NYD-SP27与红色荧光蛋白完全剪切，对照组细胞未观察到相关条带 (图 6)。
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1.稳定表达绵羊NYD-SP27蛋白的BHK-21细胞系；2.转染空载体的BHK-21细胞；3. BHK-21细胞 1. Establishment of BHK-21 cell stably expressing NYD-SP27; 2. The empty vector was transfected into BHK-21 cell; 3. BHK-21 cell 图 6 Western blot鉴定NYD-SP27融合蛋白在稳定细胞系的表达 Figure 6 Identification of NYD-SP27 protein expression in stable cell line by Western blot |
NYD-SP27属于PLCζ家族，人们对绵羊PLCζ的相关功能已有了解，它能够引起卵母细胞内Ca2+震荡，从而激活卵母细胞[18-20]。根据以往的研究发现，人和小鼠的NYD-SP27基因与PLCζ相比缺少N端的EF手型结构域[4]，同样笔者对绵羊的这两个序列的保守结构域分析后也发现存在这种现象，EF手型结构域是Ca2+结合位点，缺少后会造成结合Ca2+能力下降[8, 21]，这可能造成了其与PLC ζ功能的不同所在，也可能是它抑制PLC的原因。该蛋白最终定位为膜上蛋白，可能是在授精过程感受精子内外环境进行信号传导，保证受精的顺利完成。
本研究构建的真核表达载体中，加入了flag标签蛋白和P2A序列，在目的蛋白的N端加入Flag标签，它的短小对目的蛋白影响小，同时针对该基因没有合适的抗体，可用Anti-Flag单克隆抗体检测目的蛋白的表达[22]。鉴于该载体表达红色荧光融合蛋白，为不影响目的蛋白的功能，笔者在红色荧光蛋白和目的蛋白之间添加P2A序列，据相关研究表明P2A具有高效的切割效率[23]，在人、斑马鱼胚胎和小鼠中均得到证明[24]，同时还发现在2A肽的N端加入甘氨酸—丝氨酸—甘氨酸可大大增加切割效率[25-26]，甚至有可能达到100%，在本研究中，IFA和Western blot结果均表明，NYD-SP27蛋白在BHK-21细胞中稳定表达，在63 ku处有唯一的目的条带，该条带与目的蛋白和Flag标签融合蛋白预期大小一致，因为在2A肽N端G-S-G添加3个氨基酸，最终使P2A的切割效率高，这与J.H.Kim等[24]研究结果相符。这将为多顺反子真核表达载体的构建提供参考价值。
真核表达相较于原核表达拥有众多优势，能够使蛋白充分折叠，表达出活性更高的蛋白[27]，真核表达常用的细胞系中含有293T、BHK-21、HeLa等，其中BHK-21细胞为工程细胞系，贴壁牢固，易于培养，适用于真核表达，同时也可以制备单克隆抗体，因此在本研究中选择BHK-21为表达细胞。笔者发现经过筛选后的细胞不表达红色荧光蛋白，但是表达目的蛋白，这可能由于外源基因整合到细胞染色体后，影响了红色荧光的表达。但是仍有众多含有荧光的外源基因整合后依旧不影响荧光蛋白的表达，这可能是由于不同载体的差异引起的，也可能是宿主细胞差异引起的，相关原因有待进一步探究。
哺乳动物受精前后包括许多复杂的机制[28-29]。本研究通过构建绵羊NYD-SP27基因的真核表达载体，转染重组质粒到BHK-21细胞，筛选获得能够稳定表达重组质粒的细胞株，NYD-SP27蛋白可在BHK-21细胞中稳定表达，因此可以运用BHK-21细胞系获得目的蛋白，了解NYD-SP27蛋白的功能特性，体内定位，表达阶段等。也可以将真核表达载体和脂质体混合后通过睾丸注射方式注射到绵羊体内[30]，研究NYD-SP27基因对绵羊精子发生和获能的影响。
4 结论本研究由人内源性去能因子NYD-SP27功能获得启发，扩增得到绵羊NYD-SP27基因，构建了能够稳定表达绵羊NYD-SP27基因的BHK-21细胞株，Western blot和IFA的结果表明，NYD-SP27蛋白大小约为63 ku，且能够在稳定细胞系中表达，通过对NYD-SP27蛋白的表达特性的了解，为进一步研究NYD-SP27基因在绵羊体内对精子发生和获能的分子机制奠定了基础。
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